Methodenartikel

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

DOI:

10.3791/63967

⸱

13. September 2022

 ,  ,  , 
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Identifizierung genetischer Interaktionen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktionen von Genen zu entschlüsseln, indem Einblicke in ihre funktionellen Beziehungen zu anderen Genen und die Organisation biologischer Wege und Prozesse gegeben werden. Obwohl die meisten genetischen Screens ursprünglich in Saccharomyces cerevisiae entwickelt wurden, wurde von Schizosaccharomyces pombe eine ergänzende Plattform für die Durchführung dieser genetischen Screens bereitgestellt. Einer der häufigsten Ansätze zur Identifizierung genetischer Interaktionen ist die Überexpression von Klonen aus einer genomweiten Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlustmutante, gefolgt von der Auswahl von Klonen, die den mutierten Phänotyp unterdrücken.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung dieses auf "Multicopy Suppression" basierenden genetischen Screenings in S. pombe. Dieser Screen hat dazu beigetragen, Multicopy-Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps zu identifizieren, die mit dem Fehlen des Ell1-Transkriptionsverlängerungsfaktors in S. pombe assoziiert sind. Das Screening wurde durch Transformation des Abfrage-ell1-Nullmutantenstamms mit einer S. pombe cDNA-Plasmidbibliothek mit hoher Kopienzahl und Auswahl der Suppressoren auf EMM2-Platten initiiert, die 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO), eine genotoxische stressinduzierende Verbindung, enthielten. Anschließend wurde Plasmid aus zwei in die engere Wahl gezogenen Suppressorkolonien isoliert und durch Restriktionsenzyme verdaut, um die Insert-DNA freizusetzen. Plasmide, die ein DNA-Fragment freisetzen, wurden in den ell1-Deletionsstamm retransformiert, um die Fähigkeit dieser Suppressorplasmidklone zu bestätigen, das Wachstum der ell1-Deletionsmutante in Gegenwart von 4-NQO und anderen genotoxischen Verbindungen wiederherzustellen. Die Plasmide, die eine Rettung des Deletionsphänotyps zeigten, wurden sequenziert, um die Gene zu identifizieren, die für die Unterdrückung des ell1-deletionsassoziierten genotoxischen stresssensitiven Phänotyps verantwortlich sind.

Einleitung

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Netzwerke genetischer Interaktionen liefern funktionelle Informationen über Gene und beschreiben Signalwege und biologische Prozesse, an denen diese Gene in vivo beteiligt sein können. Darüber hinaus können sie auch Einblicke geben, wie verschiedene Gene miteinander interagieren, was zu einem spezifischen Phänotyp 1,2,3 führt. Im Laufe der Jahre wurden eine Vielzahl von genetischen Screens von Forschern entwickelt, um grundlegende biologische Fragen zu beantworten und menschliche Krankheiten zu untersuchen. Screens zur Identifizierung genetischer Interaktionen können auf verschiedene Arten durchgeführt werden. Genetische Interaktionen, die in verschiedenen genetischen Screens identifiziert wurden, können unterschiedliche mechanistische Beziehungen zwischen Genen darstellen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer Satz genetischer Interaktionen von Genen geteilt wird, die Proteine kodieren, die zum gleichen Signalweg oder Komplex gehören 4,5. So können genetische Interaktionsnetzwerke verwendet werden, um die funktionelle Organisation in einer Zelle zu etablieren, wobei Gene, die die ähnlichsten Profile teilen, zum gleichen Komplex oder Signalweg gehören, diejenigen Gene, die etwas weniger ähnliche Profile teilen, zum gleichen biologischen Prozess gehören und jene Gene, die überlappende, aber vielfältigere Profile aufweisen, Mitglieder widerspiegeln, die zum gleichen zellulären Kompartimentgehören 6.

