Method Article

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fortschritte bei immunbasierten Therapien haben die Krebsbehandlung und -forschung revolutioniert. Dies hat eine wachsende Nachfrage nach der Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft ausgelöst. Obwohl die Standard-Immunhistochemie für die Untersuchung der Gewebearchitektur geeignet ist, beschränkt sie sich auf die Analyse einer kleinen Anzahl von Markern. Umgekehrt können Techniken wie die Durchflusszytometrie mehrere Marker gleichzeitig auswerten, obwohl Informationen über die Gewebemorphologie verloren gehen. In den letzten Jahren haben sich Multiplexstrategien, die phänotypische und räumliche Analysen integrieren, als umfassende Ansätze zur Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft herausgebildet. Hier diskutieren wir eine innovative Technologie, die metallmarkierte Antikörper und Sekundärionen-Massenspektrometrie kombiniert und sich auf die technischen Schritte in der Assay-Entwicklung und -Optimierung, Gewebevorbereitung sowie Bildaufnahme und -verarbeitung konzentriert. Vor der Färbung muss ein metallmarkiertes Antikörperpanel entwickelt und optimiert werden. Dieses Hi-Plex-Bildsystem unterstützt bis zu 40 metallmarkierte Antikörper in einem einzigen Gewebeabschnitt. Bemerkenswert ist, dass das Risiko von Signalinterferenzen mit der Anzahl der im Panel enthaltenen Marker zunimmt. Nach dem Panel-Design sollte besonders auf die Metallisotopenzuordnung zum Antikörper geachtet werden, um diese Interferenz zu minimieren. Vorläufige Paneltests werden mit einer kleinen Untergruppe von Antikörpern und anschließende Tests des gesamten Panels in Kontrollgeweben durchgeführt. Formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte werden gewonnen und auf goldbeschichtete Objektträger montiert und weiter gefärbt. Die Färbung dauert 2 Tage und ähnelt stark der immunhistochemischen Standardfärbung. Sobald die Proben gefärbt sind, werden sie in das Bildaufnahmegerät gelegt. Sichtfelder werden ausgewählt, Bilder werden erfasst, hochgeladen und gespeichert. Der letzte Schritt ist die Bildaufbereitung zur Filterung und Beseitigung von Störungen mit der Bildverarbeitungssoftware des Systems. Ein Nachteil dieser Plattform ist das Fehlen von Analysesoftware. Die erzeugten Bilder werden jedoch von verschiedenen Computerpathologie-Software unterstützt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Bedeutung der zahlreichen Zelltypen, die klonale Tumorpopulationen umgeben, ist ein entscheidendes Element bei der Kategorisierung der Karzinogenese. Das Interesse an der Aufklärung dieser Zusammensetzung und Wechselwirkungen der Tumormikroumgebung (TME) ist nach der Etablierung der immunbasierten Therapie als Teil des Krebsbehandlungsarsenals kontinuierlich gestiegen. Daher haben sich die Behandlungsstrategien von einem tumorzentrierten Ansatz zu einem TME-zentrierten Ansatz verlagert1.

Die Bemühungen, die Rolle von Immunzellen bei der Tumorüberwachung und Krebsentstehung aufzuklären, haben in den letzten Jahren auffallend zugenommen 2,3. In der medizinischen Forschung entstand eine Vielzahl von Methoden, darunter zytometrische Methoden und Singleplex- und Multiplex-Bildgebungstechnologien, als Teil dieses Versuchs, die einzigartigen Wechselwirkungen mehrerer Elemente von TMEs zu entschlüsseln.

