Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Die Bedeutung der zahlreichen Zelltypen, die klonale Tumorpopulationen umgeben, ist ein entscheidendes Element bei der Kategorisierung der Karzinogenese. Das Interesse an der Aufklärung dieser Zusammensetzung und Wechselwirkungen der Tumormikroumgebung (TME) ist nach der Etablierung der immunbasierten Therapie als Teil des Krebsbehandlungsarsenals kontinuierlich gestiegen. Daher haben sich die Behandlungsstrategien von einem tumorzentrierten Ansatz zu einem TME-zentrierten Ansatz verlagert¹.

Die Bemühungen, die Rolle von Immunzellen bei der Tumorüberwachung und Krebsentstehung aufzuklären, haben in den letzten Jahren auffallend zugenommen ^2,3. In der medizinischen Forschung entstand eine Vielzahl von Methoden, darunter zytometrische Methoden und Singleplex- und Multiplex-Bildgebungstechnologien, als Teil dieses Versuchs, die einzigartigen Wechselwirkungen mehrerer Elemente von TMEs zu entschlüsseln.

Bahnbrechende Methoden wie die Durchflusszytometrie (erfunden in den 1960er Jahren), die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und die Massenzytometrie konzentrieren sich hauptsächlich auf die Identifizierung und Quantifizierung von TME-Komponenten⁴. Obwohl zytometrische quantitative Techniken eine Phänotypisierung der Immunlandschaft ermöglichen, ist die Bestimmung der zellulären räumlichen Verteilung unmöglich. Umgekehrt erhalten Methoden wie die Standard-Singleplex-Immunhistochemie die Gewebearchitektur und ermöglichen es den Forschern, die zelluläre Verteilung zu analysieren, obwohl eine reduzierte Anzahl von Zielen in einem einzelnen Gewebeabschnitt eine Einschränkung dieser Methoden darstellt ^5,6. In den letzten Jahren haben sich Multiplex-Bildgebungstechnologien für die Einzelzellauflösung wie Multiplex-Immunfluoreszenz, Barcoding-Fluoreszenzbildgebung und bildgebende Massenspektrometrie als umfassende Strategien zur Gewinnung von Informationen über die gleichzeitige Markerfärbung unter Verwendung desselben^{Gewebeabschnitts 7} herausgestellt.

Hier stellen wir eine Technologie vor, die metallmarkierte Antikörper und sekundäre Ionenmassenspektrometrie koppelt und die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Marker-Coexpression (Phänotypisierung) und die räumliche Analyse unter Verwendung formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) und frisch gefrorener (FF) Gewebeproben ermöglicht ^8,9. FFPE-Proben sind die am häufigsten verwendeten Materialien für die Gewebearchivierung von Proben und stellen eine leichter verfügbare Ressource für gemultiplexte Bildgebungstechnologien dar als frisch gefrorene Proben¹⁰. Darüber hinaus bietet diese Technologie die Möglichkeit, Bilder Monate später wieder aufzunehmen. Hier besprechen wir unsere Färbe- und Bildverarbeitungsprotokolle mit FFPE-Gewebeproben.

Gewebeproben wurden zu Forschungszwecken in Übereinstimmung mit dem Institutional Review Board des MD Anderson Cancer Center der University of Texas entnommen, und die Proben wurden weiter de-identifiziert.

1. Antikörperauswahl

1. Definieren Sie die Forschungsfragen, um die besten verfügbaren Antikörperklone auszuwählen. Verwenden Sie den Human Protein Atlas, veröffentlichte Forschungsergebnisse und Websites von Antikörperherstellern als Forschungsressourcen.
   HINWEIS: Die Auswahl geeigneter menschlicher Gewebekontrollen und der gleichen menschlichen Gewebekontrollen, die in den verschiedenen Schritten gefärbt werden sollen, ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Marker korrekt, an der richtigen Stelle und im richtigen Zellkompartiment gefärbt sind. Ein kleiner Gewebe-Microarray (TMA) mit normalem Gewebe und neoplastischem Gewebe wird immer zur Färbevalidierung empfohlen.
2. Verwenden Sie nur trägerfreie Antikörper, um das Panel zu entwerfen.
   HINWEIS: Die Verwendung von trägerfreien Antikörperformulierungen ist erforderlich, wenn kein kommerzieller trägerfreier Antikörper verfügbar ist; Reinigungskits können verwendet werden, um den Antikörper auf die richtige Formulierung einzustellen. Es ist bekannt, dass Proteinzusätze wie Rinderserumalbumin die Konjugationskapazität verringern.
3. Testen und titrieren Sie jeden Antikörper unter Verwendung der chromogenen Standardimmunhistochemie, um das subzelluläre Muster der Expression eines Markers zu bestimmen. Membran-, Zytoplasma- oder Kernfärbung; und Expression in spezifischen Zellen in Kontrollgeweben.
   HINWEIS: Jeder Antikörper muss jedoch auf pH 6 Citrat und pH 9 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) getestet werden, und es muss bestimmt werden, ob das Panel mit pH 6 Citrat oder pH 9 EDTA angefärbt wird. Die Verwendung von pH 9 EDTA wird empfohlen, um gute Signale zu erhalten, insbesondere wenn mit dieser Methodik gearbeitet wird.
4. Wählen Sie die optimale Färbekonzentration entsprechend dem Expressionsmuster in Positivkontrollen.
5. Ordnen Sie jeden Antikörper einem der verfügbaren Metallisotope entsprechend der immunhistochemischen Markerhäufigkeit, der subzellulären Lokalisation und der zellulären Koexpression mit den anderen Zielen zu.
6. Färben Sie den Antikörper mit dem entsprechenden zugeordneten Metall und vergleichen Sie ihn mit der Expression im gleichen zuvor verwendeten Kontrollgewebe.
   HINWEIS: Die Antikörper-Metall-Konjugation beginnt mit der Antikörpervorbereitung, -reduktion und der anschließenden Konjugation (Zusatzdatei 1). Jedes metallbeladene Polymerröhrchen reicht aus, um 100 μg eines Antikörpers zu markieren.