Genetische Interaktionsscreens auf der Grundlage von Dosisunterdrückung ("High-Copy- oder Multicopy-Suppression") sind einer der am häufigsten verwendeten Ansätze. Diese Screens können durchgeführt werden, indem ein Abfragemutantenstamm mit einer Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl transformiert wird, gefolgt von geeigneten Assays/Selektionstechniken zur Identifizierung unterdrückender oder verstärkender genetischer Interaktionen 7,8,9. Um eine umfassende genomweite Abdeckung zu gewährleisten, wurden diese Screens auch durchgeführt, indem ein spezifisches Gen von Interesse in einer Sammlung genomweiter Funktionsverlust-Mutanten überexprimiert oder eine Plasmid-kodierte Genom- oder cDNA-Bibliothek mit hoher Kopienzahl in einer Funktionsverlust-Abfragemutante 9,10,11,12,13,14,15 überexprimiert wurde. . Die Multicopy-Strategie könnte auch mit einem dominanten/Überexpression-Ansatz unter Verwendung eines regierbaren Promotors funktionieren.

Die Hauptvorteile der Verwendung von suppressorbasierten Screens bestehen darin, dass die Unterdrückung eines bereits bestehenden Phänotyps in einem mutierten Stamm durch ein anderes Gen eine genetische Beziehung zwischen diesen beiden Genprodukten herstellt, die mit anderen Ansätzen möglicherweise nicht nachgewiesen wurde. Zweitens wurde beobachtet, dass das Vorhandensein einer bereits bestehenden Mutation einen bestimmten Signalweg sensibilisiert, so dass zusätzliche Komponenten dieses Signalwegs durch die Isolierung von Suppressoren identifiziert werden können, die möglicherweise nicht durch direktere genetische Selektionen identifiziert wurden. Darüber hinaus kann dieser Bildschirm verwendet werden, um Suppressoren zu identifizieren, die unterschiedliche Unterdrückungsmechanismen aufweisen16. Suppressor-Interaktionen treten normalerweise zwischen Genen auf, die funktionell verwandt sind und verwendet werden können, um Hierarchien in Signalwegen aufzuklären. Der genaue zugrunde liegende Mechanismus der Unterdrückung kann sich aufgrund mehrerer Faktoren unterscheiden, einschließlich der Art der im Bildschirm verwendeten Abfragemutante, der experimentellen Bedingungen und des Niveaus der Genexpression. Einer der häufigsten Mechanismen zur Unterdrückung der Dosierung betrifft Gene, die Produkte kodieren, die im selben Komplex oder parallel im selben zellulären / biologischen Prozess zusammenarbeiten. Die Ergebnisse solcher Screens in einfacheren Modellorganismen wie Hefe können auf höhere eukaryotische Organismen ausgedehnt werden, da die meisten grundlegenden biologischen Wege und Prozesse im Laufe der Evolution erhalten bleiben.

Diese genetischen Screens können auch auf verschiedene Arten modifiziert werden, um verschiedene biologische Fragen zu beantworten. So können beispielsweise orthologe Gene aus verschiedenen Organismen identifiziert werden, die den Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken können. Es wurde auch verwendet, um potenzielle Resistenzmechanismen abzugrenzen und Proteinziele von neuartigen antibakteriellen17,18-, antimykotischen19,20-, antiparasitären 21- und Krebs-22-Verbindungen zu bestimmen. Dieser Bildschirm wurde auch genutzt, um Suppressoren der Aktivität von Arzneimitteln zu identifizieren, deren Wirkmechanismus nicht bekannt ist. Somit können diese Multicopy-Suppressor-Screens prinzipiell optimiert und in einer Vielzahl von Anwendungen in unterschiedlichen Organismen eingesetzt werden. Obwohl die meisten genetischen Screens, die von Hefeforschern verwendet werden, ursprünglich in S. cerevisiae entwickelt wurden, hat sich S. pombe als komplementäres Modellsystem für die Durchführung verschiedener genetischer Screens und Assays herauskristallisiert23. Darüber hinaus zeigen genomische Organisation und biologische Prozesse in S. pombe, wie das Vorkommen von Introns in mehr Genen, die Komplexität der Ursprünge der DNA-Replikation, die Zentromerstruktur, die Organisation des Zellzyklus und das Vorhandensein der RNAi-Maschinerie, eine größere Ähnlichkeit zwischen S. pombe und höheren Eukaryoten23,24, was die Bedeutung der Entwicklung und Verwendung genetischer Werkzeuge in S. pombe unterstreicht.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Identifizierung genetischer Interaktoren basierend auf der "Dosisunterdrückung" eines mutierten Phänotyps mit Funktionsverlust in S. pombe. Die Grundlage dieses Protokolls ist, dass es eine schnelle und effiziente Methode ist, eine cDNA-Bibliothek zu screenen, die Wildtyp-Gene entweder auf einem Multicopy-Plasmid und/oder von einem starken Promotor überexprimiert. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten: Transformation der Bibliothek in einen Abfragemutantenstamm, Auswahl von Plasmidklonen, die den gewünschten Phänotyp des Abfragemutantenstamms unterdrücken, Abrufen der Plasmide aus diesen Suppressorklonen und Identifizierung des Gens, das für die Unterdrückung des Phänotyps verantwortlich ist. Wie bei jeder Methode, die auf der Auswahl und Identifizierung von cDNAs aus einer Bibliothek basiert, hängt der Erfolg des Bildschirms von der Verwendung einer qualitativ hochwertigen und hochkomplexen Bibliothek ab, da der Bildschirm nur die cDNA-Klone abrufen kann, die in der Bibliothek vorhanden sind.