Bahnbrechende Methoden wie die Durchflusszytometrie (erfunden in den 1960er Jahren), die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und die Massenzytometrie konzentrieren sich hauptsächlich auf die Identifizierung und Quantifizierung von TME-Komponenten4. Obwohl zytometrische quantitative Techniken eine Phänotypisierung der Immunlandschaft ermöglichen, ist die Bestimmung der zellulären räumlichen Verteilung unmöglich. Umgekehrt erhalten Methoden wie die Standard-Singleplex-Immunhistochemie die Gewebearchitektur und ermöglichen es den Forschern, die zelluläre Verteilung zu analysieren, obwohl eine reduzierte Anzahl von Zielen in einem einzelnen Gewebeabschnitt eine Einschränkung dieser Methoden darstellt 5,6. In den letzten Jahren haben sich Multiplex-Bildgebungstechnologien für die Einzelzellauflösung wie Multiplex-Immunfluoreszenz, Barcoding-Fluoreszenzbildgebung und bildgebende Massenspektrometrie als umfassende Strategien zur Gewinnung von Informationen über die gleichzeitige Markerfärbung unter Verwendung desselbenGewebeabschnitts 7 herausgestellt.

Hier stellen wir eine Technologie vor, die metallmarkierte Antikörper und sekundäre Ionenmassenspektrometrie koppelt und die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Marker-Coexpression (Phänotypisierung) und die räumliche Analyse unter Verwendung formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) und frisch gefrorener (FF) Gewebeproben ermöglicht 8,9. FFPE-Proben sind die am häufigsten verwendeten Materialien für die Gewebearchivierung von Proben und stellen eine leichter verfügbare Ressource für gemultiplexte Bildgebungstechnologien dar als frisch gefrorene Proben10. Darüber hinaus bietet diese Technologie die Möglichkeit, Bilder Monate später wieder aufzunehmen. Hier besprechen wir unsere Färbe- und Bildverarbeitungsprotokolle mit FFPE-Gewebeproben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gewebeproben wurden zu Forschungszwecken in Übereinstimmung mit dem Institutional Review Board des MD Anderson Cancer Center der University of Texas entnommen, und die Proben wurden weiter de-identifiziert.

1. Antikörperauswahl

  1. Definieren Sie die Forschungsfragen, um die besten verfügbaren Antikörperklone auszuwählen. Verwenden Sie den Human Protein Atlas, veröffentlichte Forschungsergebnisse und Websites von Antikörperherstellern als Forschungsressourcen.
    HINWEIS: Die Auswahl geeigneter menschlicher Gewebekontrollen und der gleichen menschlichen Gewebekontrollen, die in den verschiedenen Schritten gefärbt werden sollen, ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Marker korrekt, an der richtigen Stelle und im richtigen Zellkompartiment gefärbt sind. Ein kleiner Gewebe-Microarray (TMA) mit normalem Gewebe und neoplastischem Gewebe wird immer zur Färbevalidierung empfohlen.
  2. Verwenden Sie nur trägerfreie Antikörper, um das Panel zu entwerfen.
    HINWEIS: Die Verwendung von trägerfreien Antikörperformulierungen ist erforderlich, wenn kein kommerzieller trägerfreier Antikörper verfügbar ist; Reinigungskits können verwendet werden, um den Antikörper auf die richtige Formulierung einzustellen. Es ist bekannt, dass Proteinzusätze wie Rinderserumalbumin die Konjugationskapazität verringern.
  3. Testen und titrieren Sie jeden Antikörper unter Verwendung der chromogenen Standardimmunhistochemie, um das subzelluläre Muster der Expression eines Markers zu bestimmen. Membran-, Zytoplasma- oder Kernfärbung; und Expression in spezifischen Zellen in Kontrollgeweben.
    HINWEIS: Jeder Antikörper muss jedoch auf pH 6 Citrat und pH 9 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) getestet werden, und es muss bestimmt werden, ob das Panel mit pH 6 Citrat oder pH 9 EDTA angefärbt wird. Die Verwendung von pH 9 EDTA wird empfohlen, um gute Signale zu erhalten, insbesondere wenn mit dieser Methodik gearbeitet wird.
  4. Wählen Sie die optimale Färbekonzentration entsprechend dem Expressionsmuster in Positivkontrollen.
  5. Ordnen Sie jeden Antikörper einem der verfügbaren Metallisotope entsprechend der immunhistochemischen Markerhäufigkeit, der subzellulären Lokalisation und der zellulären Koexpression mit den anderen Zielen zu.
  6. Färben Sie den Antikörper mit dem entsprechenden zugeordneten Metall und vergleichen Sie ihn mit der Expression im gleichen zuvor verwendeten Kontrollgewebe.
    HINWEIS: Die Antikörper-Metall-Konjugation beginnt mit der Antikörpervorbereitung, -reduktion und der anschließenden Konjugation (Zusatzdatei 1). Jedes metallbeladene Polymerröhrchen reicht aus, um 100 μg eines Antikörpers zu markieren.