2. Antikörper-Panel-Design

1. Erstellen Sie kleine Chargen von Antikörperfärbungen. Testen Sie bis zu fünf Marker in einem Cocktail.
   HINWEIS: Das Testen von Antikörpern, die bereits konjugiert und immunhistochemisch in Chargen analysiert wurden, erleichtert die frühzeitige Identifizierung von Kanalinterferenzen und bietet die Möglichkeit, die Antikörper mit einem anderen Metall zu rekonjugieren. Es bietet auch die Möglichkeit, eine angemessene Marker-Koexpression zu bewerten.
2. Färben Sie jede kleine Charge mit vier verschiedenen Antikörperkonzentrationen (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml und 4,0 μg/ml).
   HINWEIS: Vergleichen Sie verschiedene Titer, identifizieren Sie die Antikörperkonzentration, die zur richtigen Position und höchsten Expression mit minimaler Hintergrundfärbung führt (bestes Signal-Rausch-Verhältnis).

3. FFPE-Gewebeschnitte

1. Wählen Sie goldbeschichtete Objektträger (speziell für diesen Zweck) und halten Sie sie in der Nähe des Mikrotoms. Bereiten Sie das Mikrotom vor, indem Sie eine neue Klinge in den Halter einführen. Stellen Sie die Querschnittsdicke auf 4-5 μm ein.
2. FFPE-Blöcke vor dem Schneiden auf Eis legen. Bereiten Sie ein Gewebeschwimmbad vor, indem Sie destilliertes Wasser oder entionisiertes Wasser (diH₂O) auf 40-45 °C erhitzen.
   HINWEIS: Die Verwendung von diH₂O oder destilliertem Wasser reduziert die Möglichkeit einer Kontamination.
3. Beginnen Sie mit dem Schneiden. Legen Sie den Gewebeabschnitt mit einer Pinzette ins Wasser und lassen Sie ihn abflachen. Verwenden Sie die Objektträger, um Gewebeschnitte aus dem Wasser zu entfernen.
4. Legen Sie die Dias in ein Schiebergestell und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

4. FFPE-Antikörperfärbung

HINWEIS: Der Färbeprozess findet an zwei verschiedenen Tagen statt.

ACHTUNG: Die in diesem Protokoll verwendeten Lösungen sind potenziell ätzend und stellen Gefahren für Haut und Augen dar. Das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel sowie Augen- und Gesichtsschutzausrüstung wird empfohlen und ist Teil der Biosicherheitspolitik unserer Institution.