Mit diesem Protokoll ist es uns gelungen, zwei neuartige Suppressoren des genotoxischen stresssensitiven Phänotyps der Abfrage-Nullmutante S. pombe ell1 zu identifizieren. Die ELL-Familie (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) von Transkriptions-Elongationsfaktoren unterdrückt das vorübergehende Pausieren der RNA-Polymerase II auf DNA-Vorlagen in biochemischen In-vitro-Assays und ist in verschiedenen Organismen konserviert, von der Spalthefe bis zum Menschen25. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass eine S. pombe ell1-Nullmutante genotoxische Stressempfindlichkeit in Gegenwart von 4-Nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) und Methylmethansulfonat (MMS) zeigt26. Daher transformierten wir eine S. pombe-Plasmid-kodierte Multicopy-cDNA-Bibliothek in die Abfrage S. pombe ell1 Nullmutante und identifizierten zwei mutmaßliche Klone, die die Fähigkeit zeigten, die genotoxische Stressempfindlichkeit der S. pombe ell1-Nullmutante in Gegenwart von 4-NQO, einer Verbindung, die DNA-Läsionen induziert, zu unterdrücken. Die anschließende Sequenzierung des in den Plasmidklonen vorhandenen Inserts ergab, dass die Gene, die für rax2+ und osh6+ kodieren, für die Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit der ell1-Nullmutante verantwortlich waren, wenn sie in der ell1-Nullmutante überexprimiert wurden.

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Protokoll

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1. Transformation der cDNA-Bibliothek in den Abfrage-S. pombe-Mutantenstamm zum Screening auf Multicopy-Suppressoren

ANMERKUNG: Die Standard-Lithium-Acetat-Methode27 wurde befolgt, um die S. pombe cDNA-Bibliothek mit einigen Modifikationen in den Abfragestamm S. pombe ell1Δ umzuwandeln:

  1. Der Stamm S. pombe ell1Δ züchtet bei 32 °C auf einer YE-Mediumplatte (Tabelle 1), ergänzt mit je 225 μg/ml Adenin, Leucin und Uracil. Beimpfen Sie eine Schleife voller Inokulum des ell1Δ-Stamms von der obigen Platte in 15-20 ml YE-Medium, ergänzt mit je 225 μg / ml Adenin, Leucin und Uracil. Über Nacht bei 32 °C unter Schütteln (200-250 U/min) inkubieren.
  2. Am nächsten Tag wird die Übernachtkultur in 100 ml frischem YE-Medium mit den gewünschten Zusätzen auf einen OD von 600 nm (optische Dichte bei 600 nm) von 0,3 verdünnt und bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min inkubiert, bis der OD600 nm die Mid-Log-Phase erreicht.
  3. Teilen Sie die 100-ml-Kultur in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei Raumtemperatur für 10 min bei 4.000 × g.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit 1 ml sterilem Wasser, d. h. resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml sterilem Wasser und zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Der Überstand ist zu verwerfen und jedes Zellpellet mit 1 ml 1x LiAc-TE (100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) Lösung wie in Schritt 1.4 beschrieben zu waschen.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 μL 1x LiAc-TE. Verwenden Sie diese S. pombe-kompetenten Zellen (500 μL) für die Transformation mit der interessierenden DNA. 125 μL der kompetenten Zellen in vier verschiedene sterile Mikrozentrifugenröhrchen für nachfolgende Transformationsschritte überführen.
  7. Kochen Sie Träger-DNA aus Lachshoden oder Heringssperma für 1 min und legen Sie sie sofort auf Eis. Für jede Transformation werden 10 μL 10 mg/ml denaturierte, einzelsträngige Träger-DNA in das Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 125 μL der kompetenten Zellen enthält, gefolgt von einem vorsichtigen Mischen mit einer Mikropipettenspitze. Anschließend werden 50 μg der S. pombe cDNA-Bibliothek in das zuständige Zellträger-DNA-Gemisch-enthaltende Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
  8. Die Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und dann 260 μL Polyethylenglykol-Lithiumacetat-Lösung (40% [w/v] PEG 4.000, 100 mM Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) in die Röhrchen geben und vorsichtig mit Hilfe einer Mikropipettenspitze mischen.
  9. Die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Transformationsgemisch 2 h lang bei 32 °C ohne Schütteln inkubieren. 43 μL vorgewärmtes Dimethylsulfoxid (DMSO) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und vorsichtig mischen. Anschließend werden die Röhren 5 min lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt.
  10. Pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und entfernen Sie die restliche PEG-LiAc-TE-Lösung mit Hilfe einer Mikropipettenspitze.
  11. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL sterilem Wasser und Platte auf einer EMM2 (Tabelle 1) Platte (150 mm) mit den erforderlichen Ergänzungen und 0,2 μg / ml 4-NQO.
  12. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 5-6 Tage, damit Kolonien auf den Platten erscheinen können. Streifen Sie die erhaltenen Kolonien auf derselben Medienplatte in Gegenwart von 0,2 μg / ml 4-NQO und verwenden Sie sie für das weitere Screening.
  13. Verwenden Sie für ein Bibliothekstransformationsexperiment 500 μL kompetente Zellen (125 μL kompetente Zellen x 4 Mikrozentrifugenröhrchen) für die Transformation, wie in den Schritten 1.8 bis 1.14 oben beschrieben.
  14. Als Kontrolle Platte 1/10 der Transformationsmischung auf einer EMM2-Platte (150 mm) mit erforderlichen Ergänzungen, aber ohne 4-NQO, um die Gesamtzahl der Bibliotheksklone zu berechnen, die nach Transformation der Bibliothek erhalten wurden, und Screening für die Isolierungder Suppressorklone.

2. Testen und validieren Sie die Rettung/Unterdrückung des Phänotyps, der mit dem Abfragemutantenstamm verbunden ist, durch den mutmaßlichen Suppressor

HINWEIS: Stresspunkt-Assays wurden wie unten beschrieben durchgeführt, um die Rettung/Unterdrückung der ell1-deletionsassoziierten 4-NQO-Stressempfindlichkeit durch den/die mutmaßlichen Suppressor(en) zu testen und zu validieren.