2. Antikörper-Panel-Design

  1. Erstellen Sie kleine Chargen von Antikörperfärbungen. Testen Sie bis zu fünf Marker in einem Cocktail.
    HINWEIS: Das Testen von Antikörpern, die bereits konjugiert und immunhistochemisch in Chargen analysiert wurden, erleichtert die frühzeitige Identifizierung von Kanalinterferenzen und bietet die Möglichkeit, die Antikörper mit einem anderen Metall zu rekonjugieren. Es bietet auch die Möglichkeit, eine angemessene Marker-Koexpression zu bewerten.
  2. Färben Sie jede kleine Charge mit vier verschiedenen Antikörperkonzentrationen (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml und 4,0 μg/ml).
    HINWEIS: Vergleichen Sie verschiedene Titer, identifizieren Sie die Antikörperkonzentration, die zur richtigen Position und höchsten Expression mit minimaler Hintergrundfärbung führt (bestes Signal-Rausch-Verhältnis).

3. FFPE-Gewebeschnitte

  1. Wählen Sie goldbeschichtete Objektträger (speziell für diesen Zweck) und halten Sie sie in der Nähe des Mikrotoms. Bereiten Sie das Mikrotom vor, indem Sie eine neue Klinge in den Halter einführen. Stellen Sie die Querschnittsdicke auf 4-5 μm ein.
  2. FFPE-Blöcke vor dem Schneiden auf Eis legen. Bereiten Sie ein Gewebeschwimmbad vor, indem Sie destilliertes Wasser oder entionisiertes Wasser (diH2O) auf 40-45 °C erhitzen.
    HINWEIS: Die Verwendung von diH2O oder destilliertem Wasser reduziert die Möglichkeit einer Kontamination.
  3. Beginnen Sie mit dem Schneiden. Legen Sie den Gewebeabschnitt mit einer Pinzette ins Wasser und lassen Sie ihn abflachen. Verwenden Sie die Objektträger, um Gewebeschnitte aus dem Wasser zu entfernen.
  4. Legen Sie die Dias in ein Schiebergestell und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

4. FFPE-Antikörperfärbung

HINWEIS: Der Färbeprozess findet an zwei verschiedenen Tagen statt.

ACHTUNG: Die in diesem Protokoll verwendeten Lösungen sind potenziell ätzend und stellen Gefahren für Haut und Augen dar. Das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel sowie Augen- und Gesichtsschutzausrüstung wird empfohlen und ist Teil der Biosicherheitspolitik unserer Institution.

