Summary
A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.
Abstract
As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células mesenquimais mesenquimais (MSCs) residentes em músculos esqueléticos, capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica. Juntamente com células-tronco musculares (MuSCs), as FAPs desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparo e regeneração, mantendo e remodelando ativamente a matriz extracelular (ECM). Em condições patológicas, como danos crônicos e distrofias musculares, as FAPs passam por ativação aberrante e diferenciam-se em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando à fibrose e infiltração gordurosa intramuscular. Assim, as FAPs desempenham um papel duplo na regeneração muscular, seja por meio da manutenção da rotatividade do MuSC e da promoção da reparação de tecidos ou contribuindo para a formação de cicatrizes fibrosas e infiltrações de gordura ectópica, que comprometem a integridade e a função do tecido muscular esquelético. Uma purificação adequada de FAPs e MuSCs é um pré-requisito para entender o papel biológico dessas células em condições fisiológicas e em condições patológicas. Aqui, descrevemos um método padronizado para o isolamento simultâneo de FAPs e MuSCs de músculos de membros de camundongos adultos usando a triagem celular ativada por fluorescência (FACS). O protocolo descreve em detalhes a dissociação mecânica e enzimática de células mononucleadas de músculos inteiros dos membros e músculos tibialis anteriores (TA) lesionados. FAPs e MuSCs são posteriormente isolados usando um classificador de células semi-automatizado para obter populações de células puras. Além disso, descrevemos um método otimizado para a cultura quiescente e ativada de FAPs e MuSCs, sozinhos ou em condições de cocultura.
Introduction
O músculo esquelético é o maior tecido do corpo, respondendo por ~40% do peso humano adulto, e é responsável por manter a postura, gerar movimento, regular o metabolismo de energia basal e a temperatura corporal1. O músculo esquelético é um tecido altamente dinâmico e possui uma notável capacidade de adaptação a uma variedade de estímulos, como estresse mecânico, alterações metabólicas e fatores ambientais diários. Além disso, o músculo esquelético se regenera em resposta a lesões agudas, levando à restauração completa de sua morfologia e funções2. A plasticidade muscular esquelética depende principalmente de uma população de células-tronco musculares residentes (MuSCs), também denominadas células satélites, que estão localizadas entre a membrana plasmática de miofibra e a lamina basal 2,3. Em condições normais, os MuSCs residem no nicho muscular em um estado quiescente, com apenas algumas divisões para compensar a rotatividade celular e repor a piscina de células-tronco4. Em resposta à lesão, os MuSCs entram no ciclo celular, proliferam e contribuem para a formação de novas fibras musculares ou retornam ao nicho em um processo de auto-renovação 2,3. Além dos MuSCs, a manutenção homeostática e a regeneração do músculo esquelético contam com o apoio de uma população de células residentes musculares chamadas progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs)5,6,7. As FAPs são células estromamicanas mesenquimais incorporadas no tecido conjuntivo muscular e capazes de diferenciar-se ao longo da linhagem fibrogênica, adipogênica, osteogênica ou condrogênica 5,8,9,10. Os FAPs fornecem suporte estrutural para muSCs, pois são uma fonte de proteínas de matriz extracelular no nicho de células-tronco musculares. As FAPs também promovem a manutenção a longo prazo do músculo esquelético, secretando citocinas e fatores de crescimento que fornecem suporte trófico para a miogênese e crescimento muscular 6,11. Após lesão muscular aguda, as FAPs proliferam rapidamente para produzir um nicho transitório que suporte a integridade estrutural do músculo regenerador e forneça um ambiente favorável para sustentar a proliferação e diferenciação dos MuSCs de forma paracrina5. À medida que a regeneração prossegue, as FAPs são liberadas do músculo regenerativo por apoptose, e seus números gradualmente retornam ao nível basal12. No entanto, em condições que favorecem lesões musculares crônicas, as FAPs substituem a sinalização pró-apoptótica e se acumulam no nicho muscular, onde se diferenciam em fibroblastos e adipócitos produtores de colágeno, levando a infiltrações de gordura ectópica e formação de cicatrizes fibrosas12,13.
Devido à sua multipotência e suas habilidades regenerativas, FAPs e MuSCs foram identificados como alvos prospectivos na medicina regenerativa para o tratamento de distúrbios musculares esqueléticos. Portanto, para investigar sua função e potencial terapêutico, é importante estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para o isolamento e cultura de FAPs e MuSCs.
A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) pode identificar diferentes populações celulares com base em características morfológicas, como tamanho e granularidade, e permite o isolamento específico das células com base no uso de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície celular. Em camundongos adultos, os MuSCs expressam a molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1, também conhecido como CD106)14,15 e α7-Integrin15, enquanto os FAPs expressam o receptor do fator de crescimento derivado da plaqueta α (PDGFRα) e o antígeno de células-tronco 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . No protocolo aqui descrito, os MuSCs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, enquanto os FAPs foram identificados como CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativamente, os camundongos PDGFRαEGFP foram empregados para isolar os FPs como CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventos18,19. Além disso, comparamos a sobreposição entre o sinal fluorescente das células PDGFRα-GFP+ às células identificadas pelo marcador de superfície Sca1. Nossa análise mostrou que todas as células que expressam GFP também foram positivas para o Sca1, indicando que qualquer abordagem pode ser empregada para identificação e isolamento de FAPs. Finalmente, a coloração com anticorpos marcadores específicos confirmou a pureza de cada população celular.
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Protocol
Todos os experimentos em animais realizados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Artrite, Musculoesquelético e Doenças da Pele (NIAMS). Os investigadores que executam este protocolo devem seguir suas diretrizes locais de ética animal.