1. Reagenzzubereitung (Tag 1)
   1. 50 ml 20x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBS-T) in 950 mL_diH2Overdünnen, um 1 L TBS-T herzustellen.
   2. 8 ml 10x Tris-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) werden in 72 mL_diH2Overdünnt, um eine 1x hitzeinduzierte Epitop-Retrievallösung (HIER) herzustellen.
   3. Eselserum in 1x TBS-T auf eine Endkonzentration von 5% verdünnen, um einen Blockierpuffer herzustellen. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C, bis sie gebrauchsfertig ist.
2. HIER Vorbereitung: Modul Vorbehandlung (PT)
   ACHTUNG: Tragen Sie Chemikalienschutzhandschuhe beim Umgang mit Reagenzien oder Teilen, die in Reagenzien eingetaucht sind, die im PT-Modul verwendet werden.
   1. Verdünnen Sie 140 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in 1.260 ml_diH2O, um 1,4 l 1x PBS herzustellen. Alternativ können sieben PBS-Tabletten in 1,4 L_diH2Overdünnt werden.
   2. Füllen Sie einen Tank mit 1,4 L PBS und stellen Sie den vorbereiteten Schieberkammerbehälter mit 100 mL 1x HIER-Lösung in den Tank.
   3. Den Tank in einem PT-Modul auf 75 °C vorheizen.
3. Überschüssige Paraffinentfernung
   1. Objektträger bei 70 °C im Backofen mindestens 20 min backen.
      HINWEIS: Einige Taschentücher oder Abschnitte benötigen möglicherweise längere Backzeiten. Die empfohlene Backzeit für Hirngewebe oder eine TMA beträgt 1 h. Diese kann auf 16 h (über Nacht) oder je nach Laborerfahrung verlängert werden.
   2. Legen Sie gebackene Objektträger in einen Diahalter und führen Sie die folgenden Waschschritte auf einem Shaker unter einem Abzug durch. Die Objektträger werden in folgender Lösung gewaschen: Xylol 2x für 30 s (metallfrei), 100% Alkohol 2x für 30 s (metallfrei), 95% Alkohol 2x für 30 s (metallfrei), 80% Alkohol für 30 s (metallfrei), 70% Alkohol für 30 s (metallfrei) und diH₂O 2x für 30 s (metallfrei).
   3. Bewahren Sie die Objektträger in einem frischen diH₂O-Behälter auf, bis sie für die Antigengewinnung bereit sind.
      HINWEIS: Die Objektträger sollten erst am Ende des Verfahrens getrocknet werden.
4. Antigen-Retrieval
   1. Legen Sie die Dias in eine vorgeheizte Objektträgerkammer mit 1x HIER-Puffer im PT-Modul. Legen Sie die Abdeckung auf den Tank. Schließen und verriegeln Sie den Deckel.
   2. Drücken Sie die Taste Menu (Menü ) am PT-Modul, um das Hauptmenü zu öffnen, und drücken Sie die Taste Setup cycle (Zeit und Temperatur), um ein benutzerdefiniertes Programm zu erstellen.
   3. Lassen Sie das PT-Modul 40 Minuten lang bei 97 °C laufen. Danach kühlt das PT-Modul automatisch auf 65 °C ab.
   4. Entfernen Sie die Objektträger vom PT-Modul, sobald die Temperatur von 65 °C erreicht ist. Halten Sie die Dias 30 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Das PT-Modul öffnet sich erst, wenn die Temperatur auf 65 °C abgekühlt ist. Berühren Sie während dieses Vorgangs nicht die goldene Oberfläche der Objektträger und verwenden Sie immer Handschuhe.
5. Antikörper-Blockierung
   1. Stellen Sie einen Shaker auf 70 U/min ein.
   2. Waschen Sie die Objektträger, indem Sie sie 5 min 2x in 1x TBS-T tauchen.
   3. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Rand um den Gewebeabschnitt, der mindestens 1 mm von den Objektträgerkanten entfernt ist, und lassen Sie ihn 15-30 s trocknen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Stiftflüssigkeit den Gewebeabschnitt nicht berührt, um Gewebestörungen durch die Färbung zu vermeiden. Drücken Sie den Stift nicht zu fest nach unten, während Sie die Barriere ziehen, um mögliche Leckagen zu vermeiden. Für optimale Färbe- und Bildaufnahmeergebnisse werden die Gewebeschnitte in der Mitte der goldbeschichteten Objektträger in einem Rahmen platziert, der nicht größer als 15 mm x 30 mm ist, um genügend Platz zum Zeichnen der Barriere zu schaffen, ohne das Gewebe oder die Führungspunkte am äußeren Rand des Objektträgers zu berühren.
   4. Um Stiftreste zu entfernen, tauchen Sie die Objektträger in TBS-T.