  1. Reagenzzubereitung (Tag 1)
    1. 50 ml 20x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBS-T) in 950 mLdiH2Overdünnen, um 1 L TBS-T herzustellen.
    2. 8 ml 10x Tris-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) werden in 72 mLdiH2Overdünnt, um eine 1x hitzeinduzierte Epitop-Retrievallösung (HIER) herzustellen.
    3. Eselserum in 1x TBS-T auf eine Endkonzentration von 5% verdünnen, um einen Blockierpuffer herzustellen. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C, bis sie gebrauchsfertig ist.
  2. HIER Vorbereitung: Modul Vorbehandlung (PT)
    ACHTUNG: Tragen Sie Chemikalienschutzhandschuhe beim Umgang mit Reagenzien oder Teilen, die in Reagenzien eingetaucht sind, die im PT-Modul verwendet werden.
    1. Verdünnen Sie 140 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in 1.260 mldiH2O, um 1,4 l 1x PBS herzustellen. Alternativ können sieben PBS-Tabletten in 1,4 LdiH2Overdünnt werden.
    2. Füllen Sie einen Tank mit 1,4 L PBS und stellen Sie den vorbereiteten Schieberkammerbehälter mit 100 mL 1x HIER-Lösung in den Tank.
    3. Den Tank in einem PT-Modul auf 75 °C vorheizen.
  3. Überschüssige Paraffinentfernung
    1. Objektträger bei 70 °C im Backofen mindestens 20 min backen.
      HINWEIS: Einige Taschentücher oder Abschnitte benötigen möglicherweise längere Backzeiten. Die empfohlene Backzeit für Hirngewebe oder eine TMA beträgt 1 h. Diese kann auf 16 h (über Nacht) oder je nach Laborerfahrung verlängert werden.
    2. Legen Sie gebackene Objektträger in einen Diahalter und führen Sie die folgenden Waschschritte auf einem Shaker unter einem Abzug durch. Die Objektträger werden in folgender Lösung gewaschen: Xylol 2x für 30 s (metallfrei), 100% Alkohol 2x für 30 s (metallfrei), 95% Alkohol 2x für 30 s (metallfrei), 80% Alkohol für 30 s (metallfrei), 70% Alkohol für 30 s (metallfrei) und diH2O 2x für 30 s (metallfrei).
    3. Bewahren Sie die Objektträger in einem frischen diH2O-Behälter auf, bis sie für die Antigengewinnung bereit sind.
      HINWEIS: Die Objektträger sollten erst am Ende des Verfahrens getrocknet werden.
  4. Antigen-Retrieval
    1. Legen Sie die Dias in eine vorgeheizte Objektträgerkammer mit 1x HIER-Puffer im PT-Modul. Legen Sie die Abdeckung auf den Tank. Schließen und verriegeln Sie den Deckel.
    2. Drücken Sie die Taste Menu (Menü ) am PT-Modul, um das Hauptmenü zu öffnen, und drücken Sie die Taste Setup cycle (Zeit und Temperatur), um ein benutzerdefiniertes Programm zu erstellen.
    3. Lassen Sie das PT-Modul 40 Minuten lang bei 97 °C laufen. Danach kühlt das PT-Modul automatisch auf 65 °C ab.
    4. Entfernen Sie die Objektträger vom PT-Modul, sobald die Temperatur von 65 °C erreicht ist. Halten Sie die Dias 30 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Das PT-Modul öffnet sich erst, wenn die Temperatur auf 65 °C abgekühlt ist. Berühren Sie während dieses Vorgangs nicht die goldene Oberfläche der Objektträger und verwenden Sie immer Handschuhe.
  5. Antikörper-Blockierung
    1. Stellen Sie einen Shaker auf 70 U/min ein.
    2. Waschen Sie die Objektträger, indem Sie sie 5 min 2x in 1x TBS-T tauchen.
    3. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Rand um den Gewebeabschnitt, der mindestens 1 mm von den Objektträgerkanten entfernt ist, und lassen Sie ihn 15-30 s trocknen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Stiftflüssigkeit den Gewebeabschnitt nicht berührt, um Gewebestörungen durch die Färbung zu vermeiden. Drücken Sie den Stift nicht zu fest nach unten, während Sie die Barriere ziehen, um mögliche Leckagen zu vermeiden. Für optimale Färbe- und Bildaufnahmeergebnisse werden die Gewebeschnitte in der Mitte der goldbeschichteten Objektträger in einem Rahmen platziert, der nicht größer als 15 mm x 30 mm ist, um genügend Platz zum Zeichnen der Barriere zu schaffen, ohne das Gewebe oder die Führungspunkte am äußeren Rand des Objektträgers zu berühren.
    4. Um Stiftreste zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger in TBS-T.