NOTA: Este protocolo descreve em detalhes como isolar FAPs e MuSCs de músculos tibialis anteriores (TA) lesionados de camundongos adultos masculinos e femininos (3-6 meses) e fornece diretrizes para coculto FAPs e MuSCs. Uma visão geral do procedimento experimental é mostrada na Figura 1. Todas as etapas deste protocolo devem ser executadas em condições estéreis e à temperatura ambiente (RT) a menos que seja especificado o contrário.
1. Configuração do reagente
- Wash Medium (WM): Prepare esta solução adicionando 10% (vol/vol) soro de cavalo e 1x penicilina/estreptomicina à mídia celular F-10 Nutrient Mix do Ham. O WM pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 °C.
- Tampão de Dissociação Muscular (MDB): Prepare este buffer dissolvendo Colagenase II em WM. Se coletar músculos inteiros do membro traseiro, dissolva 1000 U/mL Collagenase II em 10 mL de WM para cada rato (para ser preparado em um tubo cônico de 50 mL). Se coletar músculos TA, dissolva 800 U/mL Collagenase II em 7 mL de WM para cada rato (para ser preparado em um tubo cônico de 15 mL). Para os músculos TA, isso ajudará a visualizar melhor as pelotas celulares e obter um maior rendimento de FAPs e MuSCs. Prepare o MDB fresco antes de coletar os músculos e mantenha-o no gelo até que seja necessário.
- Estoque de solução collagenase II: Prepare esta solução dissolvendo a Collagenase II em solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) para uma concentração final de 1000 U/mL. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,45 μm e alíquota em estoques de 1 mL. Armazene a solução a -20 °C.
- Desabilitar o estoque da solução: prepare esta solução dissolvendo o Dispase em 1x PBS estéril para uma concentração final de 11 U/mL. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,45 μm e alíquota em estoques de 1 mL. Armazene a solução a -20 °C.
- Prepare o meio de cultura do FAP suplementando o DMEM com soro bovino fetal de 10% (vol/vol), penicilina/estreptomicina 1x e 2,5 ng/mL FGF. Armazene o meio a 4 °C.
- Prepare o meio de cultura do MuSC suplementando f10 com soro de cavalo 10% (vol/vol), penicilina/estreptomicina 1x e 2,5 ng/mL FGF. Armazene o meio a 4 °C.
- Prepare o meio de cocultura suplementando o DMEM com soro bovino fetal de 10% (vol/vol), 10% (vol/vol), 1x penicilina/estreptomicina e 2,5 ng/mL FGF. Armazene o meio a 4 °C.
2. Colheita muscular do membro traseiro
- Adicione 2-3 mL de WM em um prato de 6 cm (um prato por rato) e coloque-o no gelo.
- Realizar eutanásia por asfixia: coloque o mouse em uma câmara de CO2 e introduza 100% DE CO2. Use luxação cervical para confirmar a morte.
- Coloque o supino do mouse em uma almofada de dissecção e pulverize-o com 70% (vol/vol) de etanol para evitar contaminação.
- Use fórceps para beliscar o centro da pele da barriga do rato e corte uma abertura de ~1 cm horizontalmente. Segure as bordas da ferida e deskin o rato puxando a abertura em direções opostas para descobrir os músculos por baixo. Exponha um lado do membro traseiro do rato no momento.
- Antes de coletar músculos, remova a gordura intermuscular entre os isquiotibiais e a extremidade proximal do quadríceps. Isso melhorará o isolamento de FAPs e MuSCs.
- Sem danificar o tecido, use fórceps afiados para quebrar e descascar a fáscia para expor os músculos de digitorum longo (EDL) de ta e extensor. Execute a ponta afiada dos fórceps sob os músculos TA/EDL para separar os músculos da tíbia.
- Corte os tendões que prendem o TA/EDL ao tornozelo e, enquanto segura-o com fórceps, corte os músculos com uma tesoura ao longo da linha longitudinal do TA/EDL. Corte os tendões ao redor do joelho para desprender todos os músculos TA/EDL. Coloque os músculos em um prato de 6 cm mantido no gelo.
- Prossiga para isolar os músculos gastrocnemius e soleus cortando todos os tendões no tornozelo e desprendendo os músculos da tíbia e fíbula. Corte ao redor do joelho e transfira os músculos para o prato de 6 cm.
- Retire a fáscia ao redor do quadríceps e separe-a do fêmur, passando a ponta afiada dos fórceps entre o músculo e o osso. Corte os tendões ao redor do joelho e, enquanto segura o quadríceps com fórceps na extremidade distal, corte o resto do músculo cortando ao longo do fêmur. Coloque os músculos no prato de 6 cm.
- Retire os tendões e os músculos remanescentes ao redor do fêmur e transfira-os para o prato de 6 cm. Colete os músculos do membro traseiro em um prato de 6 cm mantido no gelo.
NOTA: Evite danificar os vasos sanguíneos, quando possível, para evitar a formação de aglomerados sanguíneos que possam interferir no isolamento a jusante. Se ocorrer sangramento, borre o vaso excisado imediatamente com uma gaze estéril para absorver o sangue. - Coletar músculos TA, EDL, gastrocnemius, soleus, quadríceps e tendões do membro contralateral.
NOTA: Ao isolar todos os músculos do membro traseiro, não acumule dois ou mais ratos. Se isolar os músculos TA, até três músculos TA podem ser agrupados.
3. Digestão muscular mecânica e enzimática
- Aspire WM a partir do prato de 6 cm e adicione 1-2 mL de MDB para manter os músculos úmidos.
- Pique bem os músculos até obter uma pasta de chorume de tecido bem picado. Para isso, use fórceps para segurar uma extremidade de um pedaço de músculo, em seguida, use um bisturi para rasgar e cortar o músculo até menos apertado.
