Methodenartikel

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

DOI:

10.3791/63990

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17. Oktober 2022

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1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine, The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science, Northwest University, 6Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.

Einleitung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturenzu definieren 1, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissenspielen 2. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg3 gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle4 entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro5 gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln 6. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern7. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten8.

Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern9. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen10. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen9 gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.

Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.

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Protokoll

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Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 8 Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Die Schritte zur Isolierung von Plasma- und Gewebe-EVs sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasma wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren zur Isolierung von EV aus Körperflüssigkeiten zu beschreiben. Der Oberkieferknochen wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren der EV-Isolierung aus dem festen Gewebe zu erklären.

1. Aufbereitung des Plasmas und der Oberkieferknochenproben

  1. Bereiten Sie die Plasmaproben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Bestimmen Sie das Körpergewicht der Maus mit einer Standard-Laborwaage.
    2. Geben Sie 20 μl, 2 mg/ml Heparin in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie die Mischvorrichtung (siehe Materialtabelle), damit sich das Heparin an der Wand des Röhrchens festsetzen kann.
      HINWEIS: Gerinnungsschutzröhrchen können auch direkt zur Blutentnahme verwendet werden.
    3. Betäubung der Maus durch intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Pentobarbitalnatrium (siehe Materialtabelle). Fassen Sie den Hals der Maus mit Daumen und Zeigefinger, fixieren Sie dann den Schwanz und das linke Hinterbein mit dem kleinen Finger und injizieren Sie das Pentobarbital-Natrium mit einer 1-ml-Injektionsspritze, nachdem Sie den Bauch freigelegt haben.
    4. Vergewissern Sie sich, dass die Maus richtig betäubt ist, da beim Einklemmen des Fußballens keine Hornhautreflexe und keine Reaktion der Gliedmaßen vorhanden sind.
    5. Rasieren Sie die Haare im Gesicht und die Wimpern der Augen mit einer gebogenen Schere.
    6. Fassen Sie die Halshaut der Maus und drücken Sie die Haut um die Augen herum in den Nacken, so dass der Augapfel hervorsteht. Verwenden Sie eine Augenpinzette, um den Augapfel schnell einzuklemmen, und fangen Sie den Blutabfluss mit den in Schritt 1.1.2 vorbereiteten 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf. Opfern Sie die Maus, indem Sie den Halswirbel ausrenken.
      ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig mit den Härchen und Wimpern, da diese eine Hämolyse verursachen können.
    7. Drehen Sie den Schlauch mehrmals vorsichtig auf den Kopf, um eine Blutgerinnung zu verhindern.
      ACHTUNG: Drehen Sie den Schlauch so schnell wie möglich auf den Kopf.
    8. Die Blutprobe wird für 15 min bei 1.200 x g bei 4 °C zentrifugiert.
    9. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie die Plasmaprobe sofort oder lagern Sie sie einige Stunden bei 4 °C.
    10. Den Überstand mit einem gleichen Volumen von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen und gut mischen.
      HINWEIS: Das oben angegebene Protokoll zur Entnahme des Plasmas ist tödlich. Das Blut kann auch durch eine Venenpunktion11 entnommen werden, ohne dass die Maus geopfert wird.
  2. Bereiten Sie die Oberkieferknochenproben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Isolieren Sie den Oberkieferknochen mit einer Augenpinzette und einer Schere und waschen Sie ihn mit PBS, um Weichteile mit einer Pinzette zu entfernen.
    2. Legen Sie den Oberkieferknochen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und schneiden Sie den Knochen mit einer Schere in kleine Stücke (die Größe muss weniger als 1 mm Durchmesser haben). Fügen Sie eine bestimmte Menge Liberase (5 μg/ml, siehe Materialtabelle) hinzu, um das Gewebe zu bedecken (normalerweise 1 ml für Knochenproben einer 8 Wochen alten Maus) und inkubieren Sie dann 30 Minuten lang bei 37 °C.
    3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 800 x g für 10 min bei 4 °C.
    4. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.

