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Biology

Détection et quantification de nanotubes à effet tunnel à l’aide d’images 3D Volume View

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/63992
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India
* These authors contributed equally

Summary

Les nanotubes à effet tunnel (TNT) sont principalement des nanotubes à membrane F-actine ouverts qui relient les cellules voisines, facilitant ainsi la communication intercellulaire. La caractéristique notable qui distingue les TNT des autres protubérances cellulaires est la nature planante des nanotubes entre les cellules. Ici, nous caractérisons les TNT en construisant une vue de volume 3D d’images confocales z-stack.

Abstract

Des découvertes récentes ont révélé que les cellules effectuent un transfert intercellulaire direct à longue portée via des conduits actine-membrane à l’échelle nanométrique, à savoir des « nanotubes tunneling » (TNT). Les TNT sont définis comme des extensions membranaires ouvertes et entourées de bicouches lipidiques qui assurent la continuité entre les cellules voisines de diamètres compris entre 50 nm et 1 μm. Les TNT ont été initialement démontrés dans les cellules neuronales, mais des études successives ont révélé l’existence de TNT dans plusieurs types de cellules et maladies, telles que les maladies neurodégénératives, les infections virales et le cancer. Plusieurs études ont fait référence à des nanostructures membranaires à couplage électrique rapproché entre des cellules voisines en tant que TNT ou structures de type TNT.

L’élucidation de l’ultrastructure en termes de continuité membranaire à l’extrémité est techniquement difficile. En outre, les études sur la communication cellule-cellule sont difficiles en termes de caractérisation des TNT à l’aide de méthodes conventionnelles en raison de l’absence de marqueurs spécifiques. Les TNT sont principalement définis comme des protubérances membranaires ouvertes à base de F-actine. Cependant, une limitation majeure est que la F-actine est présente dans tous les types de protubérances, ce qui rend difficile la différenciation des TNT des autres protubérances. L’une des caractéristiques notables des TNT à base de F-actine est que ces structures oscillent entre deux cellules sans toucher le substrat. Par conséquent, les TNT distincts colorés à la F-actine peuvent être distingués d’autres protubérances telles que les filopodies et les neurites en fonction de leur vol stationnaire entre les cellules.

Nous avons récemment montré que l’internalisation de l’amyloïde-βoligomère 1-42 (oAβ) via l’endocytose actine-dépendante stimule la kinase-1 activée par p21 (PAK1), qui intervient dans la formation de TNT contenant de la F-actine coexprimée avec phospho-PAK1 entre les cellules neuronales SH-SY5Y. Ce protocole décrit une méthode d’analyse de volume 3D pour identifier et caractériser les TNT à partir des images z-stack capturées des protubérances membranaires immunocolorées F-actine et phospho-PAK1 dans les cellules neuronales traitées oAβ. De plus, les TNT se distinguent du développement de neurites et d’excroissances neuronales basées sur des conduits membranaires immunocolorés par la tubuline F-actine et β-III.

Introduction

Les nanotubes tunneliers (TNT) sont des conduits à membrane à base de F-actine, principalement ouverts, et jouent un rôle essentiel dans le transfert intercellulaire de cargaison et d’organites1. La caractéristique unique des TNT est qu’ils connectent des cellules voisines sans aucun contact avec le substrat; Ils mesurent plus de 10 à 300 μm de long et leur diamètre varie entre 50 nm et 1 μm 2,3. Les TNT sont des structures transitoires et leur durée de vie dure de quelques minutes à plusieurs heures. Les TNT ont d’abord été démontrés dans les cellules neuronales PC121; Plus tard, de nombreuses études ont montré leur existence dans plusieurs types cellulaires in vitro et in vivo 4,5. Plusieurs études ont révélé l’importance pathologique des TNT dans divers modèles de maladies, telles que les maladies neurodégénératives, le cancer et les infections virales 6,7,8.