- Usando uma tesoura, continue cortando o músculo em pequenos pedaços por 1-2 min. Repita esta etapa para cada grupo de músculos até obter uma lama muscular bem picada.
NOTA: Este é um passo muito crítico para maximizar o rendimento de FAPs e MuSCs. Recomenda-se gastar 8-10 min (4-5 min se isolar apenas os músculos TA) nesta etapa para garantir um bom picar muscular. - Transfira os músculos picados de cada rato para o tubo cônico contendo MDB.
- Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 °C com agitação (75 rpm) por 1h. Coloque os tubos horizontalmente ao longo do caminho de agitação e use pesos para manter os tubos submersos na água.
- Descongele 1 mL de estoque de Collagenase II e 1 mL de estoque de desarmes por mouse. Antes de usar, gire o estoque de despase em um rotor de balde balançando a 10.000 x g por 1 min a 4 °C. Use apenas o supernatante.
- Se os músculos inteiros do membro traseiro foram coletados, proceda da seguinte forma:
- Depois de 1h, retire o tubo do agitador e encha-o a 50 mL com WM. Inverta suavemente algumas vezes para garantir a mistura.
- Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 x g por 5 min a 4 °C. Transfira 42 mL de supernaspeso em dois novos tubos (~21 mL em cada tubo) e deixe ~8 mL no tubo original.
- Encha os novos tubos contendo 21 mL do supernatante até 50 mL com WM. Centrifuge as células novamente em um rotor de balde balançando a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todos os supernaciantes e mantenha as pelotas no gelo.
- Adicione 1 mL de estoque de colagenase II e 1 mL de estoque de desarmes no tubo original contendo ~8 mL de MDB.
- Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, resuspense a pelota 10 vezes sem entupimento. Ejetar a solução em direção à parede do tubo, evitando a formação de bolhas. Se ocorrer entupimento durante a ressuspensão, empurre a ponta da pipeta contra a parte inferior do tubo para interromper mecanicamente os pedaços musculares. Prossiga para a etapa 3.9.
- Se os músculos TA foram coletados, proceda da seguinte forma:
- Depois de 1h, retire o tubo do agitador e encha-os a 15 mL com WM. Inverta suavemente algumas vezes para garantir a mistura.
- Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 x g por 5 min a 4 °C. Transfira 13 mL de supernasal em um novo tubo de 15 mL e deixe ~2 mL no tubo original.
- Encha o novo tubo contendo 13 mL do supernascedor até 15 mL com WM. Centrifuge as células novamente em um rotor de balde balançando a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todo o supernatante e mantenha a pelota no gelo.
- Usando uma ponta de pipeta de 1000 μL, resuspenque a pelota no tubo original para cima e para baixo sem entupimento.
- Adicione 1 mL de estoque de Collagenase II e 1 mL de estoque de desarmes no tubo original contendo 2 mL de MDB e encha até 10 mL com WM. Proceda à etapa 3.9.
- Sele os tubos com filme de laboratório e incuba em um banho de água de 37 °C com agitação (75 rpm) por 30 min. Coloque os tubos como na etapa 3.5.
4. Geração de células mononucleadas
NOTA: Se trabalhar com músculos TA coletados em um tubo cônico de 15 mL, transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mL antes de prosseguir com a etapa 4.1.
- Depois de 30 min, remova o tubo do agitador. Aspire e ejete a suspensão muscular através de uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G com sucesso 10 vezes.
NOTA: Ejete suspensão muscular em direção à parede do tubo para evitar bolhas e espuma. Pequenos pedaços de tendões ou cartilagens não digeridos podem entupir a agulha durante as primeiras rodadas de aspiração. Se ocorrer entupimento, use fórceps estéreis para remover o entupimento da ponta da agulha. - Encha cada tubo até 50 mL com WM e inverta suavemente algumas vezes para garantir a mistura.
- Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 x g por 5 min a 4 °C. Transfira supernante para um novo tubo (~42 mL) e deixe ~8 mL no tubo original.
- Encha o novo tubo contendo 42 mL do supernascedor até 50 mL com WM. Centrifuge as células novamente em um rotor de balde balançando a 350 x g por 8 min a 4 °C. Aspire todo o supernatante e mantenha a pelota no gelo.
- Coloque um coador de células de nylon de 40 μm no tubo cônico original de 50 mL contendo 8 mL de WM e pré-molhe o coador de células com 1-2 mL de WM.
- Enquanto segura o coador de células de nylon de 40 μm, use uma pipeta de 10 mL para resuspensar suavemente a pelota 5-10 vezes. Filtre as pelotas através do coador celular de volta para o mesmo tubo para minimizar a perda celular.
- Nesta etapa, certifique-se de que há tubos adicionais com pelotas de célula no gelo. Filtre essas pelotas de volta para o tubo original adicionando 4-5 mL de WM a cada tubo para resumar as pelotas e transferir a solução para o coador de células posicionado no tubo original. Permitir filtragem por gravidade.
- Depois de coletar todas as pelotas no tubo cônico original de 50 mL, enxágue o coador celular com outro 4-5 mL de WM. Use uma pipeta de 1000 μL para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular.
- Encha cada tubo com WM até 50 mL e inverta suavemente algumas vezes para garantir a mistura.
- Centrifugar as células em um rotor de balde balançando a 250 x g por 5 min a 4 °C. Imediatamente aspire todos os supernascedores após centrifugação sem perturbar a pelota.
- Resuspenja a pelota em 600 μL de WM e transfira-a para um tubo de microcentrifuge de 2 mL.
