Methodenartikel

Synthese von Stimuli-responsiven Nanogelen mittels wässriger Ein-Schritt-Vernetzung und Co-Nanopolymerisation

DOI:

10.3791/63981

⸱

24. Januar 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry, Molecular Sciences Research Hub, Imperial College London

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Nanogele sind eine hervorragende und vielseitige Nanopartikelplattform für die Verabreichung von Biologika. Stimuli-responsive polymere Nanogele auf Poly(ethylen)-glykol-Basis, die in der Lage sind, proteinbasierte Nutzlasten zu verkapseln, wurden unter Verwendung einer einstufigen Vernetzungs-Co-Nanopolymerisationsstrategie unter wässrigen Bedingungen synthetisiert. Die optimale Herstellung und Charakterisierung dieser neuartigen Nanopartikel wird hier vorgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanogele, die aus vernetzt-polymeren Nanopartikeln bestehen, wurden aufgrund ihrer vielseitigen Bottom-up-Synthese und Biokompatibilität für die Verabreichung zahlreicher chemischer und biologischer Therapeutika entwickelt. Obwohl bisher verschiedene Methoden für die Nanogelsynthese eingesetzt wurden, ist dies nur sehr wenigen ohne den Einsatz aggressiver organischer Lösungsmittel oder hoher Temperaturen gelungen, die die Integrität der biologischen Nutzlast beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu erreicht die hier vorgestellte Methodik die Synthese von unter 100 nm großen, proteinbeladenen Nanogelen unter milder Reaktionsbedingungen. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur nicht-kovalenten Verkapselung von proteinbasierten Nutzlasten in Nanogelen vor, die mit einer wässrigen, einstufigen, vernetzenden Copolymerisationstechnik synthetisiert wurden. Bei dieser Technik binden wir zunächst eine proteinbasierte Nutzlast elektrostatisch an ein kationisches quartäres Ammoniummonomer und vernetzen und copolymerisieren es gleichzeitig mit Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin zu Nanogelen, die die Proteinnutzlast einschließen. Die Größe und der Polydispersitätsindex der Nanogele werden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) bestimmt, während die Oberflächenmorphologie mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestimmt wird. Die Masse des in Nanogelen eingeschlossenen Proteins wird durch Berechnung der Verkapselungseffizienz bestimmt. Darüber hinaus wird die Fähigkeit der Nanogele zur kontrollierten Freisetzung über den allmählichen Abbau von redoxresponsiven Strukturelementen auch in Bioreduktionsassays bewertet. Wir stellen Beispiele für Nanopartikel-Optimierungsdaten zur Verfügung, um alle Vorbehalte der Nanogelsynthese und -charakterisierung mit dieser Technik zu demonstrieren. Im Allgemeinen wurden einheitlich große Nanogele mit einer durchschnittlichen Größe von 57 nm und einem Polydispersitätsindexwert von 0,093 erhalten. Es wurde ein hoher Verkapselungswirkungsgrad von 76 % erreicht. Darüber hinaus zeigten die Nanogele eine kontrollierte Freisetzung von bis zu 86% des verkapselten Proteins durch allmählichen Abbau neuer Redox-responsiver Komponenten in Gegenwart von Glutathion über 48 Stunden.

Einleitung

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Nanogele sind dreidimensionale, submikrometergroße Hydrogele mit vernetzten Polymernetzwerkstrukturen, die große Mengen an Flüssigkeiten in ihrer Kernhülle halten können, ohne deren morphologische Integrität zu beeinträchtigen1. Im Allgemeinen werden Nanogele durch Polymerisation von funktionellen Monomeren durch physikalische oder chemische Vernetzung in heterogenen kolloidalen Systemen, wie z. B. inversen Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen 2,3, synthetisiert. Amphiphile Copolymere können sich in wässriger Umgebung selbst zu nanoskaligen Strukturen zusammenfügen. Sie müssen jedoch mit chemischen Vernetzungsstrategien stabilisiert werden, die Disulfide oder Amid-basierte Kopplung beinhalten, Click-Chemie oder können physikalisch induziert (hydrophobe, elektrostatische oder Wasserstoffbrückenbindungsstrategien) oder photoinduziert sein4. Unter diesen Strategien wurde die physikalische Selbstorganisation von Polymeren, gefolgt von chemischer Vernetzung, als erfolgreiche Nanogel-Herstellungstechnik berichtet5. Während das erste Nanogel in den 1990er Jahren von Vingradov et al.6, Akiyoshi et al.7 und Lemieux et al.8 eingeführt wurde, wurde in letzter Zeit eine Vielzahl von intelligenten Nanogelen entwickelt und erforscht, die sowohl aus natürlichen als auch aus synthetischen Polymeren für verschiedene biomedizinische Anwendungen bestehen9.

