Messung der Lebersteifigkeit mittels Rasterkraftmikroskopie gekoppelt mit Polarisationsmikroskopie

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Elastizitätsmodule von kollagenreichen Bereichen in normaler und kranker Leber mittels Rasterkraftmikroskopie. Der gleichzeitige Einsatz der Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision zur Lokalisierung kollagenreicher Areale in den Leberabschnitten.

Zusammenfassung

Die Matrixversteifung wurde als einer der Haupttreiber für das Fortschreiten der Leberfibrose erkannt. Es hat tiefgreifende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte des Zellverhaltens wie Zellfunktion, Differenzierung und Motilität. Da diese Prozesse jedoch nicht im gesamten Organ homogen sind, ist es immer wichtiger geworden, Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Geweben auf zellulärer Ebene zu verstehen.

Um die Versteifung kollagenreicher Bereiche innerhalb der Leberlappen überwachen zu können, stellt diese Arbeit ein Protokoll zur Messung von Lebergewebe-Elastizitätsmodulen mit hoher räumlicher Präzision mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) vor. AFM ist eine empfindliche Methode mit dem Potenzial, lokale mechanische Eigenschaften zu charakterisieren, berechnet als Elastizitätsmodul (auch als Elastizitätsmodul bezeichnet). AFM in Verbindung mit Polarisationsmikroskopie kann verwendet werden, um die Bereiche der Fibroseentwicklung basierend auf der Doppelbrechung von Kollagenfasern in Geweben spezifisch zu lokalisieren. Unter Verwendung des vorgestellten Protokolls charakterisierten wir die Steifigkeit von kollagenreichen Bereichen aus fibrotischen Mauslebern und entsprechenden Bereichen in der Leber von Kontrollmäusen.

Eine deutliche Zunahme der Steifigkeit von kollagenpositiven Bereichen wurde bei der Entwicklung von Fibrose beobachtet. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine hochreproduzierbare Methode der AFM-Messung aufgrund der Verwendung von leicht fixiertem Lebergewebe, die verwendet werden kann, um das Verständnis von krankheitsbedingten Veränderungen der lokalen Gewebeeigenschaften und deren Auswirkungen auf das Schicksal benachbarter Zellen zu fördern.

Einleitung

Die Leber ist ein lebenswichtiges Organ für die Aufrechterhaltung der Homöostase in Organismen ^1,2. Chronische Lebererkrankungen machen jährlich ~ 2 Millionen Todesfälle weltweit aus³. Sie entstehen am häufigsten als Virusinfektionen, Autoimmunerkrankungen, metabolische Syndrome oder alkoholbedingte Erkrankungen und werden von fortschreitender Leberfibrose begleitet. Eine Leberschädigung löst eine Entzündungsreaktion aus, die zur Aktivierung von Zellen führt, die extrazelluläre Matrix (ECM) in einer Wundheilungsreaktion ablagern. Bei einer chronischen Beleidigung bildet jedoch eine überschüssige EZM ungelöstes Narbengewebe in der Leber, was zur Entwicklung von Leberfibrose, Leberzirrhose, Leberkarzinom und schließlich zu Leberversagen führt⁴.

Eine Hepatozytenverletzung führt sofort zu einer erhöhten Lebersteifigkeit ^5,6. Dies wirkt sich direkt auf die Hepatozytenfunktion aus, aktiviert hepatische Sternzellen (HSZ) und portale Fibroblasten und führt zu deren Transdifferenzierung zu kollagenablagernden Myofibroblasten ^7,8. Die Ablagerung von fibröser ECM erhöht die Lebersteifigkeit weiter und erzeugt eine selbstverstärkende Rückkopplungsschleife aus Leberversteifung und matrixproduzierender Zellaktivierung.

Die Lebersteifigkeit ist somit zu einem wichtigen Parameter für die Prognose von Lebererkrankungen geworden. Die Veränderung der biomechanischen Gewebeeigenschaften kann früher erkannt werden, als Fibrose durch histologische Analyse diagnostiziert werden kann. Daher wurden verschiedene Techniken zur Messung der Lebersteifigkeit sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Anwendung entwickelt. In klinischen Umgebungen wurden transiente Elastographie (TE) 9,10,11,12,13 und Magnetresonanz-Elastographie (MRE)^{14,15,16,17,18} eingesetzt, um frühe Stadien von Leberschäden durch Untersuchung der groben Lebersteifigkeit nicht-invasiv zu diagnostizieren ¹⁹.

Bei TE werden Ultraschallwellen mit leichter Amplitude und niedriger Frequenz (50 Hz) durch die Leber verbreitet und ihre Geschwindigkeit gemessen, die dann zur Berechnung des Gewebeelastizitätsmoduls¹³ verwendet wird. Diese Technik ist jedoch nicht nützlich für Patienten mit Aszites, Fettleibigkeit oder niedrigeren Interkostalräumen aufgrund einer unsachgemäßen Übertragung der Ultraschallwellen durch das die Leber umgebende Gewebe⁹.

MRE basiert auf der Magnetresonanztomographie und verwendet mechanische Scherwellen von 20-200 Hz, um die Leber anzugreifen. Eine spezifische Magnetresonanztomographie-Sequenz wird dann verwendet, um die Wellen im Gewebe zu verfolgen und die Gewebesteifigkeit zu berechnen¹⁶. Die Steifigkeitswerte, die sowohl mit TE- als auch mit MRE-Techniken berichtet wurden, korrelieren gut mit dem Grad der Leberfibrose, der aus Biopsien menschlicher Leberproben gewonnen wurde, die anhand histologischer METAVIR-Scores²⁰ eingestuft wurden (Tabelle 1). TE und MRE wurden auch für die Messung der Lebersteifigkeit in Nagetiermodellen für Forschungszwecke angepasst^21,22,23. Da beide Methoden jedoch die Steifigkeitswerte aus der Reaktion des Gewebes auf die sich ausbreitenden Scherwellen ableiten, spiegeln die erhaltenen Werte möglicherweise nicht die absolute mechanische Steifigkeit des Gewebes wider.

Für eine direkte mechanische Charakterisierung von Nagetierlebern entwickelten Barnes et al. einen Modell-Gel-Gewebe-Assay (MGT-Assay), bei dem Lebergewebe in Polyacrylamidgel²⁴ eingebettet wird. Dieses Gel wird durch eine gepulste gleichmäßige Kraft komprimiert, aus der der Elastizitätsmodul berechnet werden kann. Der MGT-Assay zeigt eine gute Korrelation mit einem Indentationsassay, der sowohl für normale als auch für fibrotische Lebern angepasst ist²⁴ (Tabelle 1).