5. Mancha de anticorpo para citometria de fluxo
NOTA: Para cada experimento, configure os seguintes controles: i) controle não manchado, ii) controle de viabilidade para selecionar para a população de células vivas, iii) controles de compensação único manchados para corrigir a repercussão de emissões fluorocromáticas, e iv) controles de fluorescência menos um (FMO) para definir limites de gating, contabilizando a propagação de derramamento. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista completa de controles de coloração.
- Para preparar o controle não manchado, transfira 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífugo de 2 mL contendo 190 μL de WM. Resuspend a suspensão celular e filtro através de um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de tensão celular de 35 μm. Deixe a suspensão filtrar por gravidade.
- Use uma pipeta de 200 μL para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular. Sele com uma tampa e deixe-a no gelo, protegida da luz.
- Prepare a viabilidade, fmo e controles individuais manchados: rotular tubos de microcentrifus de 2 mL e adicionar 190 μL de WM em cada tubo e 10 μL de suspensão celular. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista completa de controles. Adicione anticorpos ao tubo apropriado, dependendo do controle experimental. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre combinação e concentração de anticorpos.
- Transfira o resto da suspensão celular (500 μL) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL (tubo experimental) e adicione os seguintes anticorpos: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotin e α7-Integrin-PE. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre combinação e concentração de anticorpos.
- Misture bem cada tubo para garantir a distribuição uniforme e incubar as células em um agitador rotativo a 4 °C por 45 min protegido da luz.
- Depois de 45 min, encha todos os tubos de microcentrifuus de até 2 mL com WM. Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir a mistura completa. Centrifugar os tubos em uma centrífuga refrigerada com um rotor de ângulo fixo a 250 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernante sem perturbar a pelota.
- Resuspend as células em todos os tubos de microcentrifuuge em 300 μL de WM.
- Adicione anticorpo streptavidin em tubos apropriados. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre combinação e concentração de anticorpos. Misture bem cada tubo para garantir a distribuição uniforme e incubar as células em um agitador rotativo a 4 °C por 20 minutos protegidos da luz. Deixe os tubos restantes no gelo, protegidos da luz.
- Após 20 min, encha tubos de microcentrifusagem contendo anticorpo streptavidina a 2 mL com WM. Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir a mistura completa. Centrifugar os tubos em uma centrífuga refrigerada com um rotor de ângulo fixo a 250 x g por 5 min a 4 °C. Aspire completamente o supernatante e resuspend células em 300 μL de WM.
- Pré-molhada a tampa do coador de células de 35 μm de tubos de fundo redondo de poliestireno de 10 5 mL com 200 μL de WM. Filtrar células dos tubos de controle através dos tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL apropriados. Use uma pipeta de 200 μL para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular. Selar com tampas, deixar os tubos no gelo, e protegê-los da luz.
- Resuspend as células do tubo experimental com um adicional de 200 μL de WM para um total de 500 μL de WM. Pré-molhado uma tampa de coador celular de um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com 200 μL de WM. Transfira a suspensão celular do tubo experimental para o tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e permita filtrar por gravidade.
- Enxágüe o tubo de microcentrifusagem de 2 mL contendo a suspensão experimental da amostra com 300 μL de WM e passe-o através da mesma tampa do coador. Use uma pipeta de 200 μL para coletar todo o líquido da parte inferior do coador celular. Sele com uma tampa, deixe tubos no gelo e proteja-os da luz.
NOTA: Se ocorrer entupimento da tampa do coador de células de 35 μm, toque suavemente no tubo no banco para facilitar o fluxo. - Prepare e rotule os tubos de coleta para FAPs e MuSCs. Se isolar células de músculos inteiros do membro traseiro, classifique as células em tubos de fundo redondo de polipropileno de 5 mL com até 1 mL de FAPs ou muSCs cultura média suplementada com soro 2x. Se isolar células dos músculos TA, classifique FAPs e MuSCs em tubos de microcentrifus de microcentrídulo de 2 mL contendo até 400 μL de cultura média suplementada com soro 2x.
6. Classificação celular ativada por fluorescência (FACS)
NOTA: Este protocolo emprega um citômetro compacto de fluxo de pesquisa de bancada equipado com um bico de 100 μm e com uma configuração de três lasers (488 nm, 640 nm, 405 nm) com a capacidade de analisar até nove fluorcromas diferentes (11 parâmetros incluindo a dispersão dianteira e lateral). Os fluorochromes utilizados neste protocolo e seus filtros de passagem de detector associados são os seguintes: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pacific Blue 448/45; 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. As células são classificadas a 4 °C e permanecem no gelo seguindo o tipo. Antes de operar este instrumento, certifique-se de que o usuário seja devidamente treinado por um especialista em aplicações técnicas.
- Configuração e verificação de desempenho do classificador de células de acordo com as especificações do fabricante.
- Configure uma estratégia hierárquica de gating para identificar FAPs e MuSCs (Figura 2).
- Isolar faps com base no seguinte esquema: i) área de dispersão de células dianteiras vs área de dispersão de células laterais (FSC-A vs. SSC-A) para separar células versus detritos, ii) altura de dispersão de células laterais vs largura de dispersão de células laterais (SSC-H vs. SSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa SSC, iii) altura de dispersão de células dianteiras vs largura de dispersão de células dianteiras (FSC-H vs. FSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa FSC, e iv) área 7-AAD vs SSC-A para distinguir células vivas versus mortas.
