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Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.

Abstract

Obwohl die konventionelle Pathologie zahlreiche Informationen über die Nierenmikrostruktur lieferte, war es aufgrund des Mangels an dreidimensionalen (3D) Informationen schwierig, die genaue Struktur von Blutgefäßen, proximalen Tubuli, Sammelkanälen, Glomeruli und sympathischen Nerven in der Niere zu kennen. Optisches Clearing ist eine gute Strategie, um diese große Hürde zu überwinden. Mehrere Zellen in einem ganzen Organ können mit Einzelzellauflösung analysiert werden, indem Gewebereinigung und 3D-Bildgebungstechnik kombiniert werden. Zellmarkierungsmethoden für die Bildgebung ganzer Organe sind jedoch noch unterentwickelt. Insbesondere die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Das vorliegende Protokoll entwickelte eine vollständige Mausnierenfärbung für die 3D-Bildgebung mit der CUBIC-Methode (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) zur Gewebereinigung. Das Protokoll hat es ermöglicht, die renale sympathische Denervierung nach Ischämie-Reperfusionsverletzung und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung aus einem umfassenden Blickwinkel zu visualisieren. So kann diese Technik zu neuen Entdeckungen in der Nierenforschung führen, indem sie eine makroskopische Perspektive bietet.

Introduction

Die Niere besteht aus verschiedenen Zellpopulationen. Obwohl die konventionelle Pathologie uns viele Informationen über die Nierenmikroumgebung liefert, ist eine dreidimensionale (3D) Bildgebung erforderlich, um das interzelluläre Übersprechen während des Fortschreitens der Nierenerkrankung genau zu verstehen. In der Vergangenheit musste eine Vielzahl von seriellen Schnitten und Bildrekonstruktionen für die 3D-Bildgebung des gesamten Organs^{durchgeführt werden 1}. Diese Methode erforderte jedoch zu viel Aufwand und hatte Probleme in Bezug auf die Reproduzierbarkeit.

Optisches Löschen ist eine gute Strategie, um diese Hürde zu überwinden ^2,3. Die Trübung des Gewebes ist hauptsächlich auf Lichtstreuung und -absorption zurückzuführen, da jedes Organ aus verschiedenen Substanzen besteht, darunter Wasser, Protein und Lipide. Daher besteht die grundlegende Strategie der Gewebereinigung darin, Wasser und Lipide in Geweben durch Reagenzien mit Brechungsindex (RI) zu ersetzen, die die gleichen optischen Eigenschaften wie Proteine haben⁴. Um eine transparente Probe zu beobachten, ist eine Leuchtblatt-Fluoreszenzmikroskopie sinnvoll⁵. Lichtblätter beleuchten die transparente Probe von der Seite, und Anregungssignale werden durch die Objektivlinse erfasst, die sich in vertikaler Position^{befindet 6}. Diese Mikroskopie erhält Querschnittsinformationen in einem einzigen Sweep, die sich von der konfokalen oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie unterscheidet. So kann es schnell Z-Stack-Bilder mit einem geringen Maß an Photobleiche aufnehmen.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) ist eine der Gewebereinigungsmethoden, die eine Ganzorganbildgebung mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ^2,7,8 ermöglicht. CUBIC und die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung werden in der vorliegenden Studie optimiert, um 3D-Strukturen der Mausniere^zu visualisieren 9,10,11. Mit dieser Whole-Mount-Färbemethode wird die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung 9,10 und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung ¹¹ sowie Blutgefäßen, proximalen Tubuli und Sammelkanälen in einer^{ganzen Niere 9} visualisiert.