   5. In einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur den Gewebeschnitt mit 100-200 μL Blockierpuffer für 20 min inkubieren. Lassen Sie das Gewebe im blockierenden Puffer inkubieren, bis ein Antikörper-Master-Mix fertig ist.
6. Antikörper-Panel-Vorbereitung
   HINWEIS: Das endgültige Volumen des Antikörper-Panel-Cocktails variiert je nach geschätzter Oberfläche des Gewebeschnitts. Um eine Fläche von 20 mm x 20 mm abzudecken, bereiten Sie 100-200 μL des Cocktails vor.
   Gehen Sie wie folgt vor, um einen Antikörper-Panel-Cocktail aus metallisotopenkonjugierten Antikörpern herzustellen:
   1. Bestätigen Sie das endgültige Volumen des Cocktails, das dem Antikörper-Cocktailvolumen entspricht, das dem blockierenden Puffervolumen hinzugefügt wurde.
   2. Bestätigen Sie die Spezifikationen für alle Antikörper, Verdünnungen und/oder Antikörperkonzentrationen in einer Panel-Tabelle für das Projekt.
   3. Alle Antikörper-haltigen Röhrchen bei 10.000 x g für 5 min herunterdrehen. Einzelne Antikörper in den Blockierpuffer geben und sehr gut mischen. Stören Sie den Boden des Antikörperröhrchens nicht, wenn Sie es pipettieren.
   4. Filtern Sie das Antikörperpanel durch Vorbenetzung einer 0,1 μm Zentrifugalfiltervorrichtung mit 100 μL Blockierpuffer. Drehen Sie den Filter bei 10.000 x g für 2 min und entfernen Sie den blockierenden Pufferdurchfluss mit einer Pipette.
   5. Übertragen Sie das Antikörperpanel in eine Spinsäule und drehen Sie den Filter bei 10.000 x g für 2 min. Verwerfen Sie die Spin-Säule und verwenden Sie den Durchfluss als gefilterte Antikörperplatte.
      HINWEIS: Führen Sie die Färbung sofort nach der Herstellung des Cocktails durch, um einen Metallaustausch zu verhindern. Wenn eine längere Lagerung des Antikörpercocktails erforderlich ist, kann er einer Lyophilisation unterzogen werden.
7. Antikörperfärbung
   1. Entfernen Sie vorsichtig den Blockierpuffer von den Objektträgern, indem Sie jedes Dia auf die Seite kippen und die Kanten vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen.
   2. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und geben Sie 100-200 μL Antikörper-Master-Mischung in das Gewebe (vermeiden Sie den Kontakt mit dem Gewebe und die Bildung von Luftblasen).
   3. Fügen Sie der Färbecharge positive und negative Kontrollobjektträger hinzu.
   4. Die Objektträger über Nacht bei 4 °C (14-16 h) inkubieren.
8. Reagenzzubereitung (Tag 2)
   1. Verdünnen Sie 100 ml 10x PBS mit niedrigem Bariumgehalt, pH 7,4, in 900 ml_diH2O, um 1x PBS herzustellen.
   2. Bereiten Sie 350 ml einer Arbeitslösung von 2% Glutaraldehyd in PBS mit niedrigem Bariumgehalt (340 ml PBS mit niedrigem Bariumgehalt + 10 ml 70% Glutaraldehyd) vor.
      HINWEIS: Führen Sie die Verdünnung unter einer Haube durch. Glutaraldehyd ist eine sehr viskose Flüssigkeit. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette und fügen Sie jedes Mal 1 ml PBS mit niedrigem Bariumgehalt in das Glutaraldehydrohr ein, bis es flüssig genug ist, um aus dem Röhrchen zu gießen.
   3. 10x Tris, pH 8,5, in 900 ml diH₂0 zu 1x Tris verdünnen.
9. Fixierung und Dehydratation
   1. Entfernen Sie die Antikörper-Mastermischung von jedem Objektträger, indem Sie den Objektträger auf die Seite kippen und vorsichtig gegen einen Aufgabenwischer klopfen.
   2. Die Objektträger mit leichtem bis mäßigem Rühren in folgenden Puffern waschen: 1x TBS-T, 3x mal für je 5 min (metallfrei); filtriert 2% Glutaraldehyd für 5 min; gefiltert 1x Tris, pH 8,5, 3x für 30 s; filtriert_diH2O2x für 30 s; 70% Alkohol für 30 s (metallfrei); 80% Alkohol für 30 s (metallfrei); 95% Alkohol für 30 s (metallfrei); und 100% Alkohol für 30 s (metallfrei).
   3. Klopfen Sie vorsichtig gegen den Rand jedes Objektträgers gegen einen Aufgabenwischer, um überschüssigen Alkohol zu entfernen und den Restalkohol bei Raumtemperatur (~ 5-10 min) verdampfen zu lassen.
   4. Trocknen Sie die Objektträger vor der Bildaufnahme mindestens 1 Stunde in einem Exsikkator oder bewahren Sie die Objektträger zur Langzeitlagerung in einer Vakuumkammer auf.