Les hétérogénéités structurelles des TNT ont été démontrées par plusieurs études dans divers systèmes cellulaires9. Les différences sont basées sur la composition du cytosquelette, le mécanisme de formation et les types de cargaison transférés10. Principalement, la continuité membranaire ouverte et F-actine positive qui plane entre deux cellules voisines et transfère des organites est considérée comme constituée de TNT11. Cependant, le manque de clarté ou de diversité observé dans la formation des TNT ajoute à la difficulté de développer des marqueurs spécifiques au TNT. Ainsi, il est difficile d’identifier les structures TNT par des méthodes de détection conventionnelles et de distinguer les nanotubes membranaires en termes de protubérances ouvertes et fermées12. Cependant, la caractéristique des TNT de planer sous forme de protubérances de la membrane F-actine entre deux cellules est relativement plus facile et plus réalisable à identifier à l’aide de techniques d’imagerie conventionnelles. D’autres protubérances cellulaires à base d’actine telles que les filopodia et les filopodia dorsales ne peuvent pas planer entre deux cellules éloignées, en particulier lorsque les cellules sont fixes. Il convient de noter que les neurites en développement à extrémité fermée, couplées électriquement, sont souvent appelées structures de type TNT13.

On sait que la F-actine joue un rôle important dans la formation de TNT, et plusieurs études ont montré que l’inhibiteur de la F-actine cytochalasine D inhibe la formation de TNT14,15. En revanche, les inhibiteurs des microtubules n’ont aucun effet sur la formation de TNT16. Les 2 dernières décennies ont vu plusieurs rapports sur le rôle important que jouent les TNT dans la propagation de la pathologie et de la résistance tumorale et de la thérapie17. Par conséquent, il existe une demande sans fin pour de meilleures techniques de caractérisation du TNT.

L’absence de marqueurs spécifiques des TNT et la diversité de la morphologie et de la composition du cytosquelette rendent difficile le développement d’une méthode unique de caractérisation. Certaines études ont utilisé des techniques automatisées de détection d’images et de quantification TNT18,19. Cependant, la méthode actuelle d’analyse manuelle de volume 3D présente plusieurs avantages par rapport à l’analyse automatique d’images pour la détection et la quantification des TNT. Souvent, des yeux humains entraînés peuvent repérer ces nanostructures en vol stationnaire plus facilement qu’une méthode de détection d’images automatisée. De plus, les méthodes de détection automatique pourraient être difficiles à mettre en œuvre dans des laboratoires dépourvus d’expertise en algorithmes. La méthode actuelle pourrait être largement adoptée par les chercheurs en raison de sa précision et de sa reproductibilité.

Dans une étude récente, nous avons montré que l’oAβ favorise la biogenèse des TNT dans les cellules neuronales via un mécanisme d’endocytose médié par PAK1, dépendant de l’actine12. Les TNT induits par oAβ expriment également PAK1 activé (ou phospho-PAK1). Nous avons développé une méthode de reconstruction d’images en vue de volume 3D pour distinguer les TNT immunocolorés par oAβ, F-actine et phospho-PAK1. Les neurones en développement positifs à la tubuline β-III ressemblent souvent à des structures planantes de type TNT20. Par conséquent, nous avons en outre distingué les TNT à base de F-actine des neurites positifs à la tubuline β-III et d’autres protubérances de type TNT. Les images de volume 3D ont été utilisées pour identifier les TNT sur la base de leurs caractéristiques de vol stationnaire au-dessus du substrat et de rester connectés entre deux cellules voisines. Cet article décrit l’identification et la détection de conduits membranaires contenant de l’actine ou de TNT à l’aide d’images confocales z-stack et, enfin, la quantification manuelle des structures identifiées à partir d’images de reconstruction de vue de volume 3D. La méthode présentée ne permet pas de distinguer les TNT propres ouverts des structures fermées de type TNT; cette méthode permet d’identifier les TNT en culture cellulaire 2D in vitro sur un substrat plat. Cependant, la méthode est facile à mettre en œuvre et à reproduire et peut être largement utilisée pour la quantification précise des TNT à base d’actine et pour les distinguer des neurites et des structures de type TNT positives à la β-tubuline.

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Protocol

REMARQUE : Les cellules SH-SY5Y cultivées en milieu DMEM/F-12 ont été différenciées avec de l’acide rétinoïque 10 μM pendant 7 jours et traitées avec des oligomères oAβ de 1 μM pendant 2 h à 37 °C (5 % de CO2). Après traitement, les cellules ont été fixées avec la solution fixatrice de Karnovsky et double-immunocolorées avec des anticorps phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) et une phalloïdine liant la F-actine. Plus tard, des images confocales z-stack ont été prises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les TNT ont été quantifiés par comptage manuel et distingués des autres neurites / protubérances cellulaires en construisant des images de vue de volume 3D et en identifiant les structures à partir de leur caractéristique de vol stationnaire entre deux cellules sans toucher le substrat (Figure 1).