    5. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur den Gewebeschnitt mit 100-200 μL Blockierpuffer für 20 min inkubieren. Lassen Sie das Gewebe im blockierenden Puffer inkubieren, bis ein Antikörper-Master-Mix fertig ist.
  6. Antikörper-Panel-Vorbereitung
    HINWEIS: Das endgültige Volumen des Antikörper-Panel-Cocktails variiert je nach geschätzter Oberfläche des Gewebeschnitts. Um eine Fläche von 20 mm x 20 mm abzudecken, bereiten Sie 100-200 μL des Cocktails vor.
    Gehen Sie wie folgt vor, um einen Antikörper-Panel-Cocktail aus metallisotopenkonjugierten Antikörpern herzustellen:
    1. Bestätigen Sie das endgültige Volumen des Cocktails, das dem Antikörper-Cocktailvolumen entspricht, das dem blockierenden Puffervolumen hinzugefügt wurde.
    2. Bestätigen Sie die Spezifikationen für alle Antikörper, Verdünnungen und/oder Antikörperkonzentrationen in einer Panel-Tabelle für das Projekt.
    3. Alle Antikörper-haltigen Röhrchen bei 10.000 x g für 5 min herunterdrehen. Einzelne Antikörper in den Blockierpuffer geben und sehr gut mischen. Stören Sie den Boden des Antikörperröhrchens nicht, wenn Sie es pipettieren.
    4. Filtern Sie das Antikörperpanel durch Vorbenetzung einer 0,1 μm Zentrifugalfiltervorrichtung mit 100 μL Blockierpuffer. Drehen Sie den Filter bei 10.000 x g für 2 min und entfernen Sie den blockierenden Pufferdurchfluss mit einer Pipette.
    5. Übertragen Sie das Antikörperpanel in eine Spinsäule und drehen Sie den Filter bei 10.000 x g für 2 min. Verwerfen Sie die Spin-Säule und verwenden Sie den Durchfluss als gefilterte Antikörperplatte.
      HINWEIS: Führen Sie die Färbung sofort nach der Herstellung des Cocktails durch, um einen Metallaustausch zu verhindern. Wenn eine längere Lagerung des Antikörpercocktails erforderlich ist, kann er einer Lyophilisation unterzogen werden.
  7. Antikörperfärbung
    1. Entfernen Sie vorsichtig den Blockierpuffer von den Objektträgern, indem Sie jedes Dia auf die Seite kippen und die Kanten vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen.
    2. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und geben Sie 100-200 μL Antikörper-Master-Mischung in das Gewebe (vermeiden Sie den Kontakt mit dem Gewebe und die Bildung von Luftblasen).
    3. Fügen Sie der Färbecharge positive und negative Kontrollobjektträger hinzu.
    4. Die Objektträger über Nacht bei 4 °C (14-16 h) inkubieren.
  8. Reagenzzubereitung (Tag 2)
    1. Verdünnen Sie 100 ml 10x PBS mit niedrigem Bariumgehalt, pH 7,4, in 900 mldiH2O, um 1x PBS herzustellen.
    2. Bereiten Sie 350 ml einer Arbeitslösung von 2% Glutaraldehyd in PBS mit niedrigem Bariumgehalt (340 ml PBS mit niedrigem Bariumgehalt + 10 ml 70% Glutaraldehyd) vor.
      HINWEIS: Führen Sie die Verdünnung unter einer Haube durch. Glutaraldehyd ist eine sehr viskose Flüssigkeit. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette und fügen Sie jedes Mal 1 ml PBS mit niedrigem Bariumgehalt in das Glutaraldehydrohr ein, bis es flüssig genug ist, um aus dem Röhrchen zu gießen.
    3. 10x Tris, pH 8,5, in 900 ml diH20 zu 1x Tris verdünnen.
  9. Fixierung und Dehydratation
    1. Entfernen Sie die Antikörper-Mastermischung von jedem Objektträger, indem Sie den Objektträger auf die Seite kippen und vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen.
    2. Die Objektträger mit leichtem bis mäßigem Rühren in folgenden Puffern waschen: 1x TBS-T, 3x mal für je 5 min (metallfrei); filtriert 2% Glutaraldehyd für 5 min; gefiltert 1x Tris, pH 8,5, 3x für 30 s; filtriertdiH2O2x für 30 s; 70% Alkohol für 30 s (metallfrei); 80% Alkohol für 30 s (metallfrei); 95% Alkohol für 30 s (metallfrei); und 100% Alkohol für 30 s (metallfrei).
    3. Klopfen Sie vorsichtig gegen den Rand jedes Objektträgers gegen einen Aufgabenwischer, um überschüssigen Alkohol zu entfernen und den Restalkohol bei Raumtemperatur (~ 5-10 min) verdampfen zu lassen.
    4. Trocknen Sie die Objektträger vor der Bildaufnahme mindestens 1 Stunde in einem Exsikkator oder bewahren Sie die Objektträger zur Langzeitlagerung in einer Vakuumkammer auf.