  1. Fügen Sie 100-200 μL steriles Wasser in jede der verschiedenen Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.
  2. Wählen Sie eine kleine Menge Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien, die nach der cDNA-Bibliothekstransformation auf der Platte mit 4-NQO erhalten wurden, mit einem sterilen Zahnstocher oder einer 20-200 μL Mikropipettenspitze. Geben Sie das Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien in separate unabhängige Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die 100-200 μL steriles Wasser enthalten. Gründlich mischen.
  3. Spot 3 μL der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf EMM2-Agarplatten, die Adenin (225 μg/ml) und Uracil (225 μg/ml) enthalten, aber Leucin fehlen (der wählbare auxotrophe Marker, der auf dem Plasmidvektor vorhanden ist, der für den Aufbau der in dieser Arbeit verwendeten Bibliothek verwendet wird). Fügen Sie den Platten nach Bedarf geeignete Konzentrationen von 4-NQO hinzu.
  4. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-4 Tage, damit die Zellen wachsen können. Identifizieren Sie die Kolonien, die Wachstum in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 4-NQO als mutmaßliche Suppressoren zeigen.
  5. Um die Suppressoren weiter zu validieren, züchten Sie die ausgewählten Suppressoren zusammen mit geeigneten Kontrollstämmen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln (200-250 U/min) in EMM2-Medium, das jeweils 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, aber Leucin fehlt.
  6. Am nächsten Tag verdünnen Sie die Zellen auf einen OD 600 nm von 0,3 in frischem EMM2-Medium und züchten sie bei 32 °C mit Schütteln bis zur Mitte der Log-Phase (ca.OD 600 nm von 0,6-0,8).
  7. Geeignete serielle Verdünnungen (1:10 oder 1:5) von Kulturen auf EMM2-Platten mit erforderlichen Ergänzungen, die entweder 0,4 μM 4-NQO oder 0,01% MMS enthalten. Zur Kontrolle erkennen Sie die Stämme auf einer EMM2-Platte mit den erforderlichen Ergänzungen, aber ohne DNA-schädigendes Mittel.
  8. Inkubieren Sie die Platten bei 32 °C für 3-5 Tage, um das Wachstum zu überwachen.
    HINWEIS: Geeignete Assays basierend auf dem Phänotyp, der mit dem Abfragemutantenstamm assoziiert ist, sollten verwendet werden, um die Rettung oder Unterdrückung des Phänotyps zu testen. Wenn beispielsweise Suppressoren eines kälteempfindlichen Phänotyps eines Abfragemutantenstamms identifiziert werden müssen, würde der Assay zum Testen und Validieren der Suppressorklone die Züchtung von Transformanten bei niedrigen Temperaturen beinhalten.
  9. Erkennen Sie die mutierten Stämme, die mit einem interessierenden Gen in voller Länge (in diesem Fall Spell1 ) oder einem leeren Vektor als positive bzw. negative Kontrollen zusammen mit den Bibliothekstransformanten transformiert wurden.

3. Isolierung des Plasmids aus den Klonen der S. pombe-Suppressoren

ANMERKUNG: Die Plasmidisolierung aus S. pombe wurde nach dem in Fission yeast: a laboratory manual28 beschriebenen Protokoll mit einigen Änderungen durchgeführt.

  1. Beimpfen Sie eine einzelne Hefekolonie in EMM2-Medium, das 225 μg/ml Adenin und Uracil enthält, und lassen Sie die Zellen über Nacht bei 32 °C mit Schütteln bei 200-250 U/min wachsen. Am nächsten Tag ernten Sie 5 AD-Zellen (d.h. 10 ml Kultur von AD 0,5) durch Zentrifugieren für 2 min bei 4.000 × g bei Raumtemperatur.
  2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,2 ml Lysepuffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) und 1 mM Na2EDTA).
  3. 0,2 ml Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g säuregewaschene Glasperlen in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 2 min bei 4 °C vorstrecken und 1 min auf Eis inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 6x.
  4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Die obere wässrige Schicht wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 200 μL Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) hinzugefügt.
  5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 × g für 10 min. Die obere wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen geben und zwei Volumina 100% Ethanol (~ 400 μL) und 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, pH 5,8) (~ 20 μL) in das Röhrchen geben. Das Mikrozentrifugenröhrchen 1 h lang bei -70 °C inkubieren.
  6. Die DNA wird durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 4 °C gefällt und der Überstand entfernt. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 70% Ethanol (~ 500 μL) und halten Sie es bei Raumtemperatur, um es an der Luft zu trocknen.
  7. Resuspendieren Sie die DNA in 20 μL sterilem Wasser. Verwenden Sie 2-5 μL Plasmid-DNA für die Transformation kompetenter E. coli-Zellen.
    HINWEIS: Plasmid kann auch aus Hefezellen unter Verwendung eines der kommerziell erhältlichen Hefeplasmid-Isolierungskits isoliert werden.