Tabelle 1: Lebersteifigkeitswerte auf der Schüttebene. TE und MRE im Vergleich zu direkten ex vivo mechanischen Messungen von Leber-Elastizitätsmodulen unter Verwendung von Indentations- und MGT-Assays für Lebern aus verschiedenen Quellen. Die Beziehung zwischen E und G ist gegeben durch E = 2G (1 + v), wobei v das Poisson-Verhältnis der Probe ist; F0 bis F4 stellen den Fibrose-Score im METAVIR-Scoring-System dar, wobei F0 eine niedrige oder keine Fibrose und F4-Lebern mit Zirrhotie bezeichnet. Abkürzungen: TE = transiente Elastographie; MRE = Magnetresonanz-Elastographie; MGT = Modell-Gel-Gewebe; E = Elastizitätsmodul (Elastizitätsmodul); G = Schubmodul. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Einer der Hauptnachteile generischer Lebersteifigkeitsmessungen besteht darin, dass sie keine Auflösung der Steifigkeitsheterogenität in der Leber auf zellulärer Ebene bieten. Während des Fortschreitens der Fibrose zeigen kollagenreiche Bereiche eine höhere Steifigkeit im Vergleich zum umgebenden Parenchym^25,26. Dieser Steifigkeitsgradient beeinflusst lokal die residenten Zellen und spielt eine wichtige Rolle bei der Förderung der HSC-Heterogenität²⁷. Daher müssen Veränderungen der lokalen mechanischen Eigenschaften während der Entwicklung von Lebererkrankungen auf mikroskopischer Ebene charakterisiert werden, um das Fortschreiten der Fibrose besser zu verstehen.

AFM ermöglicht es, die mechanischen Eigenschaften von Gewebe mit hoher Auflösung und hoher Kraftempfindlichkeit zu messen. AFM verwendet die Spitze eines Cantilevers, um die Oberfläche einer Probe mit Kräften von nur mehreren Pikonewton einzudrücken, wodurch eine Verformung auf mikroskopischer oder nanoskopischer Ebene basierend auf der Geometrie und Größe der verwendeten Spitze induziert wird. Die Kraftantwort der Probe auf die angelegte Dehnung wird dann als Durchbiegung im Ausleger²⁸ gemessen. Kraft-Weg-Kurven werden aus dem Annähern und Zurückziehen des Auslegers gesammelt, der mit geeigneten kontaktmechanischen Modellen ausgestattet werden kann, um die lokale Steifigkeit der Probe²⁹ zu bewerten.

Neben der Messung der Steifigkeit eines bestimmten Bereichs kann AFM auch topographische Informationen über spezifische Merkmale in der Probe liefern, wie z.B. die Struktur der Kollagenfasern^30,31,32. Mehrere Studien haben die Anwendung von AFM zur Messung der Steifigkeit verschiedener gesunder und kranker Gewebe beschrieben, wie Haut 32,33, Lunge 34,35, Gehirn^{36, Brust 37,38,39}, Knorpel 40 oder Herz 41,42,43,44 aus Patienten- und Mausmodellproben. Darüber hinaus wurde AFM auch in vitro verwendet, um die Steifigkeit von Zellen und extrazellulären Proteingerüsten^{zu bestimmen 45,46,47}.

Die Messung der mechanischen Eigenschaften biologischer Proben mit AFM ist aufgrund ihrer Weichheit und Zerbrechlichkeit nicht trivial. So haben verschiedene Studien unterschiedliche Bedingungen und Einstellungen standardisiert, die stark schwankende Werte der Young-Moduli ergeben (überprüft von Mckee et ^al.48). Ähnlich wie bei anderen Weichteilen zeigen auch die Leber-Elastizitäts-Elastizitätswerte bei verschiedenen Graden der Leberfibrose starke Schwankungen (Tabelle 2). Die Unterschiede in den Elastizitätsmodulwerten ergeben sich aus Unterschieden in der Art des AFM-Betriebs, der Cantilever-Spitze, der Probenvorbereitungsmethode, der Probendicke, der Eindringtiefe und -kräfte, der Lebergewebeumgebung während der Messung und der Analysemethode (Tabelle 2).

Tabelle 2: Lebersteifigkeitswerte auf zellulärer Ebene. Lebersteifigkeitswerte, die mit AFM erhalten wurden, beschreiben die mechanischen Eigenschaften der Leber auf zellulärer Ebene. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; E = Elastizitätsmodul (Elastizitätsmodul); PFA = Paraformaldehyd; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die reproduzierbare Messung von Young-Moduli von kollagenreichen fibrotischen Bereichen im Lebergewebe mittels AFM mit einer präzisen Lokalisation, die durch den Einsatz von Polarisationsmikroskopie bereitgestellt wird. Wir verabreichten Tetrachlorkohlenstoff (CCl₄), um die Kollagenablagerung in zentrilobulärer Weise⁴⁹ in einem Mausmodell zu induzieren, wobei entscheidende Aspekte der menschlichen Leberfibrose zuverlässig nachgeahmt^{wurden 50}. Polarisierte mikroskopische Bilder ermöglichen die Visualisierung von Kollagen in der Leber aufgrund der Doppelbrechung der Kollagenfasern⁵¹, was eine genaue Positionierung der Cantileverspitze über dem gewünschten Interessenbereich innerhalb des Leberläppchens⁵² ermöglicht.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit einem vom Animal Care Committee des Instituts für Molekulare Genetik genehmigten Tierprotokoll und gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt. Ein schematisches Gesamtdiagramm des vorgestellten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Gesamtschema der AFM-Bewertung des Elastizitätsmoduls aus Mauslebern. (A) Isolierung der Leber von Kontrollmäusen oder behandelten Mäusen, gefolgt von Schneiden und Lagerung bei −80 °C (maximale Lagerung, 2 Wochen). (B) Anbringen der kugelförmigen Perle am Ausleger mit anschließendem Aushärten des Leims über Nacht (links). Cantilever-Kalibrierung mit anschließender Probenmontage (rechts). (C) Ausrichtung des Polarisators und des Analysators zur Visualisierung heller Kollagenstrukturen, gefolgt von einer Überlagerung des Bildes in der Kamera mit dem Messfeld unter dem AFM-Ausleger. (D) Erfassung von Steifigkeitskarten und Analysen. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; OCT = optimale Schnitttemperaturmischung; CCl₄ = Tetrachlorkohlenstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Probenvorbereitung I

1. Entfernen Sie die Leber aus dem geöffneten Bauch einer Maus, die durch zervikale Dislokation unter Narkose eingeschläfert wurde. Isolieren Sie den linken Seitenlappen und betten Sie die laterale Hälfte des Lappens durch schnelles Einfrieren auf Trockeneis in die optimale Schnitttemperatur (OCT) ein. Lagern Sie das OCT-eingebettete Gewebe bei −80 °C.
   ANMERKUNG: Frühere Studien haben gezeigt, dass die Steifigkeitswerte zwischen gefrorenem und frischem Gewebe ähnlich sind^25,26.
2. 30 μm dicke Leberschnitte mit einem Kryotom auf positiv geladene Objektträger schneiden und die Objektträger bei −80 °C bis zum Tag der AFM-Messung längstens 2 Wochen lagern.