5. Bildaufnahme

1. Folienaufbau
   HINWEIS: Vor dem Scannen mit dem Gerät müssen die Dias mithilfe der webbasierten Bildverwaltungsanwendung definiert und eingerichtet werden, indem die unten beschriebenen Schritte ausgeführt werden.
   1. Klicken Sie auf der Folienseite in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung auf Beitritt Neue Folie , und geben Sie die gewünschten Details ein (Name, Folienidentifikation, Position und Beschreibung).
   2. Erstellen Sie Scanabschnitte, indem Sie auf Abschnitt hinzufügen klicken. Geben Sie die Informationen für jeden Abschnitt ein (Name des Projekts, Folienname, Block und Position). Um die neu erstellten Folien/Abschnitte zu speichern, klicken Sie auf Senden.
   3. Öffnen Sie auf der Registerkarte Ressourcen die Panel-Seite und wählen Sie das zu verwendende Panel aus. Klicken Sie für neue Bedienfelder auf Neues Bedienfeld erstellen.
   4. Nachdem Sie das Panel ausgewählt haben, klicken Sie auf Abschnitte. Fügen Sie die in Schritt 2 erstellten Abschnitte hinzu. durch Klicken auf Abschnittszuordnung bearbeiten. Speichern Sie, indem Sie auf Senden klicken.
2. Instrumenten-Setup
   HINWEIS: Dieses Gerät (siehe Materialtabelle) wird mit einer speziellen Steuerungssoftware bedient (siehe Materialtabelle).
   1. Melden Sie sich bei der Steuerungssoftware an. Klicken Sie auf Aufwachen , wenn sich das Gerät im Ruhemodus befindet.
      HINWEIS: Mindestens 1 Stunde vor der Operation wird empfohlen, das Instrument aufzuwärmen, was bei der Stabilisierung des Strahlfokus hilft.
   2. Um eine Folie zu laden, klicken Sie auf Exchange-Beispiel und dann auf Weiter , um die Tür zu öffnen. Legen Sie den Objektträger mit der Probe nach oben und dem Etikett rechts in den Ladeschlitz. Klicken Sie auf Weiter , um die Tür zu schließen.
      HINWEIS: Wenn die Folie nicht richtig geladen ist, werden ein Warnton und eine Benachrichtigung zum Anpassen der Folie angezeigt.
   3. Wählen Sie das Projekt und dann den Foliennamen für das geladene Beispiel aus.
   4. Visualisieren Sie das Panoramabild im optischen Diabildbereich.
3. Sichtfeld (FOV) Auswahl und Erfassung
   1. Klicken Sie auf das Menü Mode und wählen Sie SED (Secondary Electron Detector). Klicken Sie auf das Imaging-Modus-Menü und wählen Sie QC −300 μm.
   2. Klicken Sie auf Jog Stage , um die FOV-Position zu steuern, und klicken Sie dann auf die Pfeile, um zu navigieren und die Position des FOV auszuwählen.
   3. Klicken Sie auf FOV hinzufügen, legen Sie 400 μm x 400 μm als Feldgröße fest, und wählen Sie Fein als Bildgebungsmodus und 1 ms Verweilzeit aus. Klicken Sie auf Bestätigen.
      HINWEIS: Die eingestellte Verweilzeit hängt von der gewünschten Auflösung ab. Die Verweilzeit nimmt mit zunehmender Auflösung zu. Die Erfassungszeit kann in Abhängigkeit von mehreren Faktoren variieren, einschließlich der Einlaufzeit des Detektors und der Betriebsdauer. Unsere mittlere Erfassungszeit für ein Sichtfeld beträgt ca. 17 min. Verwenden Sie das Gerät nonstop für bis zu 8 Stunden, was das Scannen von ca. 28 FOVs ermöglicht. Die Qualität der aufgenommenen Bilder nimmt nach vielen aufeinanderfolgenden Nutzungsstunden ab.
   4. Nachdem Sie eine FOV-Liste erstellt haben, fahren Sie mit dem Bildfokus fort und passen Sie die Stigmatisierung an, indem Sie den Strahl in eine Geweberegion bewegen, die nicht abgebildet wird. Passen Sie die Parameter an, bis ein klares zentrales Bild erhalten wird.
      HINWEIS: Um die Bildaufnahme zu optimieren, ist es ideal, den Gewebeschnitt zentral auf dem Objektträger zu halten. Während der Fokussierung kann ein klares Bild nur des zentralen Bereichs erhalten werden. Wenn der Gewebeschnitt zu groß ist, sind die Ränder unscharf und das Bild wird verschwommen.
   5. Klicken Sie auf Start Run. Die aufgenommenen Bilder werden automatisch hochgeladen und in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung gespeichert.