Nanogele besitzen ein umfangreiches Ladungsrückhaltevermögen, eine große Oberfläche, In-vivo-Stabilität sowie anpassbare chemische und mechanische Eigenschaften10. Die Synthese von Nanogelen ist ebenfalls skalierbar und kann wässrig sein. Darüber hinaus macht der erhöhte Wassergehalt der Nanogele sie zu effektiven Trägern empfindlicher biologischer Nutzlasten11. Darüber hinaus kann die große Oberfläche mehrere Biokonjugationsanforderungen erfüllen, wodurch das Anbringen von Targeting-Modalitäten ermöglicht wird, um ein aktives Targeting zu ermöglichen. Insbesondere die Vielseitigkeit des Nanogel-Designs ermöglicht die Verwendung einer breiten Palette von Stimuli-responsiven Monomeren, die eine präzise Kontrolle ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ermöglichen9. Diese einzigartige Ingenieurbarkeit ermöglicht die rationale Verbesserung des Nanogeldesigns, die mit herkömmlich verwendeten Liposomen, Mizellen oder Polymerosomen nur schwer zu erreichen ist 12,13. Durch die Integration von stimuli-responsiven Einheiten in speziell entwickelte Monomere können Nanogele so konstruiert werden, dass sie die kontrollierte Freisetzung ihrer Nutzlast als Reaktion auf verschiedene physiologisch relevante Reize wie pH-Wert, Redoxbedingungen, Enzyme usw. auslösen.9,14. Solche intelligenten Nanogele sind nützlicher als herkömmliche Nanogele, da sie eine überlegene Stabilität für eine verlängerte Durchblutung besitzen und physiologische Bedingungen aushalten können, um die Integrität ihrer Fracht aufrechtzuerhalten und ihre kontrollierte Freisetzung an den gewünschten Zielstellen zu vermitteln15. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit haben Nanogele in der Biomedizin an Bedeutung gewonnen, mit bemerkenswerten Fortschritten bei der Entwicklung von stimuli-responsiven Nanogelen für zahlreiche theranostische und diagnostische Anwendungen 2,16,17.

Biologika können eine Kategorie von pharmazeutischen Produkten darstellen, die aus Proteinen, Peptiden und/oder Nukleinsäuren bestehen, und haben aufgrund ihrer bemerkenswerten Selektivität die therapeutische Landschaft revolutioniert und sind damit zur am schnellsten wachsenden Klasse von Therapeutika geworden18. Der wachsende Markt für solche Therapeutika zeigt sich in der Tat in dem steilen Anstieg ihrer Zulassung durch die US-amerikanische Federal Drug Association (FDA), wo Biologika im Jahr 2023 ~40 % der gesamten Arzneimittelzulassungen ausmachten19. Zusätzlich zu ihrer Spezifität und Wirksamkeit haben die rasche Entdeckung neuartiger Wirkstoffziele, effizientere Bioengineering-Prozesse und ein besseres Wissen über den Verbleib dieser Therapeutika in vivo zu ihrem verstärkten Einsatz geführt20. Zu den traditionellen Biologika gehören interferierende RNA, Ersatzproteine, Zytokine und Hormone, die normalerweise mit rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden21. Seit der Zulassung von humanem rekombinantem Insulin im Jahr 1982 wurden Biologika für viele Erkrankungen entwickelt, darunter Krebs (z. B. Trastuzumab, Avelumab), entzündliche Darmerkrankungen (z. B. Adalimumab, Certolizumab) und seltene genetische Krankheiten (z. B. Mipomersan, Myozym, Aldurazym, Fabrazym)21. Während die hohe Spezifität der Wechselwirkungen von Biologika mit ihren Zielmolekülen theoretisch alle Off-Target-Effekte ausgleichen sollte, sind bei ihrer Verwendung in Bezug auf unerwünschte Nebenwirkungen mehrere klinische Bedenken aufgetreten22. Diese Nebenwirkungen können in zwei Kategorien eingeteilt werden, darunter übertriebene Pharmakologie (Überstimulation der Ziele) und Immunogenität. Darüber hinaus schränken ihre kurzen Halbwertszeiten, ihre begrenzte Bioverfügbarkeit, ihre Proteaseschäden, ihre kurze Haltbarkeit und ihre kostspieligen Produktionsprozesse ihren therapeutischen Nutzen ein21. Herkömmliche Methoden zur Milderung dieser Probleme beinhalten eine kovalente Modifikation dieser Biologika, die ihre Funktion und damit ihre Wirksamkeit beeinträchtigen kann23. Alternativ kann der nanomedizinische Ansatz zur Verkapselung therapeutischer Nutzlasten zahlreiche Vorteile für pharmakologische Eigenschaften mit sich bringen, vor allem das passive Targeting auf die entzündete Stelle über den EPR-Effekt (Enhanced Permeation and Retention)24. Zu den weiteren Vorteilen, die mit Nanopartikeln in Verbindung stehen, gehören verlängerte Zirkulationszeiten, eine geringere Clearance-Rate, eine größere Formulierungsflexibilität, eine verbesserte Gefäßpermeation und eine verbesserte zelluläre Aufnahme25. Während derzeit eine Vielzahl von Nanopartikelformulierungen für die Bereitstellung biologischer Nutzlasten untersucht wird, können nur wenige die Multifunktionalität von Nanogelen emulieren. Tatsächlich übertreffen Nanogele die Belastbarkeit, die liposomale und mizellenbasierte Nanopartikel erreichen, und sie weisen eine höhere kolloidale Stabilität auf als die meisten anorganischen Nanopartikel. Als solche stellen Nanogele eine wertvolle Plattform für die Verabreichung verschiedener biologischer Therapeutika dar.