2. Einrichtung des Instruments

1. Befestigung einer 5,7 μm Perle an AFM Cantileverspitze (Ergänzende Abbildung S1, Schritte 1-5)
   ANMERKUNG: Die Befestigung der Perle am Ausleger wurde auch zuvor von Norman et ^al.46 beschrieben.
   1. Die Suspension aus Melaminharzperlen mit einem Durchmesser von 5,7 μm gleichmäßig auf die Hälfte der Fläche eines Objektträgers verteilen und an der Luft trocknen, um das Lösungsmittel zu verdampfen (Zusatzabbildung S1, Schritt 1).
   2. Auf der anderen Hälfte des Objektträgers wird mit einer 10-μL-Spitze eine dünne Linie aus vorgemischtem Epoxidharz mit langer Arbeitszeit hergestellt (Zusatzabbildung S1, Schritt 1).
   3. Laden Sie die Cantilever-Sonde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den AFM-Kopf.
   4. Montieren Sie den Schlitten und die Abdeckung mit dem AFM-Kopf, der mit der Cantilever-Sonde ausgestattet ist.
      HINWEIS: In der Studie wurde ein SD-qp-BioT-TL-10 Cantilever verwendet.
   5. Bringen Sie den vorgemischten Epoxidharzkleber in die Mitte des Objektträgers und nähern Sie sich dem Kleber mit dem Cantilever mit geringer Kraft (stellen Sie einen Sollwert auf 1 V ein, um diesem Protokoll zu folgen; Ergänzende Abbildung S1, Schritt 2).
      HINWEIS: Bevor Sie sich der Objektträgeroberfläche nähern, stellen Sie sicher, dass der Laser in der Mitte der Cantilever-Spitze ausgerichtet ist, die durch eine hohe Summenspannung angezeigt wird, indem Sie die Schritte 6-8 in Abschnitt 2, Teil 3, Kalibrierung der Federkonstante des AFM-Auslegers befolgen.
   6. Nachdem die Spitze der Cantilever-Sonde mit dem Klebstoff in Kontakt gekommen ist, bewegen Sie sie knapp über den Objektträger, um überschüssigen Klebstoff zu entfernen.
   7. Ziehen Sie nun die Cantilever-Spitze vom Schlitten zurück und bewegen Sie den Schlitten, um eine einzelne Perle in die Mitte zu bringen (Zusatzfigur S1, Schritt 3). Nähern Sie sich der Wulst erneut mit der AFM-Cantileversonde mit höherer Kraft (Sollwert 2 V), um die Wulst in der Mitte der Cantileversonde zu befestigen und mindestens 10 s stehen zu lassen (Zusatzbild S1, Schritt 4).
   8. Extrahieren Sie die Cantilever-Sonde und bewahren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf, um den Klebstoff auszuhärten, oder befolgen Sie die Anweisungen für das Epoxidharz (Zusatzabbildung S1, Schritt 5).
2. Einrichten des Polarisators und des Analysators
   1. Um die interessierenden Bereiche innerhalb der Leberabschnitte zu lokalisieren, richten Sie das Mikroskop mit dem Polarisator und dem Analysator ein. Richten Sie ihre Vibrationsazimute in einem Winkel zwischen 0° und 90° zueinander aus, indem Sie einen von ihnen manuell oder automatisiert drehen, um das Durchlicht zu minimieren und außergewöhnliche Strahlen, die durch das Objektiv gehen, zu maximieren. Stellen Sie sicher, dass die Kollagenfasern vor einem dunklen Hintergrund im polarisierten Bild hell erscheinen (Abbildung 2), was durch eine Verschiebung des Peaks des Bildhistogramms zu hellen Pixeln reflektiert wird.

Abbildung 2: Repräsentative Mikroskopiebilder zeigen eine ausgeprägte Visualisierung von Kollagenfasern in der polarisierten Mikroskopie im Vergleich zu Hellfeldbildern. Leberschnitte von Mäusen, die 3 Wochen lang mit CCl₄ behandelt wurden, wurden (A) Hellfeld- und (B) polarisierter Mikroskopie unterzogen. Doppelbrechende Kollagenfasern sind in polarisierten Bildern im Vergleich zu Hellfeldbildern deutlich weiß sichtbar. Das rote Feld stellt den kollagenreichen Bereich dar, der für die AFM-Messung verwendet wird. Einschübe zeigen vergrößerte Ansichten des Bereichs im roten Feld. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; CCl₄ = Tetrachlorkohlenstoff; CV = zentrale Vene; PV = Pfortader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

HINWEIS: Für dieses Protokoll kann der AFM-Kopf auf jedem geeigneten inversen Mikroskop installiert werden, mit der Möglichkeit, einen Polarisator und einen Analysator einzusetzen. Das System muss in einer Isoliereinheit untergebracht werden, um die Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

3. Kalibrierung der Federkonstante des AFM-Auslegers
   1. Laden Sie die Cantilever-Sonde (vorbereitet gemäß den Schritten 1-8 in Abschnitt 2, Teil 1, Befestigung einer 5,7-μm-Perle an der AFM-Cantileverspitze) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den AFM-Kopf.
   2. Reinigen Sie den Ausleger mit 70% Ethanol, um eine Kontamination des Auslegers während der Messung zu vermeiden. Ausgiebig mit destilliertem Wasser waschen, um Restethanol von der Spitze zu entfernen.
   3. Aktivieren Sie den Kontaktmodus und wählen Sie Force Mapping als Messmethode.
   4. Öffnen Sie alle relevanten Fenster (Z-Schrittmotoren, Motorisierte Bühnensteuerung, Datenviewer, Force Scan Map Oszilloskop, Laserausrichtung und Kamerafenster ) in den Software-Registerkarten, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen klicken.
   5. Montieren Sie einen sauberen Objektträger mit 1,2 mL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem Bereich von ca. 2 cm x 4 cm, der mit einem hydrophoben Markerstift abgegrenzt ist. Montieren Sie den AFM-Kopf auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie sicher, dass der Ausleger vollständig in PBS eingetaucht ist.
   6. Fokussieren Sie das Ziel auf die Cantilever-Spitze. Reduzieren Sie die Intensität des Durchlichts auf dem Mikroskop, um eine bessere Sicht auf die Laserposition auf dem Monitor zu erhalten.
   7. Richten Sie den Laser auf das durchscheinende Ende des Auslegers (unter dem die kugelförmige Perle befestigt ist) und richten Sie den Spiegel mit den Knöpfen am AFM-Kopf aus, um die Gesamtintensität des Laserstrahls auf dem Detektor zu maximieren (dargestellt durch die Summe im Laserausrichtungsfenster ).
   8. Richten Sie den Fotodiodendetektor mit den Drehknöpfen am AFM-Kopf aus, um den Laser in seiner Mitte zu positionieren.
   9. Lassen Sie den Ausleger 15 Minuten stabilisieren, bevor Sie mit der Kalibrierung fortfahren.
   10. Öffnen Sie den Kalibrierungsmanager , und geben Sie den Auslegertyp, die Auslegerabmessungen und die Umgebungsbedingungen ein. Kalibrieren Sie die Federkonstante und Empfindlichkeit (auch bekannt als inverse optische Hebelempfindlichkeit, InvOLS), indem Sie auf Kalibrieren klicken. Bestätigen Sie die Genauigkeit der nach der Kalibrierung erhaltenen Federkonstante mit der Herstellererklärung. Kalibrieren Sie den Cantilever im berührungslosen Modus (die Kalibrierung wird von der Software unter Verwendung des von Sader et ^al.58 abgeleiteten thermischen Theorems durchgeführt).
       ANMERKUNG: Die Federkonstante des Auslegers stellt die Steifigkeit des Auslegers dar und ist durch die Widerstandskraft des Auslegers gegeben, da er sich pro Verformungslänge in N / m verformt. Die Empfindlichkeit des Cantilevers stellt den Wert der Photodiodenantwort (in Volt) als Reaktion auf die Auslenkung des Cantilevers (in Nanometern) dar und wird üblicherweise in nm/V⁵⁹ dargestellt. Im berührungslosen Modus wird das thermische Rauschspektrum erfasst und nach der Kalibrierung automatisch von der AFM-Steuerungssoftware mit der hydrodynamischen Funktion⁶⁰ versehen. Die Armatur liefert die Kalibrierparameter, nämlich die Federkonstante und das InvOLS. Die Federkonstante des in dieser Studie verwendeten SD-qp-BioT-TL-10 Cantilevers betrug 0,09 N/m, wie vom Hersteller angegeben.