6. Bildvorbereitung

1. Bildisobare Korrektur
   HINWEIS: Der Zweck der isobaren Korrektur besteht darin, das Spillover-Signal zwischen Kanälen zu entfernen, das sich aus dem Vorhandensein von Isotopen gleicher oder sehr ähnlicher Masse ergibt, deren Massenunterschiede mit dem Massenanalysator nicht erkannt werden können.
   1. Klicken Sie in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung auf das grüne Download-Symbol , um die FOVs (TIFF-Bilder) zu speichern.
   2. Laden Sie die aktuellste Version der Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis) herunter, die auf der Registerkarte Info in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung verfügbar ist, und speichern Sie sie in einer Datei. Öffnen Sie die .zip Archivdatei und folgen Sie den Installationsschritten. Öffnen Sie die Software, sobald die Installation abgeschlossen ist.
   3. Wählen Sie den Ordner mit den zu korrigierenden Bildern aus, indem Sie im Eingabebereich der Bildbearbeitungssoftware auf das Dateisymbol klicken. Eine FOV-Liste wird geladen.
   4. Klicken Sie im Eingabebereich auf das Symbol Filter , um Standardkorrekturen anzuwenden. Visualisieren Sie für jeden Kanal Bilder, die vor und nach der Korrektur auf der rechten Seite des Bildschirms aufgenommen wurden.
   5. Klicken Sie im Ausgabebereich auf das Diskettensymbol , um das korrigierte Image zu speichern.
2. Bildfilterung: Voronoi Tesselation
   HINWEIS: Voronoi-Tesselierungsdiagramme zeigen eine Aufteilung des Raums mit Seed-Punkten in Voronoi-Zellen. Ziel ist es, die Zelldichte abzuschätzen und Zellgrenzen zu definieren. Mit der Voronoi-Tesselationsberechnung wird eine Maske generiert und zum Filtern auf das Originalbild angewendet.
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Filterung und wählen Sie Voronoi Tesselation im Menü Filterparameter.
   2. Wählen Sie im Eingabebereich das Bild MassCorrected.tiff aus. Klicken Sie im Eingabebereich auf das Symbol Filter .
   3. Klicken Sie auf das Diskettensymbol im Ausgabebereich, um das gefilterte Image zu speichern. Die beiden resultierenden Dateien haben die Suffixe -Filtered.tiff und -Filtered.json.
      HINWEIS: Das Bild mit dem Namen MassCorrected-Filtered.tiff kann dann in ein digitales Analyseprogramm eines Drittanbieters oder ein Open-Source-Softwareprogramm hochgeladen werden.

Mandel- und Lungenadenokarzinom-TMA-Gewebeschnitte (5 mm dick) wurden entnommen und auf die Mitte von goldbeschichteten Objektträgern gelegt, wobei die Spezifikationen bezüglich Gewebegröße und sicherer Ränder der Objektträger eingehalten wurden. Für eine optimale Färbung sind freie Glasränder von 5 mm bzw. 10 mm zwischen dem Geweberand und den seitlichen bzw. unteren Rändern der Objektträger notwendig. Die Gewebeabschnitte wurden vor der Färbung über Nacht in einem Ofen gebacken, um die ordnungsgemäße Haftung des Abschnitts auf dem Objektträger zu gewährleisten. Das Antikörper-Panel bestand aus 23 Markern. In derselben Färbecharge wurden ein Mandelobjektträger und ein TMA-Objektträger mit mehreren Geweben eingeschlossen, um die Expression von Markern zu bewerten, die in Lungenadenokarzinomproben nur spärlich exprimiert wurden (Abbildung 1). Positivkontrollen müssen entsprechend den Zielen der in den Panels verwendeten Antikörper ausgewählt werden; Um beispielsweise die SOX10-Expression zu bewerten, werden Melanomproben benötigt, und zur Bewertung der GAFP-Expression werden Glioblastomproben benötigt (Abbildung 2).

Abbildung 1: Isotopenreinheit und Kanalübersprechen. Die Matrix zeigt den prozentualen Übersprech, der sich aus der Reinheit der Sonde und den Oxiden ergibt (blaue Kästchen, ≥0,5%; klare Kästchen, <0,5%). Für die Massentags werden Sonden angezeigt, die mindestens 0,5% Übersprechen in keine Kanäle (grün), einen oder zwei Kanäle (gelb) oder mehr als zwei Kanäle (orange) beigetragen haben. Massenkanäle, die mindestens 0,5% Übersprechen von keinen Sonden (grün), ein oder zwei Sonden (gelb) oder mehr als zwei Sonden (orange) erhalten, werden ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Färbebilder in verschiedenen Geweben . (A) Lungenadenokarzinom. (B) Nichtneoplastische Niere. c) Mandeln. CD20 ist gelb, Ki67 magentafarben, CD3 weiß, CD11c grün, CD68 rot, Zytokeratin cyan und doppelsträngige DNA (dsDNA) blau dargestellt. Vergrößerung, 200x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Färbeverfahren ähnelt stark der immunhistochemischen Standardfärbung und trat an zwei aufeinanderfolgenden Tagen auf. Die fünf Hauptschritte des Färbeprotokolls sind 1) überschüssige Paraffinentfernung, 2) Antigengewinnung, 3) Antikörperblockierung, 4) Antikörperfärbung und 5) Fixierung und Dehydratation (Abbildung 3). Ein grundlegender Schritt im Färbeverfahren besteht darin, Vorkehrungen zu treffen, um eine Metallkontamination der Proben zu vermeiden, einschließlich der Verwendung metallfreier Reagenzien, die in Kunststoffwaren gelagert werden, und der sorgfältigen Handhabung der Proben, um mechanische Schäden zu begrenzen. Es wird empfohlen, den Antikörpercocktail unmittelbar vor der Färbung vorzubereiten. Dies reduziert den Metallaustausch. Sobald die Färbung abgeschlossen war, lagerten wir die Dias und scannten sie am nächsten Tag. Vor der Bildaufnahme ist ein notwendiger Schritt die Folieneinrichtung mit einer webbasierten Bildverwaltungsanwendung (Abbildung 4).