2. Extraktion von Elektrofahrzeugen

  1. Die in Schritt 1.1.10 und Schritt 1.2.4 vorbereiteten Proben werden 15 Minuten lang bei 2.500 x g (4 °C) zentrifugiert, um großzellige Trümmer und verbleibende Blutplättchen zu entfernen.
  2. Die Überstände vorsichtig in neue und saubere 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und 30 min bei 16.800 x g (4 °C) zentrifugieren.
    Anmerkungen: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit kann auf über 10.000 x g eingestellt werden, um EVs12 zu extrahieren. Je höher die Drehzahl der Zentrifuge, desto mehr EVs können gewonnen werden. Da die Geschwindigkeitsbegrenzung der von uns verwendeten Zentrifuge bei 16.800 x g liegt (siehe Materialtabelle), haben wir diese Drehzahl in diesem Protokoll gewählt.
  3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 1 ml PBS. 30 min bei 16.800 x g (4 °C) zentrifugieren.
  4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 50 μl PBS. Lagern Sie diese Proben bei 4 °C nur für weniger als 24 h oder verwenden Sie sie vorzugsweise sofort für die folgenden Analysen (Schritte 3-5).
    ACHTUNG: Eine Lagerung bei -80 °C ist nicht akzeptabel, da dies die Konzentration von EVs verringert und die Partikelgrößen von EVs13 erhöht, was die folgende Analyse von EVs beeinflusst.