3. Probenvorbereitung II

1. Die gefrorenen Abschnitte (gelagert bei −80 °C, wie in Abschnitt 1, Probenvorbereitung I beschrieben) bei Raumtemperatur für 2 min auftauen.
2. Die Abschnitte mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS für 10 min bei 4 °C fixieren und anschließend ausgiebig waschen (5x) mit 1x PBS. Wischen Sie Rest-PBS mit einem Gewebe um den Abschnitt herum ab und markieren Sie mit einem hydrophoben Markerstift eine Grenze von ca. 2 cm x 4 cm um den Leberabschnitt. Decken Sie die Probe mit 1x PBS ab (stellen Sie sicher, dass der abgegrenzte Bereich ~1,2 ml 1x PBS enthält). Verwenden Sie die Probe für AFM-Messungen.
   HINWEIS: Da PFA eine gefährliche Chemikalie ist, muss es vorsichtig behandelt werden, um den Kontakt mit Haut oder Augen zu vermeiden. Um giftige Dämpfe zu vermeiden, müssen alle Verfahren mit PFA in einem zertifizierten chemischen Abzug oder einem anderen zugelassenen belüfteten Bereich durchgeführt werden.

4. Messung

1. Aktivieren Sie die automatische Speicherung, indem Sie auf die Registerkarte Setup gehen und Autosave aktivieren. Geben Sie den Dateinamen und das Verzeichnis zum Speichern der Messdateien an, indem Sie auf die Registerkarte Einstellungen gehen und dann auf Einstellungen speichern klicken.
2. Laden Sie die Probe (vorbereitet gemäß Abschnitt 3, Probenvorbereitung II). Nähern Sie sich der Gewebeoberfläche mit dem AFM-Cantilever, indem Sie den Laser einschalten und auf die Annäherungstaste klicken. Nachdem die Spitze mit der Gewebeoberfläche in Kontakt gekommen ist, ziehen Sie die Cantilever-Spitze so zurück, dass die Spitze im Fokus des Objektivs bleibt (durch Klicken auf die Rückzugstaste , die den Ausleger bis zum oberen Ende des Piezobereichs zurückzieht). Richten Sie den Detektor neu aus, wenn die Laserposition im Fenster Laserausrichtung von ihrer Mitte wegbewegt wird.
3. Schalten Sie den Laser aus und überlagern Sie das optische Feld des Mikroskops mit AFM-Messkarten, indem Sie auf die Registerkarte Zubehör klicken und dann Direkte optische Overlay-Kalibrierung auswählen. Klicken Sie im folgenden Fenster auf Weiter , um eine Reihe von Bildern des Auslegers zu machen, der einen bestimmten Bereich scannt. Klicken Sie erneut auf Weiter , um zum nächsten Fenster zu gelangen.
4. Klicken Sie im ersten Bild manuell auf die Mitte der Spitze des Auslegers, um die Spitzenposition in der Software darzustellen. Der Kreis, der die Spitzenposition darstellt, kann in der Größe geändert werden, indem sein Radius angegeben wird, um die Genauigkeit zu erhöhen. Klicken Sie auf Kalibrieren, um die Position der Kragarmspitze in allen Bildern automatisch zu erkennen. Bestätigen Sie die Genauigkeit der Spitzenerkennung, indem Sie die Bilder durchgehen.
5. Klicken Sie auf Weiter und dann auf Fertig stellen , um die optische Überlagerung abzuschließen und die Bildserie zu speichern, die während der optischen Kalibrierung aufgenommen wurde.
6. Ziehen Sie den Ausleger weiter ein, um eine Kollision mit höheren Flächen auf dem Schlitten zu vermeiden. Verschieben Sie die Bühne, um einen kollagenreichen Bereich innerhalb des grünen Felds zu positionieren, das auf der Registerkarte Daten-Viewer unter Verwendung des polarisierten Bildes sichtbar ist. Wählen Sie den kollagenreichen Bereich aus, indem Sie mit einem langen Druck auf die linke Maustaste innerhalb des angegebenen grünen Kästchens ein Rechteck um ihn herum erstellen. Definieren Sie die Abmessungen, die Ausrichtung und die Auflösung des ausgewählten Bereichs auf der Registerkarte Raster auf der linken Seite. Klicken Sie auf Neuen Scanbereich bestätigen, um den ausgewählten Bereich als Messbereich festzulegen.
7. Behalten Sie die IGain- und PGain-Parameter der Rückkopplungsschleife auf Standardwerten bei, wenn keine größeren Instabilitäten in Form von Systemüberempfindlichkeit auftreten. Um diesem Protokoll zu folgen, stellen Sie IGain auf 50 Hz und PGain auf 0,001 ein.
8. Stellen Sie den Sollwert auf 1 nN ein.
   HINWEIS: Der Sollwert ist die Kraft der Spitze-Oberflächen-Wechselwirkung während des stationären Zustands. Für die meisten weichen Proben (Zellen, Gele und Gewebe) sind Sollwerte im Bereich von 0,5-2,0 nN geeignet.
9. Wählen Sie den relativen Sollwert entsprechend den mechanischen Eigenschaften des untersuchten Materials und der Steifigkeit des Auslegers. Legen Sie für dieses Protokoll den Wert auf 5 nN fest.
   HINWEIS: Der relative Sollwert stellt die maximale Wechselwirkungskraft dar, wenn der Höhepunkt der Kraft-Weg-Kurve erreicht ist und die Spitzenbewegung zur Basislinie zurückkehrt. Für weiche Materialien (1-50 kPa) wird dieser Parameter in Einheiten von Nanonewton (nN) festgelegt. Darüber hinaus beträgt die maximale Kraft, die angewendet werden kann, für einen weichen Cantilever (mit einer Federkonstante von 0,05 N/m bis 0,35 N/m) etwa 50 nN. Passen Sie den Sollwert und die relativen Sollwerte entsprechend an.
   1. Stellen Sie sicher, dass der angegebene Sollwert nicht zu einer Eindringtiefe führt, die größer ist als der Radius des kugelförmigen Eindringkörpers, da sonst die Eindruckfläche bei der Berechnung des Elastizitätsmoduls nicht richtig definiert werden kann. Berechnen Sie den Durchschnittswert der Einzugstiefe nach dem ersten Durchlauf der Einrückungen. Weitere Informationen zur Verarbeitung der aufgezeichneten Daten finden Sie in Abschnitt 5, Datenanalyse. Passen Sie den Sollwert bei Bedarf an.
10. Legen Sie Baseline anpassen auf 5 fest.
    HINWEIS: Hier bezieht sich die Basislinie auf den Grad des Polynoms, das für die Anpassung der Annäherungs- und Rückzugskurven verwendet wird. Die Einstellung der Basislinie auf 5 passt die Kurven auf hohe Auflösung an und gewährleistet so die Erfassung von Hintergrundgeräuschen während der Messungen.
11. Wählen Sie die Länge der Cantilever-Bewegung in der Z-Achse (Z-Länge) entsprechend der Oberflächentopographie der Probe. Um diesem Protokoll zu folgen, stellen Sie die Z-Länge auf 15 μm ein.
    HINWEIS: Ein hoher Wert (z. B. 15 μm) reduziert die Messempfindlichkeit, ist aber normalerweise für Proben mit einer stark unregelmäßigen Oberfläche wie fibrotischem Lebergewebe erforderlich.
12. Setzen Sie die Z-Bewegung auf Konstante Dauer.
    HINWEIS: Die Z-Bewegung kann auch auf Konstante Geschwindigkeit eingestellt werden, um Daten anzuzeigen, die sich auf Z-Bewegungen beziehen (Geschwindigkeit verlängern und Zeit verlängern) in einem anderen Modus.
13. Stellen Sie die Verlängerungszeit auf 1 s ein. Legen Sie Verlängerungsverzögerung und Rückzugsverzögerung auf 0 fest.
    HINWEIS: Verwenden Sie für sehr weiche Materialien Auszugsgeschwindigkeiten von >5,0 μm/s⁶¹, da niedrigere Eindringgeschwindigkeiten zu einer viskoseren und weniger elastischen Reaktion weicher Oberflächen führen. Extension Delay und Retract Delay sind Parameter, die verwendet werden können, um spezifische Wechselwirkungen zwischen der Cantileverspitze und dem Substrat zu untersuchen (z. B. Wechselwirkungen eines auf der Oberfläche des Cantilevers immobilisierten Proteins mit Proteinen, die auf der Objektträgeroberfläche immobilisiert sind).
14. Stellen Sie die Abtastrate auf 5000 Hz ein.
    HINWEIS: Die Abtastrate bezieht sich auf die Häufigkeit von Punkten, die auf einer vollständigen Annäherungs-Rückzugskurve aufgezeichnet werden. Stellen Sie diesen auf einen hohen Wert ein (z.B. 5000 Hz), um zu vermeiden, dass bestimmte Bereiche der Kurven aufgrund ihres extrem schnellen Übergangs übersehen werden.
15. Markieren Sie den Z Closed Loop mit einem Häkchen , um ein Rückkopplungsschleifensystem zu aktivieren, das den kontinuierlichen Abstand zwischen der Probenoberfläche und der Cantilever-Spitze gewährleistet.
16. Deaktivieren Sie die motorisierte Stufe, indem Sie Engage deaktivieren und auf Approach (Annäherung ) klicken, um sich der Probe mit dem Ausleger zu nähern. Klicken Sie auf Scan starten , um mit der Erfassung von Kraft-Weg-Kurven in dem in Schritt 6 festgelegten Bereich zu beginnen. Abschnitt 4, Messung.

5. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die erfassten Daten mit der Open-Source-Software "AtomicJ" (die von https://sourceforge.net/projects/jrobust/ heruntergeladen werden kann).
   HINWEIS: Es unterstützt Dateien, die von Agilent Technologies, JPK Instruments oder Bruker Rasterkraftmikroskopen gesammelt wurden.
2. Laden Sie die Kraftkurven in das Programm, indem Sie in AtomicJ auf das Symbol Prozesskraftkurven und Kennfelder klicken (Zusatzbild S2A, x). Fügen Sie im Bearbeitungsassistenten die zu analysierenden Karten hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken (Zusatzfigur S2A, y). Klicken Sie nach dem Laden der Karten auf Weiter (Zusatzfigur S2A, z).
3. Geben Sie die Verarbeitungseinstellungen im nächsten Fenster gemäß den unten beschriebenen Schritten an (entsprechend den Schritten in der ergänzenden Abbildung S2B, Schritte 1-11):
   1. Schätzen Sie den Kontaktpunkt zwischen der Probe und dem Ausleger manuell durch Berechnung oder automatisch anhand eines Satzes von Passkurvenparametern. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die automatische Schätzung des Kontaktpunkts.
   2. Bestimmen Sie den Kontaktpunkt zwischen dem Cantilever und der Probe nach der klassischen fokussierten Rastermethode.
   3. Wählen Sie die Schätzmethode , um die beste Bestimmung des Kontaktpunkts basierend auf der Qualität der gemessenen Kraftkurven zu erhalten, die bei der Optimierung der Datenanalyse empirisch ermittelt werden muss. Verwenden Sie die modellunabhängige Methode, um diesem Protokoll zu folgen.
   4. Passen Sie die Krafteinzugskurve mit einem klassischen Modell an (verwenden Sie klassisches L2 für die Modellanpassung , um diesem Protokoll zu folgen).
      HINWEIS: Model Fit und Contact Estimator sind Parameter, die steuern, wie die Kurven von der Software angepasst werden bzw. wie der Kontaktpunkt in der angepassten Kurve festgelegt wird. Für diese Messungen wurde die klassische Option verwendet, die die Regression der kleinsten Quadrate verwendet. Dieser verarbeitet jeden Punkt mit geringer Kraft auf der Kurve als Versuchskontaktpunkt und passt ein Polynom an den Bereich vor dem Versuchkontaktpunkt an. Es passt dann das entsprechende Kontaktmodell an die gesammelten Krafteindringdaten an. Der Punkt, der die niedrigste Summe der Quadrate ergibt, wird als Kontaktpunkt angenommen. Andere Methoden können auf der Grundlage der Qualität der Kraftkurven^62,63 verwendet werden.
   5. Legen Sie die Anpassung des Modells an die Rückzugskurve fest.
   6. Stellen Sie das Poisson-Verhältnis auf 0,45 ein, wie für Weichteile wie Leber²⁴ empfohlen.
   7. Legen Sie die Anpassung der Kurve mit einem Basisliniengrad von 3 und einem Kontaktgrad von 1 fest. Ändern Sie den Grad der Polynomanpassung basierend auf der Skala der Abweichungen der Kurven vom Modell.
   8. Wählen Sie das Modell aus, das für die Rückzugskurven verwendet wird. Verwenden Sie das Sneddon-Modell , das den Elastizitätsmodul basierend auf Gleichung (1) und Gleichung (2) berechnet:
      (1)
      δ = (2)
      Dabei ist F die Kraft, E der Elastizitätsmodul, v das Poisson-Verhältnis der Probe, δ die Eindringtiefe, a der Kontaktradius und R der Kugelradius^62,63.
   9. Geben Sie den Radius der kugelförmigen Spitze in Mikrometern ein (2,9 μm in diesem Protokoll).
   10. Laden Sie die Spring-Konstante und InvOLS aus den Datendateien, indem Sie das Einlesen aktivieren (aktivieren Sie die Kontrollkästchen).
   11. Klicken Sie auf Fertig stellen.
       HINWEIS: Die analysierten Daten werden in Form von Karten der vertikalen Durchbiegung, Höhe, Adhäsion, Kontaktkraft, Verformung, Adhäsionskraft,^R2-Werte , Steigung, Elastizitätsmodul, Übergangseindringung, Übergangskraft und Kontaktposition dargestellt, die für jede Kraftkurve berechnet wurden (ergänzende Abbildung S3, oben links). Zwei zusätzliche Fenster zeigen Kraftkurven und Rohwerte an (Ergänzende Abbildung S3, oberes rechtes bzw. unteres Feld).
4. Schließen Sie Kraftkurven aus, bei denen sich der Ausleger der Oberfläche des Leberabschnitts falsch näherte. Um diese zu identifizieren, suchen Sie nach Kurven mit hohem Rauschen, abweichenden Formen und/oder unvollständigem Ansatz, wie in Abbildung 3 gezeigt und an anderer Stelle ausführlich erörtert⁴⁶.