Wir haben bereits erfolgreich ein antioxidatives Enzym in neuartigen Matrix-Metalloproteinase-responsiven vernetzten polymeren Nanogelen geliefert, bei denen die verwendete milde Verkapselungsstrategie die Bioaktivität des Proteins bei der Freisetzung aufrechterhielt26. In dieser Arbeit demonstrieren wir die optimierte Synthese von Redox-responsiven Nanogelen für die Abgabe von proteinbasierten Nutzlasten. Insbesondere ermöglicht die Synthesemethode die Nanogelsynthese unter milden Bedingungen, um die gewünschte Nutzlast ohne den Einsatz von aggressiven organischen Lösungsmitteln oder hohen Temperaturen zu verkapseln. Wir nutzten die Redoxhomöostase in der intrazellulären Umgebung, um die Freisetzung der verkapselten Nutzlast zu regulieren27,28. Typischerweise steuert das natürlich reichlich vorhandene Antioxidans Glutathion (GSH) die extrazellulären und intrazellulären Redoxpotentiale, wobei seine Konzentration zwischen 2-20 μM und 1-10 mM bzw.29,30 liegt. Bisher wurde über zahlreiche redoxempfindliche Nanopartikel berichtet, was dies zu einer bewährten und zuverlässigen Strategie macht, um eine kontrollierte Freisetzung von Medikamenten in vivo zu ermöglichen 27,28. In der Tat wurden Disulfidbindungen in polymeren Nanomaterialien unter Verwendung von disulfidhaltigen Vernetzern31,32, der Selbstorganisation biologisch abbaubarer Polymere aus disulfidhaltigen Monomeren33 und redoxresponsiven Polymerprodrugs oder Arzneimittel-/Polymerkonjugaten34,35 installiert. Daher wird in dieser Studie der Einbau eines einzigartigen, hochgradig GSH-sensitiven Disulfidvernetzers in die polymeren Nanopartikel untersucht, der die kontrollierte Freisetzung einer verkapselten Proteinnutzlast ermöglicht.

In dieser Studie konzentrierte sich das Nanogel-Design auf die folgenden Kriterien, um die Spezifität und die Nutzlastabgabe zu berücksichtigen: geringe Größe (~100 nm) und eine gleichmäßige Größenverteilung (Polydispersitätsindex (PI)<0,3), um eine effiziente Penetration des Endothels und In-vivo-Stabilität zu gewährleisten27; effiziente Verkapselung der Proteinnutzlast und kontrollierte Freisetzung der Nutzlast als Reaktion auf GSH. Wir berichten über die Synthese von GSH-responsiven vernetzten Nanogelen, die homogene Nanopartikel mit einer Größe von unter 100 nm mit einer Verkapselungseffizienz von 76% der gewünschten Proteinnutzlast zeigten.