3. Morphologische Identifizierung von EVs

  1. Führen Sie eine NTA-Analyse durch.
    1. Je nach Menge der EVs (grob nach der Größe der Pellets beurteilt, sind die Partikel des 50-μl-Plasmas das Minimum) werden 5-50 μl Resuspension übertragen (Schritt 2.4), in 10 ml Pufferlösung verdünnt (PBS mit 0,22-μm-Filter filtriert) und mit 1-ml-Mikropipettenspitzen ausreichend gemischt. Verwenden Sie diese letzte Suspension für die Partikelmessung.
    2. Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Spritze, um mindestens 5 ml destilliertes Wasser mit einer moderaten und konstanten Geschwindigkeit zu injizieren, bis die Anzahl der auf der Detektionsschnittstelle angezeigten Partikel weniger als fünf beträgt.
      Anmerkungen: Nach der Injektion von 1 ml destilliertem Wasser durch den gesamten Kanal wird die Anzahl der Partikel direkt auf der Detektionsschnittstelle angezeigt. Wenn die Zahl immer noch über fünf liegt, injizieren Sie weiterhin 1 ml destilliertes Wasser, bis die Kriterien erfüllt sind.
    3. Rekonstituieren Sie 1 μl Kalibrierlösung in 1 ml destilliertem Wasser, um eine primäre Lösung zu erzeugen, und nehmen Sie dann 100 μl der primären Lösung auf 25 ml destilliertes Wasser, um eine Standard-Stammlösung (1:250.000) herzustellen. Lagern Sie dieses Arbeitsreagenz 1 Woche lang bei 4 °C.
    4. Kalibrieren Sie das NTA-Gerät mit der Standard-Stammlösung (Schritt 3.1.3). Injizieren Sie 1-5 ml der funktionierenden Kalibrierlösung mit einer sterilen 1-ml-Spritze, um den Maschinenkanal zu spülen, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel zwischen 50 und 400 (vorzugsweise etwa 300) liegt. Führen Sie das Kalibrierungsprogramm aus.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2, um den Gerätekanal vor jeder Probenmessung zu spülen.
    6. Verwenden Sie eine sterile 1-ml-Spritze, um mindestens 2 ml Pufferlösung zu injizieren, um den Maschinenkanal mit konstanter Geschwindigkeit zu spülen, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel weniger als 10 beträgt.
    7. 1 ml der in Schritt 3.1.1 vorbereiteten EV-Probe wird mit einer moderaten und konstanten Geschwindigkeit injiziert (die empfohlene Geschwindigkeit beträgt 0,5-1 ml/s).
      Anmerkungen: Die optimale Partikelkonzentration liegt darin, dass die Anzahl der auf der Detektionsschnittstelle angezeigten Partikel zwischen 50 und 400 liegt, vorzugsweise um die 300. Wenn die Anzahl der Partikel zu hoch ist, wiederholen Sie Schritt 3.1.2, um den Maschinenkanal sofort zu spülen, um ein Zurückhalten der Partikel an der Kanalwand zu vermeiden, und stellen Sie die Konzentration der EV-Probe mit Schritt 3.1.1 ein, und wiederholen Sie dann den Vorgang ab Schritt 3.1.5.
    8. Führen Sie die Partikelanalyse durch und erstellen Sie die Analyseberichte gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    9. Wenn es sich um eine kostbare Probe handelt, pumpen Sie die EV-Probe mit der 1-ml-Spritze zurück und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 2.2, um die EVs zu extrahieren.
    10. Nachdem Sie alle Proben detektiert haben, injizieren Sie mindestens 2 ml Pufferlösung in den Maschinenkanal und injizieren Sie dann mindestens 5 ml destilliertes Wasser, bis die auf der Detektionsschnittstelle angezeigte Anzahl der Partikel weniger als fünf beträgt.
    11. Verwenden Sie eine sterile 5-ml-Spritze, um mindestens 10 ml Luft mit konstanter Geschwindigkeit zu injizieren (die empfohlene Geschwindigkeit beträgt 1 ml/s), um das Wasser aus dem Kanal zu entfernen.
  2. Führen Sie eine TEM-Analyse durch.
    Anmerkungen: Führen Sie die folgenden Schritte mit neuen EV-Aufhängungen durch. Das mit Formvar-Kohlenstoff beschichtete Elektronenmikroskopgitter hat zwei Seiten, wobei die Arbeitsseite in den mittleren Gittern leuchtet. Das Mindestvolumen des Plasmas zur Extraktion der EVs für das folgende Verfahren beträgt 50 μl.
    1. Die EV-Probe (Schritt 2.4) wird mit einem gleichen Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) gemischt. 4 μl der EVs auf einem Gitter deponieren und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    2. Geben Sie vier Tropfen PBS (ein Tropfen entspricht 50 μl) auf eine Folie Polyethylenfolie (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die Gitter mit einer sauberen mikroskopisch kleinen Pinzette und waschen Sie die Arbeitsseite des Gitters in PBS von einem Tropfen zum anderen.
    3. Verwenden Sie Filterpapier, um überschüssiges PBS zu entfernen, das in den Gittern verblieben ist.
    4. Die Arbeitsseite des Gitters wird 2 Minuten lang in 1%ige Phosphowolframsäure (siehe Materialtabelle) inkubiert und dann Schritt 3.2.2 wiederholt.
      ACHTUNG: Da Phosphowolframsäure giftig ist, muss dieses Verfahren im Abzug durchgeführt werden, und überflüssige Phosphowolframsäure muss gezielt recycelt und nicht direkt entsorgt werden.
    5. Legen Sie die Roste mit der Vorderseite nach oben in eine 10 cm große Schüssel, die mit Filterpapier bedeckt ist. Die Gitter können mehrere Jahre bei RT gelagert werden.
    6. Betrachten Sie die Gitter unter dem Elektronenmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
      Anmerkungen: Um sicherzustellen, dass die einzelnen Partikel beobachtet werden, muss die Konzentration der EVs angepasst werden und die Suspension muss klar und ohne offensichtliche Trübung sein. Vor dem Abtropfen sollte die Probe gut durchmischt sein. Die repräsentativen TEM- und NTA-Analysen sind in Abbildung 2 dargestellt.

4. Herkunftsanalyse von Elektrofahrzeugen

HINWEIS: Die Identifizierung des zellulären Ursprungs von EVs erfordert die Anwendung von Antikörpern für typische Zellmembranmarker. Das minimale Plasmavolumen für die Extraktion der EVs für das folgende Verfahren beträgt 300 μl. Basierend auf den Lipiddoppelschichtstrukturen von EVs kann ein Membranfarbstoff verwendet werden, um sie zu markieren. Für Blutplasmaproben wird CD18 für Lymphozyten14 zur Repräsentation gewählt. Für Oberkieferknochenproben wird beispielhaft der Osteoklasten-assoziierte Rezeptor (OSCAR) für Osteoklasten15 ausgewählt. Stellen Sie vor dem FC sicher, dass das Durchflusszytometer für die Messung von EVs16 geeignet ist, da sich die untere Größengrenze zwischen verschiedenen Durchflusszytometern stark unterscheidet.