Abbildung 3: Beispiele für repräsentative Kraft-Weg-Kurven. (A,B) Repräsentative interpretierbare Kraftkurven für steifere (A; E = 10,5 kPa) und weicher (B; E = 1,78 kPa) Bereiche, die für die Analyse geeignet sind. (C-F) Repräsentative nicht interpretierbare Diagramme, die aufgrund von (C-E) falschem Ansatz oder (F) höherem Rauschen von der Analyse ausgeschlossen werden müssen. Wie in der Legende unter (A) angegeben, zeigen rote Kurven die Annäherung des Auslegers und grüne Kurven den Rückzug des Auslegers. Schwarze Linien zeigen die Anpassung der Rücknahmekurve des Auslegers. Die Steigung der schwarzen Linien entspricht dem Elastizitätsmodul. Die roten und blauen Punkte entsprechen dem Kontaktpunkt bzw. dem Übergangspunkt. Der Kontaktpunkt ist der letzte Berührungspunkt zwischen dem Ausleger und dem Substrat beim Einfahren, während der Übergangspunkt den Übergang des Auslegers vom Anflug zum Einfahren beschreibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Leicht fixierte, 30 μm dicke Leberschnitte von Kontrollmäusen und von Mäusen mit leichter oder fortgeschrittener Fibrose (induziert durch Injektion von_{CCl 4} für 3 Wochen bzw. 6 Wochen bzw.⁴⁹) wurden mit AFM untersucht, wie in diesem Protokoll beschrieben. Kollagenfasern in der Nähe der zentralen Venen wurden für die Messung von Steifigkeitskarten ausgewählt. Bereiche in der Nähe der zentralen Venen, die den Bereichen entsprechen, in denen sich bei CCl_{4-behandelten} Tieren normalerweise Kollagenfasern bilden, wurden in Kontrolllebern analysiert (Abbildung 4A). Die Verteilung der Young-Module war reproduzierbar über verschiedene Kontrollleber und kollagenreiche Bereiche innerhalb eines einzigen Leberabschnitts (Abbildung 4B: linke Violine).

Bei CCl 4-behandelten Tieren zeigten Steifigkeitskarten, die den perizentralen Bereichen von Kollagenablagerungen entsprechen, signifikant höhere Werte der Young-Module im Vergleich zu äquivalenten Bereichen bei Kontrollmäusen (Abbildung 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa Median Elastizitätsmodulwerte für Kontroll- vs. 3-wöchige CCl 4-behandelte Maus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa Median Elastizitätsmodulwerte für Kontrolle vs. 6 Wochen CCl₄ -behandelte Maus; p = 0,02). Darüber hinaus gab es einen signifikanten Anstieg der Werte der Elastizitätsmodule bei längerer CCl4-Behandlung (Abbildung 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa Median-Elastizitätsmodulwerte für 3 Wochen vs. 6 Wochen CCl 4-behandelte Maus; p = 0,04). Dies zeigt eine allmähliche Versteifung der Kollagenablagerungen mit Fibroseprogression und dass AFM-Messungen die Fibrogenese widerspiegeln.

Um die Wirkung einer längeren Lagerung von OCT-eingebetteten Leberschnitten auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagenfasern zu bewerten, haben wir die Steifigkeit von Kollagenfasern in Abschnitten von CCl_{4-behandelten} Mäusen gemessen, die nach dem Schneiden für 2 Wochen oder 3 Monate bei −80 °C auf dem Objektträger gelagert wurden (Abbildung 5). AFM-Messungen zeigten signifikant niedrigere Werte der Young-Moduli in kollagenreichen Bereichen für Abschnitte, die 3 Monate gelagert wurden, verglichen mit denen, die von Abschnitten erhalten wurden, die innerhalb von 2 Wochen nach dem Probenschnitt gemessen wurden (Abbildung 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa Median-Elastizitätsmodulwerte für 2 Wochen vs. 3 Monate Lagerung; p < 0,001). Daher ist es wichtig, die mechanischen Eigenschaften des Lebergewebes kurz nach der Vorbereitung der Abschnitte aus den OCT-eingebetteten Leberlappen zu messen.