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Protokoll

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1. Synthese von Redox-responsiven Vernetzern

  1. 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid (44,79 mg, 0,270 mmol) und 0,063 ml Triethylamin zu 3 ml wasserfreiem Dichlormethan zugeben und 20 Minuten lang unter einem inerten N2 -Gas in einem 25-ml-Rundkolben mischen lassen.
  2. 4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontandisäuredi-N-succinimidylester (100 mg, 0,045 mmol) in 1 ml wasserfreiem Dichlormethan auflösen und in den Kolben geben.
  3. 4 ml wasserfreies Dichlormethan werden in den Kolben gegeben. Den Reaktionskolben in Alufolie einwickeln und unter N2 bei Raumtemperatur umrühren lassen.
  4. Bestätigung der Produktbildung durch Dünnschichtchromatographie. Stellen Sie sicher, dass das Ausgangsmaterial korrekt ist, und bestätigen Sie gleichzeitig die Produktbildung auf diese Weise.
    1. Die Dünnschichtchromatographie ist eine affinitätsbasierte Methode, mit der gewünschte Verbindungen aus dem Reaktionsgemisch getrennt werden. Verwenden Sie hier die hochpolare und adsorbierende Kieselsäureplatte als stationäre Phase. Die Ausgangsmaterialprobe und die Reaktionsgemischprobe auf ein Ende der Kieselsäureplatte aufleuchten und senkrecht in ein geschlossenes Glasbecherglas mit dem Eluenten (mobile Phase: 5 % Methanol: Dichlormethan) legen.
    2. Durch Kapillarwirkung bewegt sich die mobile Phase auf der Kieselsäureplatte nach oben und die Probenverbindungen wandern je nach ihrer Affinität zur stationären und mobilen Phase über unterschiedliche Entfernungen. Wenn die Lösungsmittelfront 3/4 der Platte durchquert hat, entfernen Sie die Platte und trocknen Sie sie. Die getrennten Verbindungen erscheinen als Flecken auf der Platte. Quantifizieren Sie den Retentionsfaktor (Rf) der gewünschten Verbindung als die von der Verbindung zurückgelegte Strecke/die von dem Lösungsmittel zurückgelegte Strecke. Hier betrug Rf des Produkts 0,35. Zur Visualisierung der Flecken kann UV-Licht oder Färbung (Kaliumpermanganat) verwendet werden.
  5. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert und mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt (isokratisches Gemisch aus 5 % Methanol: Dichlormethan)36. Das Reaktionsgemisch wird auf die Oberseite einer mit Siliziumdioxid gefüllten Glassäule aufgebracht (stationäre Phase) und dann mit dem Lösungsmittelsystem eluiert (mobile Phase)36. Sammeln Sie alle Fraktionen und testen Sie sie mit DC, um die Produktfraktionen anhand des zuvorbestimmten Rf-Werts zu unterscheiden.
  6. Die gereinigten Fraktionen werden durch Verdampfen des Lösungsmittels mit einem Rotationsverdampfer (Temperatur: 40 °C) konzentriert und der Vakuumdruck auf Atmosphärendruck eingestellt, um zuerst das niedrigsiedende Dichlormethan zu entfernen. Wenn der Gehalt des Lösungsmittels nicht mehr abnimmt, wird der Vakuumdruck auf 337 mbar eingestellt, um Methanol zu entfernen und ein blassgelbes Öl zu erhalten, das dann einer weiteren Charakterisierung unterzogen wird, um die Produktbildungzu bestätigen 37.
  7. Führen Sie eine Fourier-Transformations-Infrarot-Analyse (FT-IR)38, eine1-H-NMR (in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO-d 6))39, eine 13-C-NMR39 und eine matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Time-of-Flight-Analyse (MALDI-ToF)40 durch, um die Produktbildung zu bestätigen, bevor Sie die nächsten Schritte durchführen.
    1. Für die FT-IR-Analyse laden Sie 1 mg des Öls auf das Gerät, um die Spektren zu erhalten.
    2. Für NMR-Analysen 10 mg des Produkts in 0,75 ml des entsprechenden NMR-Lösungsmittels wieder auflösen, in ein NMR-Röhrchen umfüllen und dicht verschließen, um ein Auslaufen zu verhindern. Laden Sie die Probe auf das NMR-Instrument, woraufhin die Spektren39 erhalten werden.
    3. Für die massenspektrometrische Analyse 1 mg des Produkts in einem Fläschchen verschließen, in DMSO auflösen und auf das Gerät laden.
      HINWEIS: Die Infrarotanalyse liefert Informationen über die wichtigsten funktionellen Gruppen im gewünschten Produkt, nämlich die Carbonylabschnitte (C=O), die durch den scharfen Peak bei 1650 cm-1 identifiziert werden, zeigen die Bildung der Amidbindung an, wodurch die Produktbildung hervorgehoben wird. Die 1H NMR und die 13C geben Aufschluss über die chemischen Umgebungen und können somit über die Identifizierung der in der Verbindung vorhandenen chemischen Umgebungen zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung des gewünschten Produkts verwendet werden. Schließlich kann durch den Einsatz von Massenspektrometrie die genaue Masse des gewünschten Produkts überprüft werden.