  1. Resuspendieren Sie die Proben (Schritt 2.4) mit 500 μl PBS und übertragen Sie 50 μl in ein neues und sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen als Leerkontrolle (Röhrchen A) und weitere 50 μl in ein neues und sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen als einfaches Färberöhrchen für FITC (Röhrchen B). Geben Sie 0,5 μl Membranfarbstoff in das Primärröhrchen für die Membranfärbung. 5 min bei RT inkubieren.
  2. Zentrifugieren Sie das Primärröhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C). Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 200 μl PBS.
  3. Teilen Sie jede 50-μl-Probe in vier 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf, um einfache Färberöhrchen für PE (Röhrchen C), Oberflächenmarkerfärbung (Röhrchen D) und reine Sekundärantikörperkontrollen (Röhrchen E) zu erhalten.
  4. Der primäre Antikörper von OSCAR in Knochen-EV-Proben sowie der CD18-Antikörper in Plasma-EV-Proben (siehe Materialtabelle) werden separat in Röhrchen B (Schritt 4.1) und Röhrchen D (Schritt 4.3) gegeben (verdünnt im Verhältnis 1:100). 1 h bei 4 °C inkubieren.
  5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C). Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Pellets mit 500 μl PBS und zentrifugieren Sie dann erneut 30 Minuten lang bei 16.800 x g (4 °C), um die zusätzlichen Primärantikörper zu entfernen.
  6. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets mit 50 μl PBS, gefolgt von der Zugabe von FITC-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) bzw. (verdünnt im Verhältnis 1:200) (Röhrchen E). Geben Sie die gleichen Sekundärantikörper in Röhrchen B (Schritt 4.1) und Röhrchen D (Schritt 4.3). Alle Röhrchen 1 h bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
    HINWEIS: Direkte fluoreszenzkonjugierte Markierungsantikörper können auch verwendet werden, um die FC-Detektion mit geeigneten Isotypkontrollen zu verarbeiten.
  7. Verdünnen Sie jeweils einen Tropfen der 0,2-, 0,5- und 1-μm-Beads-Suspension (siehe Materialtabelle) mit 1 ml PBS und lassen Sie zuerst jede Perlengröße laufen, um sicherzustellen, dass das für EVs gewählte Gate ausgewählt wurde. Legen Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers fest, um nach den Beads und der EV-Population zu suchen, indem Sie eine geeignete Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) verwenden.
    1. Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest. Analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Die repräsentativen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt.
      HINWEIS: NTA-Geräte mit Fluoreszenzkanälen können auch für die Ursprungsanalyse verwendet werden, und die Probenvorbereitung ist die gleiche wie bei FC.

5. Analyse des Proteingehalts von EVs

HINWEIS: Die Analyse des Proteingehalts in EVs erfolgt mittels Western Blot. So wurden beispielsweise die Plasma- und Knochen-EVs ausgewählt, um den Stoffwechselstatus der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (PID) und der Pyruvatkinase M2 (PKM2) zu analysieren. Golgin84 (das Golgi-Organell) wurde als Negativkontrolle verwendet, und Flotillin (Membranprotein), Caveolin (integrales Protein der Caveolae) und β-Aktin (das Zytoskelett)17 wurden als Positivkontrolle in EVs im Vergleich zu Zellproben verwendet. Mitofilin und α-Actinin-4 wurden als große EV-Marker ausgewählt, während CD9 und CD81 als kleine EV-Marker ausgewählt wurden, um die EV-Subpopulationen zu demonstrieren18. Apoa1 wurde als Plasma-Lipopartikel-Markerausgewählt 19. Details zu den jeweiligen Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle.