Abbildung 4: AFM-Messungen zeigen eine fortschreitende Versteifung kollagenreicher Bereiche, die mit einer längeren CCl_4-Behandlung korreliert. (A) Leberschnitte von Kontrollmäusen und Mäusen, die 3 Wochen oder 6 Wochen lang mit CCl₄ behandelt wurden, wurden verwendet, um die mechanischen Eigenschaften kollagenreicher Bereiche zu messen. Die in den polarisierten Mikroskopiebildern (links) gezeigten Boxed-Areale von Leberabschnitten sind kollagenreiche Scanbereiche (oder entsprechende Regionen in der Kontrollleber), die für AFM-Messungen ausgewählt wurden (30 μm x 100 μm, 10 Pixel x 36 Pixel). Die Elastizitätsmodulkarten mit Farbskalen, die diesen Boxed-Bereichen entsprechen, sind rechts dargestellt, einschließlich Histogrammen der Elastizitätsmodulwerte aus diesen Karten; Inset-Streudiagramme zeigen Werte >10 kPa für jede Bedingung. Die Versteifung der Leber wird als eine allmähliche Rechtsverschiebung in der Histogrammverteilung und eine höhere Häufigkeit von Punkten im Einschubstreudiagramm visualisiert. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Geigendiagramme zeigen die Verteilung der Elastizitätsmodule aus drei Bereichen, die für jede Bedingung gemessen wurden (links) und zusammengefasste Elastizitätsmodulwerte aus allen drei Karten (rechts). Geigendiagramme zeigen den Median (rote Linie), das 25. Perzentil und das 75^. Perzentil (schwarze Linien); Punkte stellen die Mittelwerte einzelner Karten aus den Bereichen 1-3 dar. Die vorgestellten p-Werte wurden mit Hilfe eines Student's t-Tests berechnet, der an Mittelwerten durchgeführt wurde. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; CCl₄ = Tetrachlorkohlenstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Eine längere Lagerung von Leberschnitten führt zu einer Abnahme der Steifigkeit kollagenreicher Bereiche. Leberschnitte (hergestellt von Mäusen, die 2 Wochen lang mit CCl₄ behandelt wurden), die bei −80 °C für 2 Wochen oder 3 Monate gelagert wurden, wurden verwendet, um den Elastizitätsmodul zu messen. Polarisierte Mikroskopiebilder (links) mit Kästchen, die die kollagenreichen Bereiche angeben, die für die AFM-Messung verwendet werden (30 μm x 100 μm, 10 Pixel x 36 Pixel). Entsprechender Young-Modul bildet Farbskalen ab (rechts). Histogramme zeigen die Elastizitätsmodulwerte, die von 4-6 Bereichen in jeder Probe gesammelt wurden; Streudiagramme mit Einschub zeigen Werte >10 kPa für jede Bedingung. Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; CCl₄ = Tetrachlorkohlenstoff. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Verfahren zur Modifizierung des Cantilevers mit einer Melaminharz-Mikroperle. (A) Das gezeichnete Schema veranschaulicht die Befestigung einer kugelförmigen Perle an der Spitze des Auslegers. Eine schrittweise Beschreibung finden Sie in Abschnitt 2, Teil 1, Anbringen einer 5,7-μm-Perle an AFM-Cantilever-Spitze. (B) Mikroskopieaufnahme einer kugelförmigen 5,7 μm Perle, die an der Cantileverspitze befestigt ist, von oben (links) und seitlich (rechts). Maßstabsbalken = 20 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; RT = Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Datenanalyse in AtomicJ. (A) Die Abfolge der Schritte, die beim Öffnen von Steifigkeitskarten in AtomicJ zu befolgen sind. Ein einziger Linksklick auf die Prozesskraftkurven und Kennfelder (x) öffnet den Bearbeitungsassistenten. Dateien können in den Verarbeitungsassistenten geladen werden, indem Sie auf Hinzufügen (y) klicken und die gewünschten Dateien auswählen. Klicken Sie auf Weiter (z), um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. (B) Parameter für die Kurvenanpassung, geeignetes Kontaktmechanikmodell und AFM-Einstellungen, die während der Messung verwendet werden. Die Schritte 1-11 beziehen sich auf die entsprechenden Unterpunkte, die in Protokollschritt 3, Abschnitt 5, Datenanalyse beschrieben sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Überblick über die analysierten Daten in AtomicJ. Die Vorschau der analysierten Daten zeigt Steifigkeitskarten (oberes linkes Fenster), Kraftkurven (oberes rechtes Fenster) und Rohdaten (unteres Fenster). Abkürzung: AFM = Rasterkraftmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll bietet eine schrittweise reproduzierbare Methode zur AFM-Messung von normalem und fibrotischem Lebergewebe der Maus. Die gekoppelte Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision und ermöglicht die Visualisierung von Kollagenfasern aufgrund ihrer Doppelbrechung. Ferner wird eine detaillierte Beschreibung der Analyse der erhaltenen Kraftkurven gegeben. Die AFM-Steifigkeitsmessung kann auf zellulärer Ebene durchgeführt werden, wodurch lokale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften des Lebergewebes aufgrund sich entwickelnder fibrotischer Erkrankungen überwacht werden können. Leberfibrose ist kein homogener Prozess, der das gesamte Organ betrifft. Im Gegenteil, Bereiche kollagenreicher fibrotischer Septen sind mit Bereichen mit geringen oder keinen Kollagenablagerungen durchsetzt. Daher sind Steifigkeitsänderungen spezifisch für die lokale Mikroumgebung und betreffen nur Zellen, die lokal mit durch Verletzungen geschädigten Bereichen in Kontakt stehen. Diese Mikroskala der Steifigkeitsheterogenität zeigt sich auch in den Details der Modulkarten von AFM Young, wo Punkte mit hoher Steifigkeit die Bereiche mit fast normaler Steifigkeit begrenzen. Diese Variation zeigt, dass selbst der Bereich des Kollagennarbengewebes mechanisch nicht homogen ist und eine AFM-Messung auf zellulärer Ebene erfordert (Abbildung 4).

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Messung der Lebersteifigkeit mittels AFM unabhängig von der Leberentnahme, da die gesamten in OCT eingebetteten Leberlappen über einen längeren Zeitraum bei −80 °C gelagert werden können. Sobald das Gewebe jedoch geschnitten ist, empfehlen wir, die Proben innerhalb von ~ 2 Wochen zu messen, da wir eine allmähliche Erweichung der Gewebeabschnitte beobachtet haben, die für längere Zeiträume gelagert wurden (Abbildung 5).

Das mit Polarisationsmikroskopie ausgestattete AFM ermöglicht es, den interessierenden Bereich innerhalb der Leberläppchenstruktur genau zu lokalisieren. Es hat jedoch auch einige Einschränkungen, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. Die hier ermittelten Steifigkeitswerte wurden bei Raumtemperatur gemessen. Wir gehen davon aus, dass die Auswirkungen der Temperatur auf die mechanischen Eigenschaften von Weichgewebe gering sein werden; Dies könnte jedoch einer der Gründe für Unterschiede zwischen den berichteten in vivo Werten der mechanischen Eigenschaften von Lebergewebe und den Werten in dieser Studie sein.

Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die AFM-Analyse von Lebergewebe für bis zu 3 h, was eine leichte Fixierung des Gewebes erfordert. Die milde Fixierung von Gewebeschnitten sowie der Gefrier-Tau-Zyklus werden höchstwahrscheinlich die absoluten Werte des Elastizitätsmoduls beeinflussen. Daher können die berichteten Werte der Young-Module von den In-vivo-Werten abweichen. Weitere Studien sind erforderlich, um das Protokoll für die Messung der absoluten Werte des Elastizitätsmoduls aus Leberschnitten zu optimieren, was durch eine andere Methode zur Fixierung von Lebergewebe erreicht werden kann⁶⁴.