2. Testspaltung des Disulfidvernetzers mit Glutathion

  1. Inkubieren Sie den Disulfidvernetzer (bis zu einer Endkonzentration von 4,55 mg/ml) mit dem Reduktionsmittel Glutathion (final [GSH]: 10 mM) auf ein Endvolumen von 1 mL für 24 h in einem 1,5 mL Glasfläschchen.
  2. Zur Bestätigung der Spaltung des Disulfid-Linkers ist das Fläschchen zur MALDI-ToF-Analyse einzureichen 26,40.

3. Redox-responsive Nanogelsynthese

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Glaswaren, die für die Reaktion verwendet werden sollen, staubfrei sind, indem Sie sie mit gefiltertem (0,20 μm) deionisiertem Wasser waschen und anschließend mit Druckluft trocknen, die über den Druckluftanschluss an der Seite des Abzugs zugänglich ist. Befestigen Sie eine sichere Düse am Druckluftauslass, um die Zugänglichkeit zu erleichtern. Halten Sie das Fläschchen fest und setzen Sie die Düse darin ein. Aktivieren Sie die Druckluft und geben Sie einen kontrollierten Strahl in das Fläschchen ab. Beobachten Sie den Prozess, um eine effektive Trocknung zu gewährleisten, und prüfen Sie, ob noch Verunreinigungen oder Feuchtigkeit vorhanden sind.
  2. Bereiten Sie ein 10-ml-Glasfläschchen vor, indem Sie es mit deionisiertem Wasser füllen und den Kolben mit einem Gummiseptum verschließen. Desoxygenieren Sie das Wasser, indem Sie N2 mindestens 30 Minuten lang durchsprudeln, bevor Sie die Reaktion starten. Füllen Sie dazu einen Ballon mit N2 -Gas und befestigen Sie eine Nadel an dem Ballon; Legen Sie es auf das Septum und stechen Sie mit der Nadel in das Gummiseptum und lassen Sie N2 fließen. Eine Austrittsnadel wird am Kolben befestigt, um einen konstanten Fluss von N2 zu gewährleisten.
  3. Lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA; 2 mg, 30 nmol) oder Cy7-markiertes BSA (2 mg, 30 nmol) in 1 ml sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf und geben Sie es in ein anderes sauberes 10-ml-Glasfläschchen.
  4. [2-(Acryloyloxy)ethyl]trimethylammoniumchlorid (AETC)-Lösung (12,00 mg/10,86 μL, 0,060 mmol) in den Kolben geben und mit einem weiteren Gummiseptum verschließen. Stellen Sie sicher, dass das Reaktionsgemisch unter einem konstanten Strom von N2 -Gas gehalten wird, und rühren Sie 30 Minuten lang.
  5. Lösen Sie Acrylamid (9,21 mg, 0,13 mmol) in 1 ml sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser und geben Sie es zu der Mischung in der Durchstechflasche.
  6. Lösen Sie den Disulfidvernetzer (4,44 mg, 0,004 mmol) in 1 ml entionisiertem Wasser auf und geben Sie es zu der Mischung in der Durchstechflasche. Spülen Sie das Gemisch 20 min lang mit N2 Gas.
  7. Löse Natriumdodecylsulfat (2 mg, 0,007 mmol) in 1 mL sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf und gib es über eine N2 gasgespülte Spritze zu der Mischung und rühre die Mischung 30 Minuten lang.