  1. Die Pellets werden in 50 μl RIPA-Lysepuffer resuspendiert (Schritt 2.4) und 30 Minuten auf Eis inkubiert.
  2. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentrationen aller Proben in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit dem BCA-Proteinassay gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    1. Verdünnen Sie die 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung (NS) (mit 0,9 % (w/v) Natriumchlorid) zu 0,5 mg/ml. Die 0,5 mg/ml BSA und 0,9 % NS werden in drei duplizierte Vertiefungen mit bestimmten Volumina gegeben, wie in Tabelle 1 dargestellt.
    2. Tropfen Sie 2 μl der Proben (Schritt 5.1) und geben Sie 18 μl NS separat in drei duplizierte Vertiefungen.
    3. Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie BCA-Reagenz A mit Reagenz B (50:1 Reagenz A:B) mischen. Geben Sie 200 μl der Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 30 s lang vorsichtig.
    4. Die 96-Well-Mikrotiterplatte wird für 20-25 min bei 37 °C inkubiert.
    5. Messen Sie den OD bei 596 nm mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
    6. Exportieren Sie die Daten.
    7. Zeichnen Sie eine Standardkurve und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben.
  3. Den Ergebnissen zufolge werden die Proben mit 0,9 % NS und 5x SDS-PAGE-Ladepuffer (250 mM Tris· HCl, pH 6,8, 10 % SDS, 30 % (v/v) Glycerin, 10 mM DTT, 0,05 % (w/v) Bromphenolblau, siehe Materialtabelle). Die Röhrchen mit Folie fest verschließen und 5 min bei 100 °C erhitzen.
  4. Laden Sie die Proben und die Proteinleiter in eine Gradientenkonzentration von 4%-20% Hepes-Tris-Gel (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Wählen Sie den Gelprozentsatz entsprechend dem Molekulargewicht der zu untersuchenden Proteine.
  5. Lassen Sie das Gel im Laufpuffer bei 80 V laufen, bis die Proteine eine Linie bilden, und schalten Sie dann für 1 Stunde auf 120 V um, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.
    Anmerkungen: Die Laufzeit kann je nach verwendeter Ausrüstung oder Art und Konzentration des Gels variieren.
  6. Übertragen Sie das Gel auf die Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 20 s lang in Methylalkohol. Verwenden Sie ein Nasstransfersystem, um 1 Stunde lang bei 200 mA zu übertragen.
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Transfersystem befinden, und halten Sie die PVDF-Membran feucht.
    HINWEIS: Die Übertragungszeit kann je nach Molekulargewicht des Zielproteins variieren. 1 KD benötigt in der Regel 1 min.
  7. Bereiten Sie einen 5%igen BSA-Blockierungspuffer vor, indem Sie 2,5 g BSA (siehe Materialtabelle) in 50 ml Tris-gepuffertem Kochsalzlösung-Tween (TBST) (2 ml Tween in 2 l PBS-Lösung) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Rühren, bis sich das Pulver aufgelöst hat. Blockieren Sie die Membranen in diesem Puffer für 2 h bei RT unter Rühren.
  8. Inkubieren Sie die Membranen mit spezifischen primären Antikörpern, die mit TBST verdünnt sind, in die richtige Konzentration (Mitofilin, 1:1000; α-Actinin-4, 1:1000; CD9, 1:1000; CD81, 1:1000; Apoa1, 1:1000; Golgin84, 1:1000; Flotillin-1, 1:1000; Caveolin-1, 1:1000; PID, 1:1000; PKM2, 1:1000; β-Aktin, 1:3000) über Nacht bei 4 °C.
  9. Waschen Sie die Membranen im Waschpuffer (2 mL Tween in 2 L PBS-Lösung) viermal (jeweils 15 min) und inkubieren Sie die Membranen mit den geeigneten Sekundärantikörpern bei 1:4000 für 1 h bei RT unter Rühren.