Nichtsdestotrotz beobachteten wir eine zunehmende Steifigkeit kollagenreicher Bereiche in der Leber von Mäusen, die 3 Wochen lang mit CCl₄ behandelt wurden, verglichen mit 6 Wochen. Solche Veränderungen entsprechen dem Fortschreiten der Fibrose bei längerer Verletzung (Abbildung 4) und zeigen, dass relative Unterschiede zwischen verschiedenen Behandlungen unter Verwendung des vorgestellten Protokolls untersucht werden können. Dies stimmt mit den Beobachtungen von Calò et al. überein, die zeigten, dass leicht fixierte Leberabschnitte ähnliche Unterschiede in den Steifigkeitswerten zwischen kollagenreichen und kollagenarmen Bereichen aufweisen wie in frischem Gewebe²⁵.

Wir verwendeten den SD-qp-BioT-TL-10 Cantilever (theoretische Federkonstante ~0,09 N/m), modifiziert mit einer kugelförmigen Spitze von 5,7 μm Durchmesser, um den mechanischen Aufschluss des Lebergewebes während der Messungen zu minimieren. Eine 5,7-μm-Wulst ermöglichte eine ausreichende Vertiefung der Probe, um ihre Steifigkeit zu untersuchen und gleichzeitig ihre Integrität zu erhalten. Eine Perle mit einem kleineren Durchmesser kann nach mehreren Optimierungen verwendet werden, um eine höhere Auflösung in den Steifigkeitsabbildungen zu erzielen, könnte aber zu einer weiteren Überschätzung der Elastizitätsmodulwerte führen (für weitere Details siehe Crichton et ^al.65). Unter Verwendung des spezifizierten Cantilever-Bead-Ensembles konnten wir die Probensteifigkeit in einem breiten Bereich charakterisieren, von Dutzenden von Einheiten Pa bis ~100 kPa.

Sneddons Modell wurde verwendet, um den Elastizitätsmodul aus Kraftkurven abzuleiten, da es die Analyse tiefer Vertiefungen mit kolloidalen Sonden^{ermöglicht 62}. Sneddons Modell leidet im Gegensatz zu Hertz' Modell nicht unter der Einschränkung, dass der Kontaktradius viel kleiner sein muss als der Kugelradius. Sie geht ferner davon aus, dass die Probendicke um ein Vielfaches größer ist als die Eindringtiefe^30,66. In der vorliegenden Studie betrug die Vertiefung ~2 μm mit einer Perlengröße von 5,7 μm und einer Probendicke von 30 μm in kollagenreichen Bereichen; daher war Sneddons Modell angemessen. Andere Modelle⁶³ unter Berücksichtigung der Adhäsionskraft zwischen Spitze und Substrat können für verschiedene Arten von Geweben verwendet werden.

Die Analyse in AtomicJ implementiert Korrekturen für die endliche Dicke der Proben, um den Beitrag eines Substrats zu minimieren, während der Elastizitätsmodul^62,67 abgeleitet wird. Bei der Analyse der erhaltenen Kraftkurven verwendeten wir ein einzelnes Poisson-Verhältnis von 0,45, das zuvor für Weichteilorgane empfohlen wurde²⁴. Diese Näherung hat keinen signifikanten Einfluss auf die berechneten Werte des Elastizitätsmoduls, da die Änderung des Wertes des Poisson-Verhältnisses von 0,4 auf 0,5 nur zu einer 0,893-fachen Abnahme der nach der Sneddon-Gleichung berechneten Elastizitätsmodulwerte führt. Angesichts der vielfachen Unterschiede im Elastizitätsmodul zwischen den verschiedenen Dauern von CCl_{4-Behandlungen} sind die Fehler, die durch die Annäherung an das Poisson-Verhältnis entstehen, nur marginal.

Wir verwendeten Rückzugskurven, um Steifigkeitswerte zu berechnen, da wir eher an der elastischen Reaktion des Gewebes auf die Belastung durch den Ausleger als an der plastischen Reaktion auf den Eindruck⁶⁸ interessiert waren. Aufgrund der viskoelastischen Reaktion des Weichgewebes können passende Rückzugskurven den Elastizitätsmodul überschätzen, was berücksichtigt werden sollte. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass die Datenanalyse mit Annäherungskurven ähnliche Trends bei den Steifigkeitswerten zwischen fibrotischen und Kontrollbereichen ergibt, obwohl die absoluten Werte entsprechend niedriger sind (Daten nicht gezeigt).

Bei der Optimierung des Protokolls identifizierten wir mehrere Schritte, die für die Reproduzierbarkeit der Messungen entscheidend sind. Zunächst ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Perle bei der Befestigung am Ausleger ungefähr in der Mitte der durchscheinenden Spitze befindet. Dies verhindert eine mögliche mechanische Unwucht beim Eindringen. Zweitens ist es während der Leberfixierung mit PFA notwendig, die Zeitgrenzen für das Auftauen und die Fixierung strikt einzuhalten. Eine Änderung des Zeitpunkts dieses Schritts kann die mechanischen Eigenschaften von Gewebeschnitten stark beeinträchtigen. Drittens muss der Ausleger wiederholt mit kontinuierlicher Überwachung und Eingabe gleichzeitiger Temperaturwerte kalibriert werden, um Artefakte in den Steifigkeitswerten aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Schließlich sollte ein einzelner Leberabschnitt nicht länger als 3 h nach der Präparation gemessen werden, da überlagertes PBS über längere Zeiträume verdunsten kann. Die Leser können sich auf die Tabelle zur Fehlerbehebung (Tabelle 3) beziehen, um Probleme zu lösen, die während der AFM-Messung aufgetreten sind und auch ausführlich in Norman et al.46 diskutiert werden.

Tabelle 3: Anleitung zur Fehlerbehebung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare AFM-Sondierung von Lebergewebe. Es hat das Potenzial, Informationen über die Entwicklung und eventuelle Rückbildung fibrotischer Lebererkrankungen auf mikroskopischer Ebene zu liefern und kann zur Entwicklung von Therapien beitragen, die auf fibrotische Narbenregionen abzielen, die während des Fortschreitens einer chronischen Lebererkrankung gebildet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AFM-Kopf	Bruker	JPK nanowizard 3
Kameras	Andor	Zyla 5.5 USB (sCMOS, wassergekühlt)
	Die Bildgebungsquelle	S/N:12310015
Cantilever	SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensoren,	S/N:73750F05
Kryotom	Leica	CM1950
Epoxidharzkleber (lange Verarbeitungszeit)	Bison Epoxid Universal
Melamin Kügelchen; Durchmesser, 5,7 μm	Mikropartikel, GmbH	MF-R-5.7
Mikroskop	Olympus	IX81
Hydrophob  Objektträgermarkierer	SuperHT	PAP PEN
Software	JPK nanowizard  v6.1.151
	AtomicJ v2.3.1
Superfrost Objektträger	Thermoscientific	Ref. Nr. J1800AMNZ
System	Ubuntu 14.04.5 LTS
Steuerung der Schwingungsisolierung Einheit		Tablestable AVI-200-S