    HINWEIS: Durch das Spülen der Spritze mit N2 minimieren wir die Exposition des Reaktionsgemisches gegenüber Sauerstoff in der Atmosphäre, der die radikalische Polymerisationsreaktion hemmen kann.
  8. N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (1,5 μL, 0,010 mmol) zugeben und das Reaktionsgemisch 3 min unter N2 -Gas sauerstoffentziehen lassen.
  9. Ammoniumpersulfat (1 mg, 0,004 mmol) in 1 mL sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auflösen und zur Reaktionsmischung hinzufügen. Es ist darauf zu achten, dass N2 -Gas 10 min lang durch das Reaktionsgemisch sprudelt.
    ANMERKUNG: Wird der N2-Zugabeschritt weggelassen, so ist es wahrscheinlich, dass sich weiße Partikel im Reaktionskolben bilden. Dabei handelt es sich um größere Partikel und/oder Aggregate, die jede weitere Charakterisierung verwirren können.
  10. Den Kolben unter einer Atmosphäre von N2 verschließen und 3 h und 30 min bei Raumtemperatur rühren lassen.
  11. Um die Reaktion zu beenden, wird die Versiegelung aus dem Kolben entfernt und das Reaktionsgemisch mindestens 10 Minuten lang gerührt. Dadurch würde das Reaktionsgemisch atmosphärischen Konzentrationen vonO2-Gas ausgesetzt, das dann alle verbleibenden Radikale im Reaktionsgemisch löschen würde. Die Reaktion endet, wenn die Mischung ein klares blaues opaleszierendes Aussehen annimmt.
  12. Um die Nanogele zu reinigen, geben Sie das Reaktionsgemisch in eine 15-ml-Zentrifugalfiltereinheit (100 kDa MWCO) und fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Zentrifugaleinheit zu füllen. Das Reaktionsgemisch bei 1000 x g 10 min zentrifugieren. Dadurch werden alle nicht umgesetzten Chemikalien (oder unverkapselte Nutzlast), die kleiner als 100 kDa sind, entfernt und die Nanogelprobe konzentriert.
  13. Sobald der Wasserstand in der Zentrifugaleinheit abnimmt, fügen Sie 2 ml deionisiertes Wasser hinzu, um die Nanogelprobe zu verdünnen, und zentrifugieren Sie, um das Produkt zu konzentrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
  14. Lagern Sie die Probe bei 2-8 °C, um den Abbau des verkapselten Proteins zu verhindern.
  15. Durchführung einer FT-IR- und 1H-NMR-Analyse (in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO-d 6)), um die Polymerisation zu bestätigen39,41. Zur Vorbereitung der Probe gefriertrocknen Sie 1 ml der Nanogellösung in einem 1,5-ml-Fläschchen. Bei der Gefriertrocknung wird die Probe eingefroren und dann mit einem Vakuum das gefrorene Lösungsmittel durch Sublimation entfernt, wobei ein pulverförmiger Rückstand zurückbleibt. Nach der Gefriertrocknung die Probe wieder in dem entsprechenden NMR-Lösungsmittel auflösen, in ein NMR-Röhrchen umfüllen und fest verschließen. Laden Sie die Probe auf das NMR-Gerät, wie zuvor beschrieben39. Für die FT-IR-Analyse sollte 1 mg des trockenen Pulvers auf das Gerät geladen werden, um die Spektren zu erhalten.