  10. Waschen Sie die Membranen viermal (jeweils 15 Minuten) im Waschpuffer und bilden Sie die Membranen mit dem Chemilumineszenz-Kit und einem Gel-Bildgebungssystem ab (siehe Materialtabelle).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entsprechend dem experimentellen Arbeitsablauf können EVs aus dem peripheren Blut und festen Geweben extrahiert werden (Abbildung 1). Der Oberkieferknochen einer Maus im Alter von 8 Wochen beträgt ca. 0,1 ± 0,05 g, und es können ca. 300 μl Plasma aus der Maus entnommen werden. Nach den Protokollschritten können 0,3 mg bzw. 3 μg EVs gesammelt werden. Wie mittels TEM und NTA analysiert, sind die typischen morphologischen Merkmale von EVs runde becherförmige Membranvesikel mit einem Durchmesser...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays 4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum Eins...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 und 81930025) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% Paraformaldehyd Biosharp143174Transmissionselektronenmikroskop
Alexa Fluor 488 Anti-Ziegen-SekundärantikörperYeason34306ES60Durchflusszytometrie
Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-SekundärantikörperInvitrogenA11008Durchflusszytometrie
Anti-CD18-AntikörperAbcamab131044Durchflusszytometrie
Anti-CD81-AntikörperAbcamab109201Western-Blot-Anti-CD9-Antikörper
HuabioET1601-9
Abcamab110329Western-Blot
APOA1 Kaninchen-pAbAbcloneA14211Western-Blot
BCA-Protein-Assay-KitTIANGENPA115Western-Blot
BLUeye Vorgefärbte ProteinleiterSigma-Aldrich94964-500ULWestern Blot
RinderserumalbuminMP Biomedical218072801Western Blot
Caveolin-1 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-53564Western Blot
CellMask Orange PlasmamembranfärbungInvitrogenC10045Durchflusszytometrie
ChemilumineszenzAmersham BiosciencesN/AWestern Blot
Gebogene OperationsschereJZ Chirurgisches InstrumentJ21040EV-Isolierung
Elektronische WaageZhi KeZK-DSTEV-Isolierung
Epochen-SpektralphotometerBioTekN/AWestern Blot
Eppendorf RöhrchenEppendorf3810XEV Isolierung
Flotillin-1 AntikörperPTM BIOPTM-5369Western Blot
Gel-Imaging-SystemTanon4600Western Blot
Golgin84Novusnbp1-83352Western Blot
Gitter - Formvar/Carbon Coated - Kupfer 200 meshPolysciences24915Transmissionselektronenmikroskop
Heparin LösungStemCell 7980EV-Isolierung
Liberase Research GradeSigma-Aldrich5401127001EV-Isolierung
Mikroskopische PinzetteJZ Chirurgisches InstrumentJD1020EV-Isolierung
NovoCyte DurchflusszytometerACEAN/ADurchflusszytometrie
Omni-PAGE Hepes-Tris Gele Hepes 4~20%, 10 WellsEpizymeLK206Western Blot
OSCAR( D-19) AntikörperSanta Cruz BiotechnologySC-34235Durchflusszytometrie
PBS (2x)ZHHCPW013Western Blot
Pentobarbital NatriumSigma-Aldrich57-33-0Anästhesieperoxidase
AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jacson115-035-003Western Blot
Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jacson111-035-003Western Blot
PhosphotungssäureRHAWN12501-23-4Transmissionselektronenmikroskop
PKM2(d78a4) xp Kaninchen  mab Cell Signaling4053tWestern Blot
Polyethylen (PE) FilmXiang yi200150055Transmissionselektronenmikroskop
Polyvinylidenfluorid-Membranen Roche3010040001Western Blot
Protease-InhibitorenRoche4693132001Western Blot
Rekombinanter Anti-PID-AntikörperAbcamab129199Western Blot
RIPA LysepufferBeyotimeP0013Western Blot
SDS-PAGE Ladepuffer (5x)CwbioCW0027SWestern Blot
BeadsInvitrogenF13839Durchflusszytometrie
Tisch-Hochgeschwindigkeits-MikrozentrifugenHitachiCT15EEV-Isolierung
TransmissionselektronenmikroskopHITACHIH-7650Transmissionselektronenmikroskop
Tween-20MP Biomedicals19472Western Blot
Vortex Mixer GenieScientific IndustriesSI0425EV-Isolierung
ZetaView BASIC NTA - Nanopartikel-Tracking-Videomikroskop PMX-120Particle MetrixN/ANanopartikel-Tracking-Analyse
α-Actinin-4 Kaninchen mAbAbcloneA3379Western Blot
β-AktinCwbioCW0096MWestern Blot
Western-Blot-Anti-Mitofilin-Antikörper

Referenzen

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