Ganznieren-dreidimensionale Färbung mit CUBIC
18. Juli 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.
Dieses Protokoll ermöglicht eine Visualisierung dreidimensionaler Strukturen in der vollen Niere, was durch eine makroskopische Perspektive zu innovativen Entdeckungen in der Nierenforschung führen kann. Die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Dieses Protokoll hat die qualitativ hochwertige, vollständige Färbung der Nieren durch die Antikörper nachgewiesen.
Um zu beginnen, führen Sie die Immersionsfixierung unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und Nierenprobenahme durch, indem Sie die Niere 16 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius tauchen. Geben Sie drei Wäschen mit PBS für jeweils zwei Stunden. Führen Sie den Entfärbungs- und Delipidierungsprozess durch, indem Sie die festsitzende Niere in sieben Millimeter 50% CUBIC-L in einem 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur eintauchen.
Nach sechs Stunden tauchen Sie die Niere in sieben Milliliter CUBIC-L in einem 14 Millimeter Rundbodenrohr mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für fünf Tage. Aktualisieren Sie CUBIC-L jeden Tag. Sobald die Entfärbung und Delipidierung abgeschlossen sind, verwenden Sie einen Dosierlöffel für die Probenhandhabung und waschen Sie die Niere dreimal mit PBS bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
Immunfärbung der delipidierten Niere in primären Antikörpern, verdünnt in Färbepufferlösung, mit leichtem Schütteln in einem Inkubatorschüttler bei 37 Grad Celsius für sieben Tage. Dann waschen Sie die Niere mit 0,5% Triton X-100 in PBS, auch bekannt als PBST, bei Raumtemperatur für einen Tag. Für die sekundäre Antikörperfärbung behandeln Sie die Niere mit sekundären Antikörpern im Färbepuffer, im Dunkeln, mit leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius für sieben Tage.
Fixieren Sie die Flecken mit einer PBST-Wäsche bei Raumtemperatur für einen Tag. Nach der Fixierung tauchen Sie die Niere drei Stunden lang in 1% Formaldehyd in PB ein und waschen Sie sie sechs Stunden lang mit PBS bei Raumtemperatur. Führen Sie die Brechungsindexanpassung durch, indem Sie die Niere in sieben Milliliter 50% CUBIC-R+ in ein 14-Milliliter-Rundbodenrohr mit Schütteln für einen Tag tauchen, gefolgt von einer Behandlung mit sieben Milliliter CUBIC-R+ mit Schütteln bei Raumtemperatur für zwei Tage.
Mit Hilfe der Immunfärbemethode wurden sympathische Nerven und Arterien in einer ganzen Niere in der 3D-Nierenbildgebung sichtbar gemacht. Darüber hinaus wurden abnormale Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung visualisiert. Dieses Protokoll erleichterte auch die Visualisierung sympathischer Nerven in der gesamten Milz.
Hier wird der Datenquantifizierungsprozess für die dreidimensionale Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Darüber hinaus wurden Sammelkanäle, das S1-Segment der proximalen Tubuli und die Glomeruli erfolgreich in einer ganzen Niere sichtbar gemacht. Die unterdrückte Glomerulomegalie, die aus der Medikamentenverabreichung in den frühen Stadien der diabetischen Nierenerkrankung resultiert, wurde auch in der 3D-Bildgebung visualisiert.
Dieses Protokoll kann das spezifische Molekül in einer ganzen Niere markieren. So können Forscher Strukturveränderungen im Gefäßsystem analysieren oder seltene Ereignisse im Nierengewebe finden.
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Übersicht
Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung dreidimensionaler Strukturen im gesamten Nierenorgan und bietet eine makroskopische Perspektive, die zu innovativen Entdeckungen in der Nierenforschung führen kann. Die Methode umfasst die Gewebeklärung und die immunfluoreszenzfarbliche Färbung von Ganzpräparaten zur Verbesserung der Bildqualität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Pathologie
Hintergrund
- Die Ganzpräparat-Färbung von Organen ist aufgrund von Schwierigkeiten beim Eindringen der Antikörper herausfordernd.