1. Culture cellulaire et différenciation

  1. Culture des cellules neuronales SH-SY5Y dans un milieu DMEM/F12 (Ham’s) 1:1 avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de mélange pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN). Ensemencez les cellules dans une boîte d’imagerie de 35 mm avec un puits de 14 mm composé d’une lamelle de couverture #1.5 au centre de la capsule fixée au fond. Ensemencer les cellules sur la boîte d’imagerie à une concentration de 12 000 cellules/cm2 et effectuer les expériences à 60%-70% de confluence.
  2. Différencier partiellement les cellules avec 10 μM d’acide rétinoïque (PR) d’une solution mère de 100 mM (5 mg de PR dans 15 mL de diméthylsulfoxyde [DMSO]). Ensuite, incuber les cellules pendant 7 jours à 37 °C (5% CO 2) pour la différenciation avec changement de milieu tous les2 jours.
    REMARQUE: Soyez prudent quant au maintien de la confluence (60% -70%) des cellules (cellules indifférenciées et partiellement différenciées). La densité cellulaire peut influencer la formation de TNT entre les cellules.

2. Préparation d’oligomères d’amyloïde-β1-42 (oAβ) pour traiter les cellules neuronales

  1. Dissoudre Aβ 1-42 (1 mg) dans 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol et diviser la solution en 20 aliquotes, contenant chacune 0,05 mg de peptides. Lyophiliser et conserver les aliquotes à −20 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Préparer la solution mère (5 mM) de l’Aβ 1-42 lyophilisé dans le DMSO en ajoutant 2,2 μL de DMSO à 0,05 mg de peptide lyophilisé. Pour dissoudre soigneusement les peptides, vortex la solution et sonicate pendant 2 minutes dans un sonicateur au bain-marie.
  3. Diluer la solution mère à une concentration de 100 μM dans le DMEM, pH 7,4, et vortex pour convertir les peptides en monomères, suivi d’une incubation à 4 °C pendant 24 h pour obtenir des oligomères de Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
  4. Caractériser oAβ avant les expériences comme rapporté précédemment21,22 par imagerie par microscopie électronique à transmission.
  5. Traiter les cellules SH-SY5Y partiellement différenciées avec 1 μM oAβ. Retirez le milieu avant les traitements et ajoutez du DMEM frais sans FBS. Après le changement de milieu, ajouter de l’oAβ préalablement préparé (100 μM) au milieu jusqu’à une concentration finale de 1 μM. Incuber les cellules avec 1 μM oAβ pendant 2 h à 37 °C (5% CO2). Inclure un contrôle négatif sous la forme de cellules non traitées.

3. Immunocoloration de la F-actine et de la PAK1 activée pour la caractérisation des TNT

  1. Effectuer une immunomarquation différentielle en utilisant l’anticorps phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) et la phallotoxine de liaison à la F-actine phalloïdine.
  2. Laver les cellules témoins et les cellules traitées à l’oAβ avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 x 2 min avant la fixation. Préparer la solution fixatrice de Karnovsky en utilisant un fixateur de formol à 2% et 2,5% de glutaraldéhyde dissous dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2. Ensuite, fixez les cellules dans la boîte d’imagerie en ajoutant la solution fixatrice de Karnovsky (juste assez pour couvrir les cellules) pendant 45 minutes à température ambiante.
  3. Lavez les cellules fixes 2 x 2 min à l’aide d’un tampon d’incubation. Préparer le tampon d’incubation (20x) en dissolvant 0,1 g de saponine dans 5 mL de FBS et diluer à 1x en ajoutant 95 mL de 1x PBS.
  4. Après fixation, ajouter le premier anticorps contre le phopho-PAK1 à une dilution de 1:250 dans le tampon d’incubation et incuber pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humide et sombre.
  5. Le lendemain, après 24 h d’incubation, laver les cellules 2 x 2 min avec le tampon d’incubation ; Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (dilution 1:1 000) et Phalloïdine 555 (dilution 1:1 000). Incuber les cellules dans la chambre humide foncée pendant 1,5 h à température ambiante.
  6. Après l’incubation, laver les cellules 2 x 2 min avec un tampon d’incubation. Colorer le noyau en ajoutant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans une dilution 1:2 000 et incuber pendant 5 min à 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
  7. Préparer le support de montage DABCO en utilisant 25 mg de DABCO dans 90% de glycérol et 10% 1x PBS. Pour dissoudre correctement, ajuster le pH à 8,6 en utilisant le grade spectrophotométrique, diluer HCl (dilué 1:20 avec de l’eau) et conserver la solution sur une bascule pour le mélange.
  8. En tant qu’agent antiblanchissant, ajoutez le support de montage DABCO directement sur l’antenne d’imagerie contenant la lamelle de couverture en bas. Attendez au moins 1-2 h et procédez directement à l’imagerie confocale.
    REMARQUE: Aucun adhésif n’est nécessaire pour fixer les lamelles de couverture.