Abbildung 3: Bildaufnahme-Workflow und zugehörige Folie . (A) Zusammenfassung des Bilderfassungsworkflows. 1) Ein FFPE-Gewebeschnitt, der mit metallkonjugierten Antikörpern angefärbt ist, wird mit einer primären Ionenkanone gerastert, wobei sekundäre Ionen freigesetzt werden. 2) Ein Flugzeit-Massenspektrometer trennt und misst Ionen basierend auf ihrer Masse auf Pixelebene. 3) Pixelbasierte Quantifizierung von Sekundärionen. Die y-Achse entspricht der Anzahl der detektierten Ionen (Peak) und die x-Achse entspricht der Masse jedes Metalls. 4) Basierend auf dem Peak jedes Massenspektrums werden mehrdimensionale Bilder rekonstruiert. (B) Schematische Darstellung des in diesem Verfahren verwendeten Objektträgers. Für eine optimale Färbung des Gewebes muss der Abschnitt mindestens 5 mm vom seitlichen Rand des Objektträgers und 10 mm von seinem unteren Rand entfernt sein. Beim Ziehen der hydrophoben Barriere um den Gewebeabschnitt muss sie mindestens 1 mm vom Folienrand entfernt innerhalb des Rechtecks gehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Folieneinrichtung in der webbasierten Bildverwaltungsanwendung. Vor dem Dia-Scannen ist es notwendig, jedes Dia einzurichten. Geben Sie die gewünschten Details ein, die bei der Folienidentifikation helfen können. Klicken Sie auf Abschnitt hinzufügen (schwarzer Pfeil), um die Block- und Positionsinformationen einzuschließen. Klicken Sie zum Speichern auf Senden (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Schalten Sie am Scantag das Erfassungsgerät mithilfe der Steuerungssoftware ein. Ein Klick auf Exchange Slide öffnete die Tür des Instruments und ermöglichte das Laden eines Dias. Wir positionierten den Schlitten auf dem Ladeschlitz mit dem Etikett auf der rechten Seite. Es kann nur ein Dia gleichzeitig gescannt werden. Der nächste Schritt bestand darin, die FOVs auszuwählen und den Fokus und die Stigmatisierung gemäß den im Protokoll beschriebenen Schritten anzupassen. Wir haben Bilder aufgenommen, indem wir auf Start Run geklickt haben. Die Erfassungszeit variiert je nach gewünschter Sichtfeldgröße und Auflösung. Die FOV-Größe reicht von 200 μm x 200 μm bis 800 μm x 800 μm, was einem Bildgrößenbereich von 128 Pixel x 128 Pixel bis 2048 Pixel x 2048 Pixel entspricht. Es stehen drei Standardauflösungen zur Verfügung: grob, fein und superfein. Das Scannen größerer FOVs mit superfeiner Auflösung ist zeitaufwändig, wobei die endgültige Erfassungszeit für ein Sichtfeld zwischen 25 s und 4,7 h liegt (Abbildung 5).

Abbildung 5: Bildaufnahme mit der Steuerungssoftware. Die Erfassungseinstellungen können beliebig angepasst werden. Um die Scanauflösung zu ändern, klicken Sie auf das Dropdown-Menü nach Imaging-Modus (schwarzer Pfeil). Um die FOV-Größe zu ändern, geben Sie eine Zahl in das Feld FOV-Größe (μm) ein (roter Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nach Abschluss des Scanvorgangs wurde automatisch ein Bildsatz mit allen FOVs in die webbasierte Bildverwaltungsanwendung hochgeladen. Neben der Speicherung von Bildern ermöglicht diese Anwendung die Visualisierung aller Kanäle zusammen oder separat, Bildanpassungen und das Herunterladen von Bildern zur weiteren Vorbereitung. Das visualisierte Standardbild wird als TIFF-Datei gespeichert (Abbildung 6).