5. Bildaufnahme

  1. Folienaufbau
    HINWEIS: Vor dem Scannen mit dem Gerät müssen die Dias mithilfe der webbasierten Bildverwaltungsanwendung definiert und eingerichtet werden, indem die unten beschriebenen Schritte ausgeführt werden.
    1. Klicken Sie auf der Folienseite in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung auf Beitritt Neue Folie , und geben Sie die gewünschten Details ein (Name, Folienidentifikation, Position und Beschreibung).
    2. Erstellen Sie Scanabschnitte, indem Sie auf Abschnitt hinzufügen klicken. Geben Sie die Informationen für jeden Abschnitt ein (Name des Projekts, Folienname, Block und Position). Um die neu erstellten Folien/Abschnitte zu speichern, klicken Sie auf Senden.
    3. Öffnen Sie auf der Registerkarte Ressourcen die Panel-Seite und wählen Sie das zu verwendende Panel aus. Klicken Sie für neue Bedienfelder auf Neues Bedienfeld erstellen.
    4. Nachdem Sie das Panel ausgewählt haben, klicken Sie auf Abschnitte. Fügen Sie die in Schritt 2 erstellten Abschnitte hinzu. durch Klicken auf Abschnittszuordnung bearbeiten. Speichern Sie, indem Sie auf Senden klicken.
  2. Instrumenten-Setup
    HINWEIS: Dieses Gerät (siehe Materialtabelle) wird mit einer speziellen Steuerungssoftware bedient (siehe Materialtabelle).
    1. Melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an. Klicken Sie auf Aufwachen , wenn sich das Gerät im Ruhemodus befindet.
      HINWEIS: Mindestens 1 Stunde vor der Operation wird empfohlen, das Instrument aufzuwärmen, was bei der Stabilisierung des Strahlfokus hilft.
    2. Um eine Folie zu laden, klicken Sie auf Exchange-Beispiel und dann auf Weiter , um die Tür zu öffnen. Legen Sie den Objektträger mit der Probe nach oben und dem Etikett rechts in den Ladeschlitz. Klicken Sie auf Weiter , um die Tür zu schließen.
      HINWEIS: Wenn die Folie nicht richtig geladen ist, werden ein Warnton und eine Benachrichtigung zum Anpassen der Folie angezeigt.
    3. Wählen Sie das Projekt und dann den Foliennamen für das geladene Beispiel aus.
    4. Visualisieren Sie das Panoramabild im optischen Diabildbereich.
  3. Sichtfeld (FOV) Auswahl und Erfassung
    1. Klicken Sie auf das Menü Mode und wählen Sie SED (Secondary Electron Detector). Klicken Sie auf das Imaging-Modus-Menü und wählen Sie QC −300 μm.
    2. Klicken Sie auf Jog Stage , um die FOV-Position zu steuern, und klicken Sie dann auf die Pfeile, um zu navigieren und die Position des FOV auszuwählen.
    3. Klicken Sie auf FOV hinzufügen, legen Sie 400 μm x 400 μm als Feldgröße fest, und wählen Sie Fein als Bildgebungsmodus und 1 ms Verweilzeit aus. Klicken Sie auf Bestätigen.
      HINWEIS: Die eingestellte Verweilzeit hängt von der gewünschten Auflösung ab. Die Verweilzeit nimmt mit zunehmender Auflösung zu. Die Erfassungszeit kann in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren, einschließlich der Einlaufzeit des Detektors und der Betriebsdauer. Unsere mittlere Erfassungszeit für ein Sichtfeld beträgt ca. 17 min. Verwenden Sie das Gerät nonstop für bis zu 8 Stunden, was das Scannen von ca. 28 FOVs ermöglicht. Die Qualität der aufgenommenen Bilder nimmt nach vielen aufeinanderfolgenden Nutzungsstunden ab.
    4. Nachdem Sie eine FOV-Liste erstellt haben, fahren Sie mit dem Bildfokus fort und passen Sie die Stigmatisierung an, indem Sie den Strahl in eine Geweberegion bewegen, die nicht abgebildet wird. Passen Sie die Parameter an, bis ein klares zentrales Bild erhalten wird.
      HINWEIS: Um die Bildaufnahme zu optimieren, ist es ideal, den Gewebeschnitt zentral auf dem Objektträger zu halten. Während der Fokussierung kann ein klares Bild nur des zentralen Bereichs erhalten werden. Wenn der Gewebeschnitt zu groß ist, sind die Ränder unscharf und das Bild wird verschwommen.
    5. Klicken Sie auf Start Run. Die aufgenommenen Bilder werden automatisch hochgeladen und in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung gespeichert.