4. Immunomarquage de la F-actine et de la tubuline β-III pour distinguer les TNT des neurites

  1. Effectuer une immunocoloration différentielle avec l’anticorps β-III tubuline et la phallotoxine de liaison à la F-actine phalloïdine.
  2. Lavez les cellules traitées à l’oAβ 2x avec 1x PBS avant d’ajouter la solution fixatrice de Karnovsky. Incuber les cellules pendant 45 min à température ambiante et laver les cellules 2 x 2 min avec un tampon d’incubation.
  3. Après fixation, ajouter l’anticorps contre la tubuline β-III (TUBb3) à une dilution de 1:250 dans le tampon d’incubation et incuber à 4 °C pendant une nuit dans la chambre humide et sombre.
  4. Le lendemain, laver les cellules avec un tampon d’incubation (2 x 2 min) et ajouter l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (dilution 1:1 000) et Phalloïdine 555 (dilution 1:1 000) ensemble dans la même boîte. Ensuite, incuber les cellules pendant 1,5 h à température ambiante dans la chambre humide sombre.
  5. Lavez les cellules 2x avec un tampon d’incubation et ajoutez du DAPI à coloration nucléaire dans une dilution 1:2 000 pendant 5 à 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
  6. Ajouter l’agent anti-blanchiment DABCO dans le support de montage comme mentionné ci-dessus et attendre 2 h avant l’imagerie.

5. Imagerie par microscopie confocale

  1. Pour identifier les TNT, capturez des images z-stack de cellules immunocolorées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Prenez les images à l’aide de l’objectif DIC d’huile 40x/1.40 avec des ensembles de filtres DAPI, isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et tétraméthylrhodamine (TRITC).
  2. Tout d’abord, sélectionnez les canaux en cliquant séquentiellement sur les lasers requis dans les fenêtres Piste 1, Piste 2 et Piste 3 dans le logiciel confocale. Cliquez sur l’option T-PMT sous la fenêtre Piste 1 pour prendre les images de contraste d’interférence différentielle (DIC) avec des canaux de fluorescence.
    REMARQUE: Les images DIC sont capturées par un détecteur différent étiqueté T-PMT.
  3. Sélectionnez l’onglet acquisition du logiciel, cliquez sur l’onglet Z-stack et attendez qu’une fenêtre s’ouvre. Ensuite, cliquez sur Live Scan pour concentrer les cellules au bas de la boîte. Sélectionnez cette image focalisée comme première pile. Ensuite, concentrez-vous vers le haut pour voir la partie supérieure de la cellule et sélectionnez-la comme dernière pile. Arrêtez l’analyse en direct et cliquez sur le numéro à côté de l’onglet optimal pour fixer la taille des pas des piles. La taille des pas détermine le nombre de tranches et les intervalles en fonction de l’épaisseur des cellules.
    REMARQUE: La taille des pas sera sélectionnée en fonction de l’échantillonnage de Nyquist pour prendre suffisamment de tranches et s’assurer qu’il n’y a pas d’espace entre les deux piles. L’échantillonnage de Nyquist est déterminé sur la base de l’objectif et des longueurs d’onde des lumières23.
  4. Prenez des images séquentielles de trois canaux de DAPI, FITC et TRITC avec des lasers de 405 nm, 488 nm et 561 nm et capturez avec un temps de séjour de pixel de 1,02 μs. Capturez des images dans le canal DIC avec des canaux de fluorescence pour observer la limite cellulaire.
  5. Capturez une pile d’images avec les dimensions de x: 224,92 μm et y: 224,92 μm, avec chaque pixel de taille220 nm 2 et z-scaling de 415 nm.
  6. Prenez des images en capturant plusieurs piles z (15-22 piles) du bas vers le haut des cellules. Acquérir au moins 10 images du champ aléatoire de la boîte de culture pour obtenir un total de ~200-300 cellules.
  7. Analyser les images capturées hors ligne pour identifier les TNT par analyse de volume 3D