4. Morphologische Charakterisierung von Nanogeln

  1. Dynamische Lichtstreuung (DLS)
    HINWEIS: Der hydrodynamische Durchmesser (nm), der Polydispersitätsindex (PI) und das Zetapotenzial wurden bei 25 °C, 632,8 nm Laserwellenlänge und 173° Signaldetektor mit einem DLS-Gerät gemessen. Jeder Lauf umfasste 25 Sub-Scan-Zyklen.
    1. Hydrodynamische Größenmessung (nm)
      1. Bereiten Sie eine Küvette oder eine gefaltete Einweg-Kapillarzelle vor, indem Sie sie mit gefiltertem entionisiertem Wasser reinigen. Blasen Sie Druckluft in die Küvette (geeignet sowohl für DLS- als auch für Zetapotentialmessungen), um sicherzustellen, dass sie frei von großen Staubpartikeln ist.
      2. Füllen Sie die Küvette mit mindestens 50-100 μl der Probe und verdünnen Sie sie mit 750-1000 μl gefiltertem deionisiertem Wasser. Wenn Sie eine Zetapotentialküvette verwenden, stellen Sie sicher, dass die Küvette mit Probe gefüllt wurde, ohne dass sich Blasen bilden, die die Messungen stören können.
      3. Legen Sie die Küvette in das DLS-Instrument und vergewissern Sie sich, dass sie richtig eingesetzt wurde. Öffnen Sie dazu die Abdeckung des Probenfachs des DLS-Geräts. Halten Sie die Küvette an den oberen Rändern, um Fingerabdrücke auf den optischen Fenstern zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Küvette richtig im Küvettenhalter sitzt und dass sie waagerecht und mit dem Strahlengang des Instruments ausgerichtet ist. Schließen Sie den Probenraum, um Störungen durch das Umgebungslicht zu vermeiden.
        HINWEIS: Das Verdünnungsmedium wird mit einem Spritzenvorsatzfilter mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert.
      4. Klicken Sie hier, um die Partikelgrößenmessung in der entsprechenden DLS-Maschinensoftware zu starten.
      5. Wählen Sie die Ergebnisse aus, die der Probe entsprechen, um den z-Durchschnitt (durchschnittliche Partikelgröße), den durchschnittlichen PI, die Kilozahlen pro Sekunde (kcps), das Zetapotenzial und die relevanten Grafiken zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Korrelationsfunktion eine glatte sigmoidale Kurve aufweist, da dies auf eine einheitliche Stichprobe hindeutet.
      6. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, entfernen Sie die Küvette aus dem DLS.
  2. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie 10 μl der Nanopartikellösung (0,077 mg/ml) auf kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter geben. 1 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
    2. Waschen Sie die Gitter mit gefiltertem deionisiertem Wasser und färben Sie sie 2 Minuten lang mit 5 μl gefiltertem 1%igem Uranylacetat in Wasser.
    3. Nachdem Sie das überschüssige Färbemittel mit Filterpapier eingeweicht haben, trocknen Sie die Gitter über Nacht bei Raumtemperatur. Nehmen Sie am nächsten Tag TEM-Bilder mit 45.000-facher Vergrößerung mit einer Hellfeldkamera auf.
    4. Verwenden Sie für die Bildbearbeitung die mitgelieferte Software (Auflösung: 2048 x 2048 Pixel).

5. Quantifizierung des in den Nanogelen verkapselten Proteins (BSA) unter Verwendung eines Mikro-Bicinchoninsäure (BCA)-Assays

  1. Generieren Sie gemäß dem microBCA-Assay-Protokoll (auf der Website des Herstellers angegeben) eine Standardkurve basierend auf einer vordefinierten Proteinkonzentration42.
  2. Nach ihrer Synthese reinigen Sie die proteinverkapselnden Nanogele mit 15 mL Zentrifugalfiltereinheiten mit 100 kDa MWCO (1000 x g, 10 min), wie in den Schritten 3.12-3.14 beschrieben.
  3. Sammeln Sie das Filtrat und analysieren Sie es mit dem microBCA-Assay (Protokoll auf der Website des Herstellers verfügbar). Messen Sie die Extinktion bei 562 nm mit einem Plattenlesegerät. Da diese Messung mit der Konzentration des unverkapselten Proteins korreliert, ist die Masse des verkapselten Proteins zu bestimmen. Um den Verkapselungswirkungsgrad (EE) % zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-1