6. Bildvorbereitung

  1. Bildisobare Korrektur
    HINWEIS: Der Zweck der isobaren Korrektur besteht darin, das Spillover-Signal zwischen Kanälen zu entfernen, das sich aus dem Vorhandensein von Isotopen gleicher oder sehr ähnlicher Masse ergibt, deren Massenunterschiede mit dem Massenanalysator nicht erkannt werden können.
    1. Klicken Sie in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung auf das grüne Download-Symbol , um die FOVs (TIFF-Bilder) zu speichern.
    2. Laden Sie die aktuellste Version der Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis) herunter, die auf der Registerkarte Info in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung verfügbar ist, und speichern Sie sie in einer Datei. Öffnen Sie die .zip Archivdatei und folgen Sie den Installationsschritten. Öffnen Sie die Software, sobald die Installation abgeschlossen ist.
    3. Wählen Sie den Ordner mit den zu korrigierenden Bildern aus, indem Sie im Eingabebereich der Bildbearbeitungssoftware auf das Dateisymbol klicken. Eine FOV-Liste wird geladen.
    4. Klicken Sie im Eingabebereich auf das Symbol Filter , um Standardkorrekturen anzuwenden. Visualisieren Sie für jeden Kanal Bilder, die vor und nach der Korrektur auf der rechten Seite des Bildschirms aufgenommen wurden.
    5. Klicken Sie im Ausgabebereich auf das Diskettensymbol , um das korrigierte Image zu speichern.
  2. Bildfilterung: Voronoi Tesselation
    HINWEIS: Voronoi-Tesselierungsdiagramme zeigen eine Aufteilung des Raums mit Seed-Punkten in Voronoi-Zellen. Ziel ist es, die Zelldichte abzuschätzen und Zellgrenzen zu definieren. Mit der Voronoi-Tesselationsberechnung wird eine Maske generiert und zum Filtern auf das Originalbild angewendet.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Filterung und wählen Sie Voronoi Tesselation im Menü Filterparameter.
    2. Wählen Sie im Eingabebereich das Bild MassCorrected.tiff aus. Klicken Sie im Eingabebereich auf das Symbol Filter .
    3. Klicken Sie auf das Diskettensymbol im Ausgabebereich, um das gefilterte Image zu speichern. Die beiden resultierenden Dateien haben die Suffixe -Filtered.tiff und -Filtered.json.
      HINWEIS: Das Bild mit dem Namen MassCorrected-Filtered.tiff kann dann in ein digitales Analyseprogramm eines Drittanbieters oder ein Open-Source-Softwareprogramm hochgeladen werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mandel- und Lungenadenokarzinom-TMA-Gewebeschnitte (5 mm dick) wurden entnommen und auf die Mitte von goldbeschichteten Objektträgern gelegt, wobei die Spezifikationen bezüglich Gewebegröße und sicherer Ränder der Objektträger eingehalten wurden. Für eine optimale Färbung sind freie Glasränder von 5 mm bzw. 10 mm zwischen dem Geweberand und den seitlichen bzw. unteren Rändern der Objektträger notwendig. Die Gewebeabschnitte wurden vor der Färbung über Nacht in einem Ofen gebacken, um die ordnungsgemäße Haftung des Abschn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die umfassende Aufklärung der komplexen, komplizierten Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten eines TME bleibt ein zentrales Ziel der Krebsforschung. Die Hersteller haben im Rahmen dieser Bemühungen zahlreiche Multiplex-Assays eingeführt, insbesondere in den letzten 5 Jahren. Die multiplexierte räumliche Analyse ist ein vielseitiges und leistungsfähiges Werkzeug, das die gleichzeitige Kategorisierung mehrerer Ziele erleichtert und gleichzeitig die strukturelle Morphologie in Tumorproben bewahrt. Räumlich...