- Se isolar as FAPs através do método baseado em anticorpos, usar o seguinte esquema: v) Área APC-CD45/CD31 vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) para excluir células CD31+ e CD45+ de análises posteriores, e vi) área PE-Cy7-VCAM-1 vs PE-α7-Integrin da população CD31-/CD45-/Sca1+ para distinguir FAPs. Os FAPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- Se isolar os FAPs através do método de repórter GFP endógeno, use o seguinte esquema: v) área APC-CD45/CD31 vs área GFP-PDGFRα para excluir células CD31+ e CD45+ de mais análises e isolar células GFP+. Os FAPs são identificados como eventos CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
- Isolar muSCs com base no seguinte esquema: i) área de dispersão de células dianteiras vs área de dispersão de células laterais (FSC-A vs. SSC-A) para separar células versus detritos, ii) altura de dispersão de células laterais vs largura de dispersão de células laterais (SSC-H vs. SSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa SSC, iii) altura de dispersão de células dianteiras vs largura de dispersão de células dianteiras (FSC-H vs. FSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa FSC, iv) área 7-AAD vs SSC-A para distinguir células vivas vs mortas, v) área APC-CD45/CD31 vs Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) para excluir as células CD31+ e CD45+ de análises posteriores, e vi) área PE-Cy7-VCAM-1 vs pe-α7-Integrin da população CD31-/CD45-/Sca1 para distinguir MuSCs. Os muSCs são identificados como eventos CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
- Isolar faps com base no seguinte esquema: i) área de dispersão de células dianteiras vs área de dispersão de células laterais (FSC-A vs. SSC-A) para separar células versus detritos, ii) altura de dispersão de células laterais vs largura de dispersão de células laterais (SSC-H vs. SSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa SSC, iii) altura de dispersão de células dianteiras vs largura de dispersão de células dianteiras (FSC-H vs. FSC-W) para discriminar singlets de doublets na faixa FSC, e iv) área 7-AAD vs SSC-A para distinguir células vivas versus mortas.
- Execute o controle e a viabilidade não localizados para garantir que a população celular esteja devidamente posicionada no lote SSC-A vs FSC-A e para portar corretamente em células únicas vivas.
- Adquira todos os controles manchados e gere a matriz de compensação de derramamento.
- Execute todos os controles de FMO e determine o ponto de corte entre a propagação da fluorescência de fundo e a população positivamente manchada.
- Aproximadamente 5-10 min antes da aquisição da amostra experimental, adicione 7-AAD de material de viabilidade e misture suavemente.
- Uma vez processados todos os controles, defina os portões de classificação de acordo com os controles FMO; adquirir e classificar as amostras experimentais.
- Depois de todas as amostras terem sido processadas, limpe o citómetro de acordo com a especificação do fabricante. Exporte todos os dados .fcs para análise.
7. Cultura de FAPs e MuSCs
NOTA: As células classificadas devem ser cultivadas imediatamente após a triagem, em um meio apropriado em placas revestidas de colágeno I.
- Centrifugar os tubos de coleta em um rotor de ângulo fixo a 250 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernatante sem perturbar a pelota celular.
- Para a cultura do MuSC, resuspenque as células em um volume apropriado de meio de cultura MuSC e incuba-as em condições padrão a 37 °C e 5% de CO2.
- Placa recém-isolada MuSCs a uma densidade de 20.000 células/cm2 e muSCs ativados a uma densidade de 15.000 células/cm2.
- Após o revestimento, as células parecem pequenas, esféricas e translúcidas. Dentro de 36 h, os MuSCs aderem à superfície da placa e lentamente aumentam seu tamanho durante as primeiras 48 horas.
- Substitua o meio a cada 2 dias.
NOTA: Os MuSCs são muito sensíveis à densidade celular. Para manter os MuSCs em seu estado de proliferação, cresça-os até que sejam 60%-70% confluentes. Passar as células para o novo colágeno eu revesti pratos ou pratos e adicionar novo meio fresco a cada 2 dias. Se os MuSCs forem mantidos no mesmo prato ou prato por mais de 3-4 dias, eles adquirirão uma forma alongada e se alinharão com as células vizinhas até se fundirem.
- Para a cultura da FAP, resuspenque as células em um volume apropriado de meio de cultura MuSC e incuba-as em condições padrão a 37 °C e 5% de CO2.
- Placa os FAPs isolados de músculo não perturbado a uma densidade de 15.000 células/cm2 e FAPs isolados do músculo lesionado em 9.000 células/cm2.
NOTA: Após o revestimento, as FAPs aderem completamente à superfície da placa dentro de 48 h, enquanto as FAPs ativadas se prendem à placa dentro de poucas horas. Uma vez anexados, as FAPs adquirem sua forma característica, com um corpo celular pequeno e processos celulares alongados, e proliferam rapidamente. - Substitua o meio a cada 2 dias.
NOTA: Os FAPs são muito sensíveis à densidade celular. Semear FAPs em baixas densidades pode levar ao baixo crescimento celular e morte celular. Pelo contrário, o emplacamento de FAPs em alta densidade de semeadura aumentará a sobrevivência celular e melhorará sua expansão. FaPs decorrentes de músculos danificados geralmente requerem menor densidade celular do que músculos não danificados, pois já estão ativados. Recomenda-se ajustar a densidade de revestimento fap com base nas condições experimentais e na fonte das amostras.
- Placa os FAPs isolados de músculo não perturbado a uma densidade de 15.000 células/cm2 e FAPs isolados do músculo lesionado em 9.000 células/cm2.
- Para cocultura, resuspende FAPs e MuSCs no meio da cocultura em uma proporção de 1:1 e incubar aqueles em condições padrão a 37 °C e 5% de CO2. Deixe as células anexar por 48 h e substitua o meio a cada 2 dias.
8. Análise de imunofluorescência de FAPs e MuSCs cultivados
- Aspire o meio celular e realize duas ou três lavagens com 1x PBS.
- Fixar as células com 2% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS por 15 min no RT.
- Aspire 2% PFA e lave rapidamente as células duas ou três vezes com 1x PBS.