6. Analyse d’images confocales z-stack pour identifier et quantifier les TNT

  1. Ouvrez les images confocales enregistrées au format de données .czi dans le logiciel Fiji pour analyse.
  2. Sélectionnez l’option Hyperstack pour voir chaque z-stack et canal de l’image. Recherchez les hyperpiles des piles z et des canaux, qui s’ouvrent dans une seule fenêtre, comme illustré à la figure 2. Faites défiler les barres de défilement du canal (indiqué par des flèches rouges et vertes) et de la pile z (indiqué par des flèches bleues) pour sélectionner la pile exacte d’un canal d’intérêt particulier.
    REMARQUE: Dans les cellules fixes, comme les TNT en vol stationnaire ou les conduits membranaires restent au-dessus de la surface, les structures ne sont pas visibles dans les parties inférieures des piles z. Cependant, dans les cellules fixes, les neurites se trouvent à la surface et sont détectables dans les parties inférieures des piles z (z = 0 à 2). Voir la figure 2 pour les étapes d’identification.
  3. Comme illustré à la figure 2, sélectionnez d’abord le canal coloré F-actine (indiqué par des flèches rouges) en faisant défiler la barre de couche. Ensuite, faites défiler manuellement les z-stacks (indiquées par des flèches bleues) pour voir chaque pile une par une. Identifiez les structures colorées par la F-actine qui semblent relier les cellules, sont visibles dans les parties inférieures des piles z et sont proches de la surface de l’antenne d’imagerie (z = 2) sous forme de neurites (indiquées par des flèches blanches).
    REMARQUE: La majorité des neurites sont faciles à identifier car ils apparaissent comme des protubérances étendues (indiquées par des flèches roses).
  4. Identifiez les TNT, les conduits de cellule à cellule en vol stationnaire F-actine positifs, en faisant défiler les piles z vers le haut (de z = 4 dans la figure 2; indiqué par des flèches jaunes). Recherchez les neurites près des parties inférieures des piles z vers la surface et observez qu’elles commencent à disparaître avec le défilement des piles z vers le haut (à z = 6 sur la figure 2; les neurites ne sont pas clairement visibles).
  5. Identifier les TNT phospho-PAK1-positifs de la même manière que les TNT F-actine positives en analysant la nature planante des conduits des piles z. Comme la coloration phospho-PAK1 est plus faible que la coloration F-actine, recherchez les TNT colorés au phopho-PAK1 à z = 4 (faiblement visible) et à z = 6 (proéminent).
  6. De plus, observez les images DIC pour vérifier que les structures TNT colorées par F-actine et phospho-PAK1 sont des conduits membranaires entre les cellules (Figure 3). De plus, fusionner les canaux F-actine (rouge) et phospho-PAK1 (vert) pour vérifier que les TNT identifiées sont des structures cocolorées F-actine et phospho-PAK1 (Figure 3).
  7. Pour quantifier les TNT, comptez manuellement le nombre total de cellules et les TNT identifiées et représentez les nombres en pourcentages.
  8. Pour distinguer les TNT F-actine positives et la tubuline β-III positive (TUBb3) des conduits stationnaires de type TNT des images z-stack, fusionnez les canaux F-actine (rouge) et TUBb3 (vert) (Figure 4). Ensuite, analysez les z-stacks des images fusionnées.
    1. Recherchez exclusivement des TNT colorés à la F-actine qui sont faiblement visibles à z = 3 et proéminents à z = 6 et z = 9 (flèches jaunes). De même, identifiez les conduits stationnaires de type TNT de type TNT de la F-actine et de la tubuline β-III (TUBb3) à z = 6 et z = 9 (flèches cyan). Identifier d’autres protubérances non stationnaires colorées par la tubuline F-actine et β-III provenant des parties inférieures des piles z (flèches blanches).
  9. Mesurer le diamètre des TNT à l’aide de l’outil de ligne aux Fidji. Vérifiez l’échelle de mesure en cliquant sur Analyser | Réglez l’échelle de sorte que la « distance en pixels » soit définie automatiquement à partir des images .czi. Mesurez les diamètres des TNT au niveau du plan xy.
    REMARQUE: La plupart des diamètres sont compris entre 1 pixel et 4 pixels (c .-à-d. 220-880 nm); Chaque pixel est de 220 nm. Voir la figure 5 pour un résumé du protocole d’analyse des images confocales z-stack.