Abbildung 6: Bildvisualisierung mit der webbasierten Bildverwaltungsanwendung. Die aufgenommenen Bilder werden über die Online-Plattform gespeichert und visualisiert. Es ist möglich, die Visualisierungsparameter anzupassen und die Farbe jedes Markers zu ändern. Klicken Sie auf Bildkanal hinzufügen (weißer Pfeil), um andere Marker zu visualisieren. Vergrößerung, 200x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Metallinterferenzen sind den Metallmarkierungsmethoden trotz der Verwendung von Strategien zu ihrer Minimierung inhärent. Um die überschüssigen Hintergrundsignale von Metallisotopen, die an die Antikörper konjugiert sind, zu entfernen und Bilder für die Analyse vorzubereiten, haben wir die zugehörige Bildverarbeitungssoftware verwendet (siehe Materialtabelle). Die Bildvorbereitung besteht aus zwei Schritten: 1) isobare Korrektur, die Signale zwischen den Kanälen entfernt, und 2) Filterung, die Signale entfernt, die durch Aggregate auf dem Bild verursacht werden.

Um die isobare Korrektur zu starten, wurde die Datei mit dem gespeicherten TIFF-Bild durch Klicken auf das Dateisymbol des Eingabebereichs ausgewählt. Die Software lädt automatisch alle archivierten TIFF-Bilder in die Datei, was eine Stapelanalyse ermöglicht. Als nächstes korrigierten wir das Bild, indem wir auf das Filtersymbol des Eingabebereichs klickten. Zwei resultierende Dateien mit dem Suffix -MassCorrected wurden automatisch generiert: eine im TIFF-Format und die andere im JSON-Format. Standardmäßig wurden die resultierenden Archive in derselben Datei gespeichert, aus der das ursprüngliche Image geladen wurde (Abbildung 7).

Abbildung 7: Bildvorbereitung: Korrekturschritt. Um ein Bild zur Vorbereitung in die Bildbearbeitungssoftware zu laden, klicken Sie im Eingabebereich auf das Dateisymbol (schwarzer Pfeil) und wählen Sie das Bild aus. Um das Standard-Korrekturverfahren anzuwenden, klicken Sie auf das Filtersymbol im Eingabebereich (roter Pfeil). Um das aktualisierte, korrigierte Image zu speichern, klicken Sie im Ausgabebereich auf das Diskettensymbol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der zweite Schritt der Bildvorbereitung ist die Filterung, die auf der oberen Registerkarte in der Software ausgewählt werden kann. Wir haben das korrigierte Bild im Eingabebereich ausgewählt. In diesem Schritt wurde die automatisierte Voronoi-Tesselierung als Filterparameter verwendet. Ein Klick auf das Filtersymbol im Eingabebereich wendet den ausgewählten Filter automatisch auf alle Kanäle an. In beiden Bildvorbereitungsschritten (Korrektur und Filterung) werden die Bilder jedes Kanals vor und nach der Verarbeitung und Signaldifferenzen auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt.

Ähnlich wie beim isobaren Korrekturschritt wurden zwei neue Archive generiert, eines im TIFF- und eines im JSON-Format. In diesem Schritt lautete das Suffix nach dem Dateinamen -Filtered. Daher wurde das endgültige Bild MassCorrected-Filtered.tiff genannt. Nach Abschluss dieser Schritte bereiteten wir das Bild für die Analyse mit der bevorzugten digitalen Pathologiesoftware vor (Abbildung 8 und Abbildung 9). Mit dieser Technik konnten wir alle 23 Marker im Antikörperpanel mit minimalen Interferenzen zwischen den Kanälen auf subzellulärer Ebene in einem einzigen Gewebeabschnitt analysieren.

Abbildung 8: Bildvorbereitung: Filterschritt. Wählen Sie Filterung in der oberen Registerkarte (schwarzer Pfeil) in der Bildbearbeitungssoftware. Wählen Sie unter Filterparameter die gewünschte Methode aus (grüner Pfeil). Wählen Sie im Eingabebereich MassCorrected-Bild aus. Um die ausgewählte Prozedur auf das Bild anzuwenden, klicken Sie auf das Filtersymbol im Eingabebereich (roter Pfeil). Um das aktualisierte gefilterte Image zu speichern, klicken Sie im Ausgabebereich auf das Diskettensymbol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: Repräsentative Bilder der Färbung vor und nach der Bildvorbereitung. (A) Bild eines Mandelgewebeschnitts, der mit dieser Technik gefärbt und vor dem Filtern und Korrigieren mit einem digitalen Bildanalyseprogramm eines Drittanbieters visualisiert wurde. (B) Bild desselben Ausschnitts unter den gleichen Bedingungen nach Filter- und Korrekturschritten. CD20 ist gelb, Ki67 magentafarben, CD3 weiß, CD11c grün, Zytokeratin cyan und doppelsträngige DNA (dsDNA) blau dargestellt. Vergrößerung, 200x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatzdatei 1: Liste der Antikörperpanels. Jeder Antikörper wurde an ein bestimmtes Metallisotop mit einer anderen Masse als aufgeführt konjugiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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