- Realizar a permeabilização e o bloqueio de células:
- Para imunostenção de FAPs recém-isolados, realize a permeabilização celular e o bloqueio incubando células com 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 5% De Soro normal de burro (NDS) por 30 min na RT.
- Para imunostaining de MuSCs recém-isolados, realize a permeabilização celular e o bloqueio incubando células com PBST + 1% BSA + 5% Soro normal de cabra (NGS) por 30 min na RT.
- Aplique anticorpos primários:
- Para imunostaining de FAPs recém-isolados, aplique anticorpo primário PDGFRα anti cabra (1:300) diluído em PBST + 1% BSA + 5% NDS durante a noite a 4 °C.
- Para imunostaining de MuSCs recém-isolados, aplique anticorpo primário Pax7 anti mouse (1:10) diluído em PBST + 1% BSA + 5% NGS para 45 min no RT.
- Lave as células duas ou três vezes com 1x PBS para remover a solução de anticorpos primário.
- Aplique anticorpos secundários:
- Para imunostaining de FAPs recém-isolados, aplique o anti-cabra de burro IgG (H+L) Alexa Fluor 488 anticorpo secundário (1:500) diluído em PBST + 1% BSA por 1 h no RT.
- Para imunostaining de MuSCs recém-isolados, aplique igG1 Alexa Fluor 555 anticorpo secundário (1:500) diluído em PBST + 1% BSA por 45 min no RT.
- Lave as células duas ou três vezes com 1x PBS para remover a solução de anticorpos primário.
- Realize a contra-coloração nuclear incubando células com DAPI em PBST (1:1000) por 5 min na RT.
- Lave as células três vezes com 1x PBS para remover a solução DAPI.
ATENÇÃO: O DAPI é tóxico e perigoso; manuseie-o com cuidado e descarte-o na garrafa de resíduos perigosos. - Armazene as células a 4 °C protegidas da luz.
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Representative Results
Este protocolo permite o isolamento de aproximadamente um milhão de FAPs e até 350.000 MuSCs de membros traseiros não feridos de camundongos adultos do tipo selvagem (3-6 meses), correspondendo a um rendimento de 8% para FAPs e 3% para MuSCs de eventos totais. Ao classificar células de TA danificadas 7 dias após a lesão, dois a três músculos TA são agrupados para obter até 300.000 FAPs e 120.000 MuSCs, que correspondem a um rendimento de 11% e 4%, respectivamente. Os valores de pureza pós-tipo geralmente são acima de 95% para FAPs e MuSCs.
A estratégia de gating adotada para isolar FAPs e MuSCs é ilustrada na Figura 2. Em primeiro lugar, as populações de interesse celular são identificadas criando um gráfico de densidade de dispersão dianteira (FSC) versus dispersão lateral (SSC), o que permite algum grau de identificação celular com base em propriedades morfológicas celulares. Esta estratégia de gating também é usada para excluir pequenos detritos celulares, que geralmente estão localizados no canto inferior esquerdo da trama FSC vs SSC. As células são ainda mais fechadas para excluir doublets com base nos sinais de altura e largura do FSC e SSC, e as células singlet resultantes são então manchadas com 7-AAD para avaliar sua viabilidade. As células vivas são ainda mais avaliadas para a expressão Sca1 e CD31/CD45 para excluir as células positivas da linhagem de análises posteriores. Os singlets negativos sca1 negativos da linhagem são então manchados para VCAM-1 e α7-Integrin para distinguir FAPs e MuSCs. Os FAPs são identificados como células CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin e as células MuSCs são identificadas como células CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. Alternativamente, as células vivas também são fechadas para CD31/CD45 e GFP-PDGFRα para distinguir FAPs. Os FAPs são identificados como células CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin.
Este protocolo apresenta duas estratégias de gating para isolar a população fap: seja usando um repórter PDGFRα-EGFP endógeno ou realizando coloração celular com um anticorpo Sca1. Os ratos repórteres knock-in PDGFRα-EGFP (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 expressam o gene de fusão H2B-eGFP do lócus PDGFRα endógeno, permitindo rotulagem eficiente e específica da linhagem PDGFRα (Figura 3A). Esta linha de mouse foi usada anteriormente para isolar FAPs Pdgfrα+ e é realmente muito útil para o isolamento de FAPs, já que o repórter do GFP fornece um sinal altamente visível e específico19. Alternativamente, este protocolo descreve um método de isolamento baseado em Sca1 para a identificação de FAPs. O Sca1 (Ly-6A/E) é comumente usado para identificar e isolar FAPs na preparação muscular 13,16,17. Sca1 é um membro proteico 18-kDa glycosylphosphatidylinositol (GPI) da família Ly-620. No entanto, além de ser expressa na superfície celular das células progenitoras mesenquimais, a expressão Sca1 também é observada em células-tronco hematopoiéticas (HSCs), bem como leucócitos maduros e células T. Neste protocolo, confirmamos a adequação do Sca1 como marcador das FAPs, realizando estudos de rastreamento de linhagem baseados em FACS. Especificamente, os camundongos PDGFRα-EGFP foram empregados para isolar FAPs Sca1+/GFP entre populações de células mononucleadas. Verificou-se que todas as células que expressam GFP também foram positivas para Sca1 e negativas para CD31, CD45, VCAM-1 e α7-Integrin (Figura 4). Esta análise confirmou o uso de anticorpo Sca1 como marcador para FAPs em FAPs quiescentes e ativadas e fornece meios para o uso indistinto de qualquer estratégia para isolar as FAPs.