7.3D reconstruction d’images z-stack pour caractériser les TNT

  1. Utilisez le plug-in de visualisation de volume aux Fidji, qui permet le redécoupage 3D et la visualisation 3D à seuil (Figure 6).
  2. Divisez les images z-stack en canaux individuels. Ensuite, rognez les images z-stack monocanal (canal F-actine) pour utiliser la vue de reconstruction 3D afin de mettre en évidence un ou deux TNT ou neurites à la fois. Activez le plug-in de vue de volume pour visualiser les vues xy, yz et xz.
  3. Épinglez un seul TNT ou neurite dans le plan xy (les flèches blanches représentent les neurites de la figure 6A ; les flèches jaunes représentent les TNT de la figure 6B) et marquez les coupes transversales des axes xz (rouge) et yz (vert). Observez les neurites au bas du plan xz dans les plans xz et yz (flèches blanches, Figure 6A) et les TNT dans les piles z supérieures (flèches jaunes, Figure 6B).
  4. Sélectionnez le TNT ou le neurite individuel pour reconstruire la vue du volume 3D dans le plan xz (Figure 6C, D). Dans la reconstruction 3D, observez les neurites au bas du plan z (flèches blanches, Figure 6C) et les TNT apparaissant comme des structures planantes reliant deux cellules sans toucher le plan z inférieur (flèches jaunes, Figure 6D).