6. Quantifizierung der Proteinfreisetzung aus Nanogelen in Gegenwart von Glutathion

  1. Inkubieren Sie 200 μl 5 mg/ml Cy7BSA-beladene Nanogele mit 200 μl 10 mM Glutathion (GSH) in den 0,5 mL Zentrifugalfiltereinheiten (100 kDa MWCO). Stellen Sie die Filtereinheiten in ein Wasserbad, um die Temperatur auf 37 °C zu halten.
  2. Zentrifugieren Sie bei 1000 x g für 3 min alle 10 min für mindestens 1 h - danach alle 2-8 h.
  3. Sammeln Sie das Filtrat und verwenden Sie es für die weitere Analyse. Halten Sie das Volumen des Filtrats in den Zentrifugalfiltereinheiten bei 500 μl, indem Sie mehr entionisiertes Wasser oder PBS hinzufügen.
  4. Messen Sie die Proteinmenge in den Filtraten, indem Sie sich auf eine Standardkurve für Cy7BSA-beladene Nanogele beziehen, bei der die Absorption des fluoreszierenden Proteins mit einem Nanotropfeninstrument bei 750 nm gemessen wurde.
    HINWEIS: Diese Standardkurve kann berechnet werden, indem serielle Verdünnungen von Cy7BSA im Bereich von 0 mg/ml bis 2 mg/ml vorbereitet werden. Die aus dem Nanotropfen erhaltenen Werte können gegen diese Kalibrierkurve interpoliert werden, um die Verkapselungseffizienz zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Synthese und Charakterisierung von Poly(ethylenglykol) (PEG)-disulfiddiacrylat-Vernetzern Der Redox-responsive Vernetzer wurde durch die nukleophile Substitution eines N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Esters durch das 2-Aminoethylmethacrylat über die Bildung einer Amidbindung synthetisiert (Abbildung 1). Die Synthese des benötigten Produkts wurde in erster Linie durch 1H NMR validiert (Ergänzende Abbildung 1), d.h. durch Auflösen der Produktprob...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die wachsende Nachfrage nach zielspezifischen Biologika in der biopharmazeutischen Industrie hat zu einem Bedarf an Technologien geführt, die ihre pharmakologischen In-vivo-Profile verbessern und gleichzeitig ihren schnellen physiologischen Abbau verhindern und unerwünschte Nebenwirkungen ausgleichen können. Vor diesem Hintergrund wird ein einfaches Verfahren zur Synthese von proteinbeladenen Nanogelen beschrieben. Wie im Protokoll angegeben, muss der Redox-responsive Vernetzer ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen. Es gibt keine finanziellen Details zu deklarieren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Imperial College London Department of Chemistry und dem Medical Research Council Institute of Life Sciences für ihre Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemicals2-
(
acryloyloxy)ethyl]trimethylammoniumchlorid solution 		Sigma Aldrich496146
2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid Sigma Aldrich516155
4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,
44,47,50,53-Hexadecaoxa-28,29-dithiahexapentacontandisäuredi-N-succinimidylester 		Sigma Aldrich671630
AcrylamidSigma Aldrich23701
AmmoniumpersulfatSigma Aldrich248614
RinderserumalbuminSigma AldrichB6917
Cy7- markiertes RinderserumalbuminNanocsBS1-S7-1
Deuteriertes DimethylsulfoxidSigma Aldrich547239
DichlormethanSigma Aldrich270997 (wasserfrei) und D65100
GlutathionSigma AldrichG4251
MethanolSigma Aldrich34860
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin Sigma Aldrich411019
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ThermoFisher10010023
NatriumdodecylsulfatSigma Aldrich436143
TriethylaminSigma Aldrich471283
Uranylacetat-AgarWissenschaftlich AGR1260A
Ausrüstung, die für die Synthese und Charakterisierung von Nanogelen erforderlich ist
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten (100kDa MWCO) Merck MilliporeC7715
KameraOlympus Veleta
Kohlenstoffbeschichtete KupfergitterAgar ScientificAGS160
Dialyseschlauch (100 kDa MWCO)Spektrumlabore11405949
Dynamische Lichtstreuung Malvern Zetasizer Nano Ultra
GefriertrocknerLabconcoWZ-03336-01
InfrarotspektroskopieAgilent Cary 630 FTIR
iTEM SoftwareOlympus 
MassenspektrometrieWasserMikromasse MALDI microMX MALDI Q-ToF 
MF-MilliporeTM Membranfilter (0,45/0,2μ Mio. Porengröße)Merck Millipore, UKHAWP04700, GSWP04700 
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher23235
PlattenleserBeckmanCoulter-PARADIGM
Protonen- und Kohlenstoff-13 KernspinresonanzdatenBruker400MHz AV-400 NMR-Spektrometer
Rotationsverdampfer Büchi R-114 Rotary Vap System
Einweg-Nadeln Sterican4665643
Suba-Dichtung  septaSigma AldrichZ124575
TransmissionselektronenmikroskopiePhillips CM 100 TEM 
UV-Vis-SpektralphotometerNanodrop NanodropOne/One C Mikrovolumen 

Referenzen

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