Neste protocolo, FAPs e MuSCs também foram isolados de camundongos adultos feridos com injeções intramusculares de Notexina, 7 dias após a lesão (Figura 5). Após lesões, MuSCs e FAPs ativam e proliferam in vivo, atingindo o pico de proliferação entre o dia 3 e 4 2,3. Essas mudanças na proliferação são refletidas por um aumento no percentual de células positivas Sca1/PDFGRα, bem como VCAM-1/α7-Integrin. A Figura 6 representa a quantificação de FAPs e MuSCs em TAs ilesos e 7 dias pós-lesão; embora o pico de proliferação seja observado entre os dias 2 e 3 após a lesão, uma baixa taxa de células proliferadoras ainda é apreciável 7 dias após a lesão. À medida que os MuSCs são ativados, há um aumento acentuado em seu tamanho celular21,22. Portanto, ao isolar essas células pela FACS, é de fundamental importância ajustar os parâmetros FSC-A e SSC-A e expandir o portão para incluir essas células no centro (Figura 5A).
A pureza das populações celulares isoladas foi confirmada pela imunostenção de FAPs GFP+ coculturados e MuSCs com anticorpos Pax7. FaPs e MuSCs GFP+ recém-isolados foram coculturados por 48 h a uma razão de 1:1 (Figura 3B). Os FAPs GFP+ não expressaram o marcador Pax7, enquanto os MuSCs reagiram com este anticorpo. Assim, a estratégia lin-/sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- e Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gating é eficaz na isolação de populações puras de FAPs e MuSCs, respectivamente.
Figura 1: Visão geral gráfica do isolamento fap e musc. Visão geral gráfica mostrando o isolamento fap e musc dos músculos do membro traseiro. O protocolo também se aplica a células isoladas dos músculos TA. Primeiro, os músculos são coletados e picados mecanicamente antes de serem submetidos à digestão enzimática. A mistura muscular é então processada através de uma agulha de 20 G e filtrada para obter uma suspensão de células mononucleadas. As células são então incubadas com um coquetel de anticorpos conjugados fluoróforo e, finalmente, correm através de um classificador de células para isolar uma população pura de FAPs e MuSCs. Populações de células puras são então processadas para aplicação a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfil facs representativo de FAPs quiescentes e MuSCs. (A-H) Estratégia gating para o isolamento de FAPs e MuSCs. (A) Primeiro, as amostras são fechadas para excluir detritos celulares e (B,C) dobras baseadas nas propriedades SSC e FSC. (D) As células únicas resultantes são então manchadas com 7-AAD para avaliar sua viabilidade. (E) As células únicas negativas de 7 AAD são então avaliadas para APC-CD31/CD45 e Pacific Blue-Sca1 para excluir as células positivas da Linhagem de análises posteriores. (F,G) Os singlets negativos da linhagem são então manchados para PE-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-Integrin. (F) As células DE F são identificadas como células CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin e (G) as células MuSCs são identificadas como células CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+. (H) isolamento de FAPs em ratos PDGFRα-EGFP usando um repórter GFP. (I-M) O perfil FACS para Fluorescência Menos Um (FMO) controla para demonstrar compensação e gengante adequadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação da cultura celular FAP e MuSC. (A) FaPs recém-isolados expressando GFP foram banhados e co-manchados com um anticorpo PDGFRα. Os núcleos estavam manchados com DAPI. Imagens mescladas de manchas GFP (verde), PDGFRα (vermelho) e DAPI (azul). Barras de escala, 25 μm. (B) FaPs recém-isolados (verde) e MuSCs foram cocultados por 48h e manchados com Pax7 (vermelho). Os núcleos estavam manchados com DAPI. Os FAPs que expressam GFP não expressam Pax7, enquanto os MuSCs expressam exclusivamente a Pax7 e não são positivos para o GFP, confirmando a pureza de ambas as populações classificadas. Barras de escala, 75 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ratos PDGFRα-EGFP e expressão Sca1 marcam especificamente FAPs em camundongos adultos. Os FAPs são isolados como células GFP+/Sca1+. As células únicas negativas 7-AAD são avaliadas para APC-CD31/CD45 e GFP-PDGFRα para excluir células positivas de linhagem e distinguir FAPs. As células positivas da linhagem negativa/Sca1 estão manchadas para pe-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-Integrin para excluir MuSCs. Os FAPs são identificados como células CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Perfil facs representativo de FAPs ativados e MuSCs. (A-H) Estratégia gating para o isolamento de FAPs e MuSCs ativados. (A) As amostras são fechadas para excluir detritos celulares, criando o gráfico de densidade FSC-A vs SSC-A. Note o portão ampliado para acomodar a população de interesse. (B,C) As amostras são ainda mais fechadas para eliminar doublets com base nas propriedades SSC e FSC. (D) As células únicas resultantes são então manchadas com 7-AAD para avaliar sua viabilidade. (E) As células únicas negativas de 7 AAD são então avaliadas para APC-CD31/CD45 e Pacific Blue-Sca1 para excluir as células positivas da Linhagem de análises posteriores. (F,G) Os singlets negativos de linhagem são então manchados para PE-Cy7-VCAM-1 e PE-α7-integrin. (F) Os FAPs são identificados como células CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin e (G) as células MuSCs são identificadas como células CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+. (H) isolamento de FAPs em ratos PDGFRα-EGFP usando um repórter GFP. (I-M) O perfil FACS para Fluorescência Menos Um (FMO) controla para demonstrar compensação e gengante adequadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Quantificação de FAPs e MuSCs em TAs não perturbados e feridos. Quantificação de FAPs e MuSCs em músculos TA ilesos e 7 dias pós-lesão. A contagem celular foi realizada dividindo o número de células classificadas por mgs de músculo coletado. ** P < 0,01 entre ilesos e feridos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 7-AAD (μg/mL) |
CD31/CD45-APC (μg/mL) |
Azul-Pacífico Sca1 (μg/mL) |
α 7-Integrin-PE (μg/mL) |
VCAM-1-Biotina (μg/mL) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/mL) |
||
| Controle não detido | |||||||
| Controles individuais manchados | |||||||
| 7-AAD (Controle de Viabilidade) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| Controles FMO | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Amostra experimental | |||||||
| Mancha completa | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabela 1: Matriz de coloração de anticorpos. Lista de concentrações de anticorpos utilizadas para coloração das amostras experimentais e de controle. Se isolar faps por GFP, a coloração Sca1 pode ser omitida. Em vez disso, execute o controle único manchado GFP e o GFP FMO.