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Representative Results

Ici, nous identifions et caractérisons les TNT induits par oAβ dans les cellules neuronales SH-SY5Y en construisant des vues de volume 3D à partir d’images confocales z-stack (Figure 1). Les cellules ont été doublement immunocolorées avec F-actine et phospho-PAK1. Des images confocales de cellules immunocolorées ont été analysées pour identifier les TNT (Figure 2). De plus, les images DIC ont été analysées pour vérifier que les structures TNT colorées F-actine et phospho-PAK1 étaient des conduits membranaires entre les cellules (Figure 3). De plus, les cellules ont été doublement immunocolorées avec de la F-actine et de la tubuline β-III (Figure 4). Les conduits à membrane double positive de la F-actine de type TNT et de la tubuline β-III ont été distingués uniquement des TNT F-actine positifs (Figure 4). Les TNT coexprimés avec le phospho-PAK1 (ou PAK1 activé) et la F-actine ont été distingués des autres neurites / protubérances cellulaires en construisant des images de vue de volume 3D basées sur leur caractéristique de vol stationnaire entre deux cellules sans toucher le substrat (Figure 6). Les TNT identifiés ont été repérés manuellement et le pourcentage de TNT a été calculé avec précision à partir des images de la vue de volume 3D. Le diamètre et la longueur des TNT ont également été déterminés en analysant les TNT identifiés individuellement.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique représentant le résumé du protocole de la méthode de détection des TNT. Barre d’échelle = 100 μm pour les images de microscopie (en haut); 10 μm (vues de volume 3D). Abréviations : oAβ = oligomère amyloïde-β1-42; PAK1 = kinase-1 activée par p21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse d’images confocales z-stack pour identifier et quantifier les TNT. Les images confocales z-stack ont été analysées dans le logiciel Fidji. Hyperstacks de z-stacks et de canaux ouverts dans une seule fenêtre montrant (A) F-actine et (B) phospho-PAK1. En faisant défiler les barres de défilement du canal (indiqué par des flèches rouges et vertes) et de la pile z (indiquée par des flèches bleues), les piles individuelles d’un canal d’intérêt particulier ont été analysées. (A) Les structures colorées à la F-actine reliant les cellules, visibles dans les parties inférieures des piles z et considérées comme proches de la surface de la boîte d’images (z = 2) ont été identifiées comme des neurites (indiquées par des flèches blanches). En revanche, les conduits connectés de cellule à cellule visibles dans les parties supérieures des piles z ont été identifiés comme des TNT (indiqués par des flèches jaunes). (B) De même, des neurites et des TNT colorés phospho-PAK1 ont été identifiés. D’autres saillies courtes F-actine positives qui ne sont pas connectées aux cellules voisines sont indiquées par des flèches roses. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : TNT = nanotubes à effet tunnel; PAK1 = kinase-1 activée par p21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse des images de CIVD pour confirmer les TNT. (A) Des images de CID ont été observées pour vérifier que les TNT et les protubérances de neurites colorées à la F-actine et au phospho-PAK1 étaient bien des conduits membranaires. (B) De plus, les canaux F-actine (rouge) et phospho-PAK1 (vert) ont été fusionnés pour vérifier que les TNT identifiés induits par oAβ étaient des structures co-colorées F-actine et phospho-PAK1. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : TNT = nanotubes à effet tunnel; DIC = contraste d’interférence différentielle; PAK1 = kinase-1 activée par p21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images confocales z-stack analysées à l’aide d’un logiciel fidjien pour distinguer uniquement les TNT colorés par la F-actine de la tubuline β-III et des conduits stationnaires à double coloration F-actine de type TNT. Tout d’abord, les canaux F-actine (rouge) et TUBb3 (vert) des hyperpiles ont été fusionnés. Ensuite, les images fusionnées ont été ouvertes dans une seule fenêtre. En faisant défiler les barres de défilement z-stack, les TNT colorés à l’actine F ont été identifiés exclusivement; ceux-ci étaient faiblement visibles à z = 3 et proéminents à z = 6 et z = 9 (flèches jaunes, B). De même, les conduits stationnaires de type TNT à double positif F-actine et TUBb3 étaient détectables à z = 6 et z = 9 (flèches cyan, A). D’autres protubérances non stationnaires colorées à la tubuline F-actine et β-III ont été identifiées dans les parties inférieures des piles z (flèches blanches). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : TNT = nanotubes à effet tunnel; TUBb3 = tubuline β-III. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résumé schématique représentant le protocole détaillé pour l’analyse des images confocales z-stack. Abréviation : TNT = nanotubes tunneliers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Vue de reconstruction 3D pour mettre en évidence un ou deux TNT ou neurites à la fois. Le plugin « volume view » aux Fidji est utilisé pour visualiser les vues xy, yz et xz. La reconstruction 3D montre des neurites se trouvant au bas du plan z (flèches blanches dans les panneaux A et C), tandis que les TNT apparaissent comme des structures planantes qui relient deux cellules sans toucher le plan z inférieur (flèche jaune dans les panneaux B et D). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviation : TNT = nanotubes tunneliers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Plusieurs chercheurs au cours des 2 dernières décennies ont essayé de comprendre et de caractériser la structure des TNT18. L’absence de marqueurs spécifiques entrave les progrès, et il existe une demande croissante pour une méthode pratique et normalisée qui peut être utilisée pour identifier, caractériser et quantifier les TNT. Les TNT sont définis comme des conduits membranaires à base de F-actine qui planent entre deux cellules. Des études ont montré que les β-tubuline positives, fermées et en développement des neurites oscillent entre deux cellules distantes et ressemblent à des structures de type TNT12,13. Par conséquent, les TNT sont identifiés et distingués des neurites et autres structures de type TNT en fonction de leur positivité à l’actine et en tant que conduits membranaires qui planent entre deux cellules éloignées. Les chercheurs trouvent souvent difficile d’obtenir des structures TNT intactes lors de la fixation avant l’imagerie24. Pour pallier ce problème, nous avons utilisé une solution fixatrice modifiée avec 2,5% de glutaraldéhyde (fixateur de Karnovsky) pour fixer les cellules neuronales SH-SY5Y utilisées dans ce protocole25.

Une étape critique de chaque expérience d’immunohistochimie/immunocytochimie est la fixation de l’échantillon, qui repose sur la sélection de l’agent fixateur approprié. Une fixation imparfaite de l’échantillon peut entraîner une dégradation protéolytique rapide des protéines cibles et une réduction de l’immunoréactivité spécifique. La surfixation provoque le masquage de l’épitope et l’incertitude dans l’étiquetage spécifique causée par le fond non spécifique. La méthode, le moment ou la durée, la température et le pH influencent également la bonne fixation des cellules26.

Le paraformaldéhyde est largement utilisé comme agent fixateur dans l’immunomarquage des cellules. Les inconvénients de l’utilisation du paraformaldéhyde comme agent fixateur comprennent la perte d’antigénicité et les changements de morphologie. Le glutaraldéhyde a une pression osmotique plus faible, est plus stable en solution et réticulait facilement, donnant ainsi de meilleurs résultats27. Une combinaison de fixateur formaldéhyde-glutaraldéhyde (dans le tampon phosphate) permet une fixation exceptionnelle d’un large éventail d’échantillons de tissus / cellules. Cette combinaison permet une stabilisation rapide de l’ultrastructure de la cellule par le formaldéhyde, suivie d’une fixation permanente par l’action pénétrante plus lente du glutaraldéhyde28.

