Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Summary

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Abstract

Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.

Introduction

Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4.

Protocol

1. DLBCL-Zelllinien mit Mafosfamid oder Daunrubicin Behandlung zur Induktion der zellulären Seneszenz

HINWEIS: Das Protokoll funktioniert auch für adhärente Krebszellen. Je nach Zellgröße 1-2 × 10 5 Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte einspeisen und die Platte in einem⁵ % CO₂, 37 °C Inkubator über Nacht vor der Behandlung inkubieren. Die Protokollschritte sind die gleichen wie für Suspensionszellen, jedoch mit zwei Ausnahmen. Zuerst müssen Zellen nach Schritt 3.4 von der Platte trypsinisiert werden. Zweitens werden Waschschritte ohne Zentrifugation vor der Trypsinisierung durchgeführt.

....

Results

Eine Kompensationsmatrix wurde mit Hilfe von Bildanalysesoftware generiert, indem aufgezeichnete Daten von einfarbigen Kontrollproben geladen wurden. Wie in Ergänzender Abbildung S1 gezeigt, wurde ein nicht zu vernachlässigender Lichtüberlauf (Koeffizientenwert ≥ 0,1) von EdU auf C₁₂FDG mit einem Übersprechkoeffizientenwert von 0,248 festgestellt, während das Übersprechen unter anderen Kanälen nicht signifikant war. Vier verschiedene DLBCL-Zelllinien wurden mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng/mL DN beh.......

Discussion

Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67⁺ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der Sene.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antikörper	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Maus Monoklonaler Antikörper (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin-Diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Reiniger (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Durchflusszytometrie-Assay-Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70 % Isopropanol)	Millipore	1.3704
Bildanalyse-Software (Amnis  IDEEN  6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrumenten- und Bildgebungssoftware (Amnis  ImageStreamX  Mk II Imaging Flow Cytometer System und INSPIRE-Software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
Mafosfamid Cyclohexylamin	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-Thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
Saponin	Sigma aldrich	47036
Hülle	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit für ImageStream	Luminex	400041
Sterilisator (0,4-0,7% Hypochlorit)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575