4. Identifizierung des vom Suppressorklon kodierten Gens

  1. Die isolierten Hefeplasmide werden unter Verwendung des Standardprotokolls29 in E. coli Top10-Stamm [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] umgewandelt und die Zellen mit den erforderlichen Antibiotika auf LB (Luria Broth) -Platten verteilt.
  2. Isolieren Sie das/die Plasmid(e) aus E. coli-Transformanten unter Verwendung des alkalischen Standard-Lyseprotokolls29 und befolgen Sie die entsprechenden Kombinationen von Restriktionsenzymen, um die Freisetzung des DNA-Fragments durch Restriktionsaufschluss zu überprüfen.
    HINWEIS: Suppressorplasmid 84 wurde mit Bam HI-Restriktionsenzym und Suppressorplasmid 104 mit PstI / BamHI-Restriktionsenzymen verdaut.
  3. Retransformieren Sie die Plasmide, die eine Insertfreisetzung nach Restriktionsaufschluss im ell1 Δ-Stamm zeigen, um ihre Fähigkeit zu überprüfen, den genotoxischen stresssensitiven Phänotyp des ell1Δ-Stammes zu retten.
  4. Wählen Sie die Plasmidklone aus, die eine Unterdrückung der genotoxischen Stressempfindlichkeit zeigen, und sequenzieren Sie das in diesen Plasmidklonen vorhandene DNA-Fragment mit vektorspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde der adh1-Promotor-spezifische universelle Vorwärtsprimer (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') verwendet30.
  5. Um das für die Unterdrückung verantwortliche Gen zu identifizieren, richten Sie die Sequenz aus, die mit NCBI-Nukleotidblast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) oder Pombase-Sequenz-Alignment-Tool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core) erhalten wurde. Wählen Sie die Sequenz aus, die die maximale Ausrichtung zeigt, und identifizieren Sie sie als das Gen für das Multicopy-Suppressorplasmid.

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Ergebnisse

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Screening auf Multicopy-Suppressor(s) der ell1-deletionsassoziierten genotoxischen Stresssensitivität bei S. pombe
Wir führten das genetische Screening unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls durch, um Multicopy-Suppressoren des Funktionsverlust-Phänotyps des Abfrage-ell1-Deletionsmutantenstamms zu identifizieren. Die wachstumsbedingte Sensitivität des ell1-Deletionsstamms, die in Gegenwart des genotoxischen 4-N...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hefen wurden häufig verwendet, um die grundlegenden biologischen Prozesse und Wege zu untersuchen, die evolutionär in eukaryotischen Organismen konserviert sind. Die Verfügbarkeit genetischer und genomischer Werkzeuge sowie ihre Zugänglichkeit für verschiedene biochemische, genetische und molekulare Verfahren machen Hefen zu einem ausgezeichneten Modellorganismus für die genetische Forschung34,35,36. Im Laufe der Jahre wurden ve...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium des Department of Biotechnology, Government of India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) an Nimisha Sharma. Die Autoren danken Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) für die Schenkung der S. pombe cDNA-Bibliothek und Prof. Susan Forsburg für die Hefeplasmide.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-NQOSigmaN8141
Essigsäure, eiszeitlichesSigma1371301000
AdeninsulfatHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgaroseLonza50004L
AmmoniumchloridHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinHimediaRM095
BorsäureHimediaMB007
Calciumchlorid SigmaC4901
Chloroform:Isoamylalkohol 24:1SigmaC0549
ZitronensäureHimediaRM1023
Dinatriumhydrogenphospahte wasserfrei HimediaGRM3960
einzelsträngige DNA aus LachshodenSigmaD7656
EDTA DinatriumSigma324503
Eisenchlorid-HexahydratHimediaRM6353
GlucoseAmresco188
IonositolHimediaGRM102
IsopropanolQualigen Q26897
LeucinHimediaGRM054
LithiumacetataeSigma517992
Magnesiumchlorid-HexahydratHimediaMB040
Molybdische SäureHimediaRM690
NikotinsäureHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
PentothinsäureHimediaTC159
PhenolHimediaMB082
Plasmid-ExtraktionskitQiagen27104
KaliumchloridSigmaP9541
KaliumhydrogenphthalatMercDDD7D670815
KaliumiodidHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
NatriumhydroxidHimediaGRM1183
NatriumsulfatHimediaRM1037
Tris-freie BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
Hefeextrakt PulverHimediaRM668
Zinksulfat HeptahydratMercDJ9D692580

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. Fission yeast: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444(2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

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