- Eine hochwertige Färbung ist entscheidend für eine genaue 3D-Bildgebung.
- Dieses Protokoll behebt häufig auftretende Probleme bei der Nierenbildgebung.
- Makroskopische Perspektiven können zu neuen biologischen Erkenntnissen führen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für die 3D-Nierenbildgebung.
- Verbesserung der Visualisierung von Nierenstrukturen.
- Erleichterung innovativer Entdeckungen in der Nierenpathologie.
Verwendete Methoden
- Einbettungsfestigung in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 16 Stunden.
- Waschen mit PBS jeweils zwei Stunden, dreimal.
- Entfärbung und Entfettung mit 50% CUBIC-L.
- Sanftes Schütteln bei Raumtemperatur während des Entfettungsprozesses.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesene hochwertige Ganzpräparat-Färbung von Nieren.
- Verbesserte Antikörperpenetration erreicht.
- Klare 3D-Visualisierung von Nierenstrukturen ermöglicht.
- Makroskopische Perspektiven zur besseren Erfassung der Nierenpathologie ermöglicht.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert erfolgreich die Bildgebungstechniken für die Niere.
- Es eröffnet neue Möglichkeiten für Entdeckungen in der Nierenforschung.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der dreidimensionalen Ganznierefärbung mit CUBIC wird eine umfassende Visualisierung renaler Mikrostrukturen ermöglicht, wodurch die Einschränkungen der konventionellen Pathologie überwunden werden. Diese Fähigkeit erlaubt eine hochauflösende Abbildung von Blutgefäßen, Tubuli, Glomeruli und sympathischen Nerven und liefert entscheidende Erkenntnisse für die frühe Entdeckung und die mechanistische Risikominimierung in der Nierenerkrankungsforschung. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit an entscheidenden Wendepunkten der präklinischen Portfolioentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Nierenarchitektur und zellulären Netzwerke mit Einzelzell-Auflösung.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Visualisierung struktureller Veränderungen nach Verletzung oder therapeutischem Eingriff.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung durch umfassende Kartierung sympathischer Nerven und Glomeruli.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der Priorisierung von Targets für Nierenerkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte 3D-biologische Systeme für nachgeschaltete Bildgebungs- und Quantifizierungsworkflows vor.
- Standardisiert die Färbung ganzer Organe für reproduzierbare, quantitative Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg.
- Ermöglicht die skalierbare Bildgebung seltener Ereignisse und struktureller Veränderungen im Nierengewebe.
- Unterstützt die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die renale Mikroanatomie.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt 3D-Bildgebungsdaten mit krankheitsrelevanten Biomarkern wie Glomerulomegalie in Übereinstimmung.
- Schafft Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Interventionseffekte visualisiert werden.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung auf Grundlage umfassender Gewebeanalysen.
- Bietet prädiktive Entschärfung von Risiken für translationsorientierte Nierenforschungsprogramme.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses 3D-Färbeprotokoll für ganze Nieren ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert und unterstützt die Hypothesenprüfung, Zielvalidierung sowie die translationale Abstimmung von Biomarkern in der Nierenforschung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Abbildung renaler Strukturen und Verletzungsreaktionen.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare 3D-Bildgebungsergebnisse für den quantitativen Vergleich experimenteller Bedingungen bereit.
- Analysen: Ermöglicht die Messung und Quantifizierung struktureller Veränderungen und unterstützt damit eine robuste statistische Analyse.
- Translationale Forschung: Verbindet bildgebende Befunde mit Krankheitsmodellen und der frühen Identifizierung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Ganzorgan-Bildgebung in Studien zu Nierengewebe und verwandten Geweben.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung renaler Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, skalierbare und reproduzierbare 3D-Bildgebungs-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem umfassende Gewebeanalysen ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen zu Nierenerkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebeklärung, Immunfärbung und 3D-Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu fortschrittlichen bildgebenden Geräten und computergestützten Analysewerkzeugen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann Anpassungen für verschiedene Organsysteme oder Antikörpansets erfordern.
- Die Penetration der Antikörper und die Dauer der Färbung stellen praktische Grenzen für die Bildgebung ganzer Organe dar.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