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Don Norwood von Editing Services, Research Medical Library bei MD Anderson für die Bearbeitung dieses Artikels und dem Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory am Department of Translational Molecular Pathology bei MD Anderson. Diese Veröffentlichung resultierte zum Teil aus der Forschung, die durch die wissenschaftliche und finanzielle Unterstützung für das Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) ermöglicht wurde, das durch das National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) dem University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC) zur Verfügung gestellt wurde.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% ReagenzalkoholSigma-AldrichR8382
95% ReagenzalkoholSigma-AldrichR3404
80% ReagenzalkoholSigma-AldrichR3279
70% ReagenzalkoholSigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X Low-Barium PBS pH 7,4Ionpath
10X Tris pH 8,5 Ionpath567003
4°; C KühlschrankThermoScientificREVCO
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P10Olympus24-401
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P20Olympus24-404
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P200Olympus24-412
Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere P1000Olympus24-430
Zentrifugalfilter Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Deionisiertes H2O-Ionenpfad567002
EselserumSigma-AldrichD9663
EasyDip Objektträger-Färbeglas,Grünelektronenmikroskopie Sciences71385-G
EasyDip Objektträger-Färbegefäß, GelbeElektronenmikroskopie Sciences71385-Y
EasyDip Objektträger-Färbeset (Glas+Rack), WeißElektronenmikroskopie Sciences71388-01
EasyDip EdelstahlhalterElektronenmikroskopie Sciences71388-50
Glutaraldehyd 70% EM-QualitätElektronenmikroskopie Sciences16360
Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) Puffer: 10X Tris mit EDTA, pH 9DakoS2367
Hitzebeständiger Objektträger KammerElektronenmikroskopieSciences 62705-01
Hydrophober BarrierestiftFisher50-550-221
MIBI/O SoftwareIonpathNA
MIBIcontrol SoftwareIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MikrozentrifugeEppendorf5415D
MikrotomLeicaRM2135
Feuchtigkeitskammer (Feuchtkammer)SimportM922-1
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) TablettenFisher ScientificBP2944100
PT ModulThermo ScientificA80400012
sterile Einweg-Filtereinheiten mit schnellem DurchflussFisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
Spin Säule (Ultrafree-MC Spin Filter, 0,5 mL 0,1 μm; m )MillQUFC30VV00
SchiebeofenFisher Scientific6901
Vakuumschrank ExsikkatorVWR30621-076
Task-WhipeKimberly Clark34155
XylolSigma-Aldrich534056-4L
567004-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

Related Articles