Ganznieren-dreidimensionale Färbung mit CUBIC

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.

Zusammenfassung

Obwohl die konventionelle Pathologie zahlreiche Informationen über die Nierenmikrostruktur lieferte, war es aufgrund des Mangels an dreidimensionalen (3D) Informationen schwierig, die genaue Struktur von Blutgefäßen, proximalen Tubuli, Sammelkanälen, Glomeruli und sympathischen Nerven in der Niere zu kennen. Optisches Clearing ist eine gute Strategie, um diese große Hürde zu überwinden. Mehrere Zellen in einem ganzen Organ können mit Einzelzellauflösung analysiert werden, indem Gewebereinigung und 3D-Bildgebungstechnik kombiniert werden. Zellmarkierungsmethoden für die Bildgebung ganzer Organe sind jedoch noch unterentwickelt. Insbesondere die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Das vorliegende Protokoll entwickelte eine vollständige Mausnierenfärbung für die 3D-Bildgebung mit der CUBIC-Methode (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) zur Gewebereinigung. Das Protokoll hat es ermöglicht, die renale sympathische Denervierung nach Ischämie-Reperfusionsverletzung und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung aus einem umfassenden Blickwinkel zu visualisieren. So kann diese Technik zu neuen Entdeckungen in der Nierenforschung führen, indem sie eine makroskopische Perspektive bietet.

Einleitung

Die Niere besteht aus verschiedenen Zellpopulationen. Obwohl die konventionelle Pathologie uns viele Informationen über die Nierenmikroumgebung liefert, ist eine dreidimensionale (3D) Bildgebung erforderlich, um das interzelluläre Übersprechen während des Fortschreitens der Nierenerkrankung genau zu verstehen. In der Vergangenheit musste eine Vielzahl von seriellen Schnitten und Bildrekonstruktionen für die 3D-Bildgebung des gesamten Organs^{durchgeführt werden 1}. Diese Methode erforderte jedoch zu viel Aufwand und hatte Probleme in Bezug auf die Reproduzierbarkeit.

Optisches Löschen ist eine gute Strategie, um diese H....

Protokoll

Alle Experimente wurden vom University of Tokyo Institutional Review Board genehmigt. Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Männliche C57BL/6NJcl-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Tierpräparation und Nierenfixierung

1. Führen Sie eine Perfusionsfixierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von Isofluran (3%, 2,0 l/min) und intraperitonealer Verabreichung von Medetomidinhydr....

Ergebnisse

Mit dieser Färbemethode wurden sympathische Nerven [Anti-Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA)-Antikörper] in einer ganzen Niere sichtbar gemacht (Abbildung 4A,B und Video 1)⁹. Abnorme renale Sympathikusnerven wurden auch nach Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI) ^{visualisiert9,10} (Abbildung 4C

Diskussion

Das vorliegende Protokoll ermöglichte die 3D-Bildgebung verschiedener Strukturen wie Sympathikusnerven, Sammelkanäle, Arterien, proximaler Tubuli und Glomeruli 9,10,11. Diese Färbemethode bot makroskopische Beobachtung und führte zu neuen biologischen Entdeckungen, indem sie die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung ^9,10 und Glomerulomegalie im Anfangsstad.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
14 mL PP-Reagenzglas mit rundem Boden und hoher Klarheit	Falcon	352059	Reinigen, Färben, Waschen von
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon/Antipyrin	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Formaldehydlösung	Nacalai Tesque	16223-55
%-Paraformaldehyd-Phosphat-Pufferlösung	Nacalai Tesque	09154-85	Nierenfixierung
Alexa Flour 555-konjugierter Esel Anti-Schaf IgG Antikörper	Invitrogen	A-21436	Sekundärer Antikörper (1:100)
Alexa Flour 647-konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgG Antikörper	Invitrogen	A-31573	Sekundärer Antikörper (1:200)
Anti-Aquaporin 2 (AQP2) Antikörper	Abcam	ab199975	Primärer Antikörper (1:100)
Anti-Podocin Antikörper	Sigma-Aldrich	P0372	Primärer Antikörper (1:100)
Anti-Natriumglukose-Cotransporter 2 (SGLT2)-Antikörper	Abcam	ab85626	Primärer Antikörper (1:100)
Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Antikörper	Abcam	ab113	Primärer Antikörper (1:100)
Anti-Α-Aktin (α-SMA)-Antikörper	Abcam	ab5694	Primärer Antikörper (1:200)
Blocker Casein in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Färbepuffer
Butorphanol Tartrat	Meiji	005526	Anästhetikum
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Mausstamm
Imaris	Bitplane	N/A	Bildgebende Analysesoftware
Makrozoom-Mikroskop	OLYMPUS	MVX10	Die Beobachtungseinheit des maßgefertigten Mikroskops
Medetomidinhydrochlorid	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anästhetikum
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anästhetikum
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M8410	Immersionsöl
N-Buthyldiethanolamin	Tokio Chemische Industrie	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamid	Tokyo Chemische Industrie	N0078	CUBIC-R+
Polyethylenglykol mono-p-isooctylphenylether/Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Silikonöl HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemisches	50449832	Immersionsöl
Natriumazid	Wako	195-11092	Färbepuffer

4 nach der Fixierung