Protocol

Alle Experimente wurden vom University of Tokyo Institutional Review Board genehmigt. Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Männliche C57BL/6NJcl-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). 1. Tierpräparation und Nierenfixierung Führen Sie eine Perfusionsfixierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von Isofluran (3%, 2,0 l/min) und intraperitonealer Verabreichung von Medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg), Butorphanoltartrat (5 mg/kg) und Midazolam (4 mg/kg) (siehe Materialtabelle). Perfusion des Tieres mit 20 ml PBS (pH 7,4) und 30 ml 4% PFA in Phosphatpuffer (PB) durch den linken Ventrikel des Herzens12. Führen Sie die Immersionsfixierung unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und Nierenprobenahme durch9.Tauchen Sie die Niere für weitere 16 Stunden in 4 % PFA bei 4 °C und waschen Sie sie dann 2 h lang (dreimal)9 mit PBS (Abbildung 1).ACHTUNG: Formaldehyd und Paraformaldehyd sind toxische Reizstoffe. Behandeln Sie Reagenzien in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. 2. Entfärbung und Delipidierung Bereiten Sie CUBIC-L zur Entfärbung und Delipidierung vor, das aus 10 Gew.-% Triton X-100 und 10 Gew.-% N-Buthyldiethanolamin besteht (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten 4,8,9. Führen Sie die Entfärbung und Delipidierung mit CUBIC-L durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.Tauchen Sie die festsitzende Niere in 7 ml 50% (v/v) CUBIC-L (1:1 Mischung aus Wasser und CUBIC-L) in ein 14 ml rundes Bodenrohr (siehe Materialtabelle) unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 6 h (Abbildung 2A). Dann tauchen Sie es in 7 mL CUBIC-L in ein 14 mL rundes Bodenrohr mit leichtem Schütteln bei 37 ° C für 5 Tage. Aktualisieren Sie CUBIC-L jeden Tag während dieses Vorgangs. Nach dem Entfärbungs- und Delipidierungsprozess waschen Sie die Niere mit PBS bei Raumtemperatur für 2 h (dreimal)9 (Abbildung 1). Verwenden Sie einen Dosierlöffel für die Probenhandhabung (Abbildung 2B). 3. Ganzmontage Immunfluoreszenzfärbung Bereiten Sie die Färbepuffer vor.Bereiten Sie den Färbepuffer für primäre Antikörper vor, indem Sie 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% Casein in PBS und 0,05% Natriumazid9 mischen. Bereiten Sie den Färbepuffer für sekundäre Antikörper vor, indem Sie 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% Casein in PBS und 0,05% Natriumazid9 mischen. Führen Sie eine Färbung mit primären Antikörpern durch.Immunfärben Sie die delipidierte Niere mit primären Antikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 7 Tage.HINWEIS: Die Menge des Färbepuffers, die für eine Niere benötigt wird, beträgt 500-600 μL (Abbildung 2C). Waschen Sie die Niere mit 0,5 % (v/v) Triton X-100 in PBS (PBST) bei Raumtemperatur für 1 Tag9 (Abbildung 1). Führen Sie eine Färbung mit sekundären Antikörpern durch.Immunfärben Sie die Niere mit sekundären Antikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C mit leichtem Schütteln für 7 Tage. Waschen Sie die Niere mit PBST bei Raumtemperatur für 1 Tag9 (Abbildung 1). Nach der Fixierung9 tauchen Sie die Niere 3 h lang in 1% Formaldehyd in PB (1:36 Mischung aus 37% Formaldehyd und PB) und waschen Sie sie mit PBS bei Raumtemperatur für 6 h (Abbildung 1). 4. Anpassung des Brechungsindex (RI) Bereiten Sie CUBIC-R+ vor.CUBIC-R wird durch Mischen von 45 Gew.-% 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon/Antipyrin und 30 Gew.-% Nicotinamid hergestellt (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie CUBIC-R+ für die Anpassung des Brechungsindex (RI) vor, indem 0,5 v% N-Buthyldiethanolamin zu CUBIC-R gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten 4,8,9 hinzugefügt werden. Führen Sie den RI-Abgleich durch.Tauchen Sie die Niere in 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (1:1 Mischung aus Wasser und CUBIC-R+) in ein 14 ml rundes Bodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Tag. Tauchen Sie es dann in 7 ml CUBIC-R+ in ein 14-ml-Rundbodenrohr unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Tage9 (Abbildung 1).HINWEIS: Obwohl die Niere zu Beginn des RI-Abgleichs in 50% CUBIC-R+ schwimmt, sinkt sie ab und wird am Ende des Prozesses in CUBIC-R+ transparent (Abbildung 2D). 5. Bildaufnahme und Rekonstruktion Tauchen Sie die RI-angepasste Niere während der Bildaufnahme (RI = 1,51)55 in eine Mischung aus Siliziumöl (RI = 1,555) und Mineralöl (RI = 1,467) (55 :45) (Abbildung 3). Erfassen Sie 3D-Bilder der gesamten Niere mit einem speziell angefertigten 9-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie alle Rohbilddaten in einem 16-Bit-TIFF-Format. Visualisieren und erfassen Sie die 3D-gerenderten Bilder mit der Bildanalysesoftware (Imaris, siehe Materialtabelle).

Representative Results

Mit dieser Färbemethode wurden sympathische Nerven [Anti-Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA)-Antikörper] in einer ganzen Niere sichtbar gemacht (Abbildung 4A,B und Video 1)9. Abnorme renale Sympathikusnerven wurden auch nach Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI) visualisiert9,10 (Abbildung 4…

Discussion

Das vorliegende Protokoll ermöglichte die 3D-Bildgebung verschiedener Strukturen wie Sympathikusnerven, Sammelkanäle, Arterien, proximaler Tubuli und Glomeruli 9,10,11. Diese Färbemethode bot makroskopische Beobachtung und führte zu neuen biologischen Entdeckungen, indem sie die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung ^9,10 und Glomerulomegalie im Anfan…

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube	Falcon	352059	Tissue clearing, staining, wash
2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post fixation
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Kidney fixation
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody	Invitrogen	A-21436	Secondary antibody (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-31573	Secondary antibody (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody	Abcam	ab199975	Primary antibody (1:100)
Anti-podocin antibody	Sigma-Aldrich	P0372	Primary antibody (1:100)
Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody	Abcam	ab85626	Primary antibody (1:100)
Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody	Abcam	ab113	Primary antibody (1:100)
Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody	Abcam	ab5694	Primary antibody (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Staining buffer
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthetic
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mouse strain
Imaris	Bitplane	N/A	Imaging analysis software
Macro-zoom microscope	OLYMPUS	MVX10	The observation unit of the custom-built microscope
Medetomidine Hydrochloride	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthetic
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthetic
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	Immersion oil
N-buthyldiethanolamine	Tokyo Chemical Industry	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Chemical Industry	N0078	CUBIC-R+
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silicon oil HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Immersion oil
Sodium azide	Wako	195-11092	Staining buffer