Les TNT positifs pour la F-actine et la phospho-PAK1 se distinguent des neurites en fonction de leur caractéristique de vol stationnaire entre deux cellules en culture cellulaire 2D in vitro sur un substrat plat. Les TNT identifiés ont été repérés manuellement avec une analyse de vue de volume 3D, et les pourcentages de TNT formés ont été calculés par comptage manuel. La méthode manuelle rend difficile la quantification de grandes quantités de données car elle nécessite une main-d’œuvre immense19. Cependant, les yeux entraînés peuvent repérer efficacement les TNT et les distinguer des neurites avec une meilleure précision que les méthodes de détection automatique. Les méthodes de détection automatique existantes sont également difficiles à mettre en œuvre dans tous les laboratoires sans l’expertise disponible pour développer un algorithme et / ou modifier l’algorithme existant comme requis pour la configuration expérimentale. La méthode manuelle d’analyse de la vue de volume 3D facilite l’identification des structures membranaires situées entre les cellules dans les parties inférieures des piles z et celles planant dans les parties moyennes et supérieures des piles z pour distinguer clairement les neurites des TNT.

Les TNT peuvent être distingués d’autres protubérances membranaires telles que les neurites ou les microtubes tumoraux. Cependant, il est difficile de faire la distinction entre les tubes à membrane ouverts et fermés, de taille nanométrique et de diamètre, ce qui soulève la question suivante: s’agit-il de TNT ou de structures de type TNT? Depuis la dernière décennie, une énorme quantité de données a été accumulée pour montrer le rôle inévitable des TNT dans la propagation de la pathologie, de la résistance au cancer et de la thérapie17. Par conséquent, les chercheurs recherchent le développement de fabricants spécifiques qui changeront le domaine de la communication intercellulaire directe à longue distance. D’ici là, les méthodes d’imagerie reproductibles de caractérisation sont très demandées pour ouvrir la voie à des progrès continus dans le domaine.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

D.K.V et A.R remercient l’Académie d’enseignement supérieur de Manipal pour la bourse TMA Pai. Nous remercions le Science and Engineering Research Board of India pour SERB-SRG (#SRG/2021/001315), ainsi que le Conseil indien de la recherche médicale de l’Inde (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) et le fonds intra-muros de l’Académie d’enseignement supérieur de Manipal, Manipal, Inde. Nous remercions l’installation confocale du JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Inde) et B. Suma pour la microscopie confocale du JNCASR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip Cellvis D35-14-1.5-N Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg AnaSpec #64129 Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11070 Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet Thermo Scientific (MSC Advantage) 51025411 Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) 51026556 For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS (Carl Zeiss) LSM 880 Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] Merck 8034560100 Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-1MG Neuclear stainer
DMEM media Gibco 11965092 Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
 DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) Gibco 12500062 Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade Cryopur CP-100 Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade Himedia MB058 Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044  Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) Sigma Aldrich HT5014-120ML Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) Sigma G5882 Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution TCI H024 Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) National Institute of Health (NIH) Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer Christ, Alpha 2.4 LDplus 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture Thermo fisher Scientific 15640055 Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555 Abcam ab176756 F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] CST #2601 Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) Cloud clone PAE711Hu01 Primary antibody
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Differentiating reagent
Saponin Merck 8047-15-2 Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) Ultrasonic Cleaner 3.0 L/3.2 Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software ZEISS (Carl Zeiss) Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation

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References

  1. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  2. Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
  3. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
  4. Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
  5. Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
  6. Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
  7. Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
  8. Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
  9. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
  10. Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
  11. Zurzolo, C. Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity. Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).
  12. Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
  13. Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
  14. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  15. Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
  16. Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
  17. Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
  18. Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
  19. Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
  20. Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
  21. Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
  22. Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
  23. Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
  24. Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
  25. Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
  26. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
  27. Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
  28. Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).

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Biologie numéro 186 Transfert intercellulaire nanostructures β amyloïde kinase activée par p21 piles z confocales image de volume 3D immunomarquage nanotubes à effet tunnel F-actine
Détection et quantification de nanotubes à effet tunnel à l’aide d’images 3D Volume View
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Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, S. Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images. J. Vis. Exp. (186), e63992, doi:10.3791/63992 (2022).

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