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Discussion
Estabelecer protocolos eficientes e reprodutíveis para a identificação e isolamento de populações de células-tronco adultas puras é o primeiro e mais crítico passo para entender sua função. FaPs isolados e MuSCs podem ser usados para realizar análises multiômicas em experimentos de transplante como um tratamento potencial para doenças musculares ou podem ser geneticamente modificados para modelagem de doenças na terapia celular-tronco.
O protocolo descrito aqui fornece diretrizes padronizadas para a identificação, isolamento e cultura de FAPs e MuSCs obtidos a partir de músculos de membros traseiros de camundongos adultos. Populações puras de FAPs e MuSCs foram isoladas usando uma técnica baseada em FACS, e sua pureza foi posteriormente avaliada por células imunossundo com marcadores de superfície celular específicos e meios genéticos.
O protocolo consiste em três seções principais que impactam muito o rendimento de FAPs e MuSCs: a digestão muscular mecânica e enzimática, a geração de uma suspensão celular mononucleada através da agulha de 20 G, e o isolamento final de células únicas através do FACS.
Realizar o bom migo muscular é de fundamental importância para a liberação de células individuais. Deve-se dar ênfase a esta etapa, pois atingir o tamanho ideal das peças musculares após o picar permite que as enzimas utilizadas para a digestão funcionem melhor e previne entupimento da agulha usada na etapa 4.1. Por outro lado, o excesso de picar o músculo pode resultar em baixo rendimento celular e viabilidade celular reduzida, uma vez que os MuSCs são rapidamente liberados durante a primeira digestão e podem ser aspirados na etapa 3.7.2 ou 3.8.214. Além disso, a eficiência das enzimas utilizadas para a digestão da preparação muscular também impacta na qualidade da dissociação enzimática, pois pode haver variabilidade entre diferentes enzimas ou diminuição da atividade das enzimas com o tempo23. Por isso, é aconselhável testar cada lote de enzimas para otimizar o tempo de digestão e concentração. Além disso, a concentração e o tempo necessários para digerir o músculo também podem ser afetados por condições patológicas que afetam a rigidez muscular. Essas condições específicas exigirão otimização individual.
A geração final de células mononucleadas acontece executando a suspensão através de uma seringa de 10 mL com uma agulha de 20 G. Deve-se tomar cuidado específico ao realizar esta etapa para minimizar o número de bolhas formadas, pois seu estouro causa danos adicionais àscélulas 24.
A suspensão da célula é então manchada com um coquetel de anticorpos e adquirida com um classificador de células. Definir os portões apropriados é outro passo crítico. Ao realizar esses experimentos, é fortemente recomendável executar os controles individuais e controles FMO listados para compensar adequadamente o derramamento de emissões e responder pelo sinal de fundo devido à propagação do derramamento. Isso é especialmente importante quando se lida com proteínas fluorescentes brilhantes como gfp e manchas indiretas como o complexo VCAM-1-biotina/Stretpavidin-PE-Cy7.
Além disso, antes de executar este experimento pela primeira vez, é uma boa prática realizar uma titulação dos anticorpos utilizados para detectar populações de interesse. Determinar a concentração ideal dos anticorpos é um passo fundamental para garantir o sinal mais brilhante da população positiva e evitar o aumento da coloração de fundo.
Uma vez concluída a classificação, é importante realizar uma análise pós-classificação nas células classificadas para determinar sua pureza e viabilidade. O rendimento e a viabilidade das células classificadas são altamente influenciados pela quantidade de tempo necessário para processar a amostra e devem ser levados em consideração ao planejar o processamento de vários camundongos. Além disso, manter as células classificadas no gelo em mídia de enriquecimento de soro 2x pode ajudar a recuperação celular e melhorar sua viabilidade.
Neste protocolo, faps e MuSCs foram isolados dos músculos tibialis anteriores de camundongos não feridos, bem como 7 dias após a injeção de Notexin. Após uma lesão aguda, diferentes subpovoas fap e MuSC foram relatadas como sendo transitenariamente expressas no tecido muscular regenerador. Malecova e colegas relataram a presença de uma subséu população de VCAM-1 expressando FAPs ausentes em músculos não danificados, atingiu o pico entre os dias 2 e 3 pós-lesão em inflamação aguda, e persistiu em camundongos distróficosmurinas 13. Da mesma forma, Kafadar e colegas relataram um aumento transitório na expressão de Sca1 em um pequeno subconjunto de progenitores miogênicos 2 dias após a lesão25. No entanto, as células miogênicas Sca1+ foram muito diminuídas 3 dias após a lesão25. A presença dessas subpopulações deve ser reconhecida e considerada ao utilizar este protocolo para isolar FAPs e MuSCs em estágios anteriores.
Em resumo, este protocolo descreve um método para o isolamento e cultura de uma população pura de FAPs e MuSCs isolados de músculos de camundongos adultos saudáveis ou feridos. A alta pureza e a viabilidade das células tornam este protocolo adequado para outras aplicações a jusante.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Tom Cheung (Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong) por conselhos sobre o isolamento do MuSC. Este trabalho foi financiado pelo NIAMS-IRP através das bolsas NIH AR041126 e AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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