Method Article

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
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Summary

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Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.

Abstract

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Reife Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, die Knochen durch die Sekretion von Säuren und Enzymen abbauen können. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen (z.B. Osteoporose und Knochenkrebs) und sind daher wichtige Forschungsgegenstände. In vitro kann ihre Aktivität durch die Bildung von Resorptionsgruben analysiert werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Pit-Assay-Methode unter Verwendung von mit Calciumphosphat (CaP) beschichteten Zellkulturplatten, die leicht visualisiert und quantifiziert werden können. Osteoklastenvorläufer, die aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) gewonnen wurden, wurden auf den beschichteten Platten in Gegenwart von osteoklastogenen Reizen kultiviert. Nach 9 Tagen Inkubation wurden Osteoklasten fixiert und für die Fluoreszenzbildgebung gefärbt, während die CaP-Beschichtung durch Calcein gefärbt wurde. Um die resorbierte Fläche zu quantifizieren, wurde die CaP-Beschichtung auf Platten mit 5% AgNO3 gefärbt und durch Hellfeldbildgebung visualisiert. Die Resorptionsgrubenfläche wurde mit ImageJ quantifiziert.

Introduction

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Osteoklasten (OCs) sind gewebespezifische Makrophagen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) gewonnen werden und zusammen mit Osteoblasten 1 eine zentrale Rolle beim Knochenumbauspielen. Sexualhormon-induzierte, immunologische und maligne Knochenerkrankungen, die Knochen systemisch oder lokal zerstören, sind auf übermäßige osteoklastische Aktivität zurückzuführen, einschließlich Menopause-bedingte Osteoporose2, rheumatoide Arthritis3, Parodontitis4, Myelom-Knochen-Krankheit5 und osteolytische Knochenmetastasen6. Im Gegensatz dazu können Defekte in der OC-Bildung und -Funktion auch Osteopetrose7 verursachen. HSCs werden unter Stimulation des Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF, Gensymbol ACP5) in OC-Vorläufer differenziert. In Gegenwart von M-CSF und Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL, Gensymbol TNFSF11) differenzieren OC-Vorläufer weiter in mononukleäre OCs und fusionieren anschließend zu mehrkernigen OCs 8,9,10. Beide Zytokine M-CSF und RANKL sind unverzichtbar und ausreichend für die Induktion osteoklastischer Marker wie Calcitonin-Rezeptor (CT), Rezeptoraktivator des Kernfaktors κ B (RANK), Protonenpumpe V-ATPase, Chloridkanal 7 alpha-Untereinheit (CIC-7), Integrin β3, tartratresistente Säurephosphatase (TRAP, Gensymbol ACP5), lysosomale Cysteinprotease-Cathepsin K (CTSK) und Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP9). Aktivierte OCs bilden eine Dichtungszone auf der Knochenoberfläche durch die Bildung eines Aktinrings mit einem gerüschten Rand11,12. Innerhalb der Dichtungszone vermitteln OCs die Resorption durch Sekretion von Protonen über die Protonenpumpe V-ATPase 12,13, MMP914 und CTSK 15, was zur Bildung von Lücken führt.

Für In-vitro-Experimente können OC-Vorläufer durch Expansion von Knochenmarkmakrophagen aus Femur und Tibia 16,17 von Mäusen sowie durch Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Blutproben und Buffy Coats18,19,20 oder durch Differenzierung der immortalisierten murinen monozytären Zellen RAW 264.7 21,22 erhalten werden.

Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir einen osteoklastischen Resorptionsassay in CaP-beschichteten Zellkulturplatten unter Verwendung von OCs, die von primären PBMCs abgeleitet sind. Die hier verwendete CaP-beschichtete Zellkulturplattenmethode wurde von der zuvor von Patntirapong et al.17 und Maria et al.21 beschriebenen Methode übernommen und verfeinert. Um OC-Vorläufer zu erhalten, werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und wie zuvor beschriebenexpandiert 20.

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Protocol

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Das Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 287/2020B02).

1. Herstellung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten

  1. Herstellung von Calcium-Stammlösung (25 mM CaCl 2·2H 2 O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O im Tris-Puffer)
    1. Bereiten Sie den 1,0 M Tris-Puffer vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein.
    2. Stellen Sie ein Glasbecherglas auf einen Magnetrührer und fügen Sie 100 ml 1,0 M Tris-Puffer hinzu.
    3. 0,368 g CaCl 2·2H 2 O, 8,0 gNaCl und 0,305 g MgCl2·6H2Oabwägen und nacheinander in Tris-Puffer auflösen.
    4. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Bei Raumtemperatur lagern.
  2. Herstellung von Phosphatlagerlösung (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO 3 in Tris-Puffer)
    1. Stellen Sie ein Glasbecherglas auf einen Magnetrührer und fügen Sie 100 ml 1,0 M Tris-Puffer hinzu.
    2. 0,158 g Na2HPO4· abwiegen H2Ound 0,353 gNaHCO 3 und lösen sich nacheinander im Tris-Puffer auf.
    3. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Bei Raumtemperatur lagern.
  3. Vorverkalkung von 96-Well-Zellkulturplatten
    1. Es werden 30 ml Arbeitslösung hergestellt, indem 15 ml 1,0 m Tris-Puffer, 7,5 ml Calciumstock (Schritt 1.1.4) und 7,5 ml Phosphatstocklösung (Schritt 1.2.3) gemischt werden. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.
    2. Bereiten Sie eine 96-Well-Zellkulturplatte mit flachem Boden vor. Pipette 300 μL Calciumphosphatlösung (Schritt 1.3.1.) in jedes Well. Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3 Tage.
  4. Herstellung von Calciumphosphatlösung (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl 2·2H 2 O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris Base in ddH 2O)
    1. Fügen Sie 2 ml 1 M HCl zu 40 ml entionisiertem Wasser in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührperle und lösen Sie 0,016 g Na2HPO4· H2O, 0,0295 g CaCl 2·2H2 O, 0,409 g NaCl und 0,303 g Tris-Base nacheinander.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 50 ml zu füllen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.
  5. Verkalkung von 96-Well-Zellkulturplatten
    1. Aspirationsvorverkalkungslösung aus den vorverkalkten Zellkulturplatten mit 96 Wells und Zugabe von 300 μL Calciumphosphatlösung (Schritt 1.4.2) zu jeder Vertiefung. Die Platten mit einem Deckel abdecken und 1 Tag bei 37 °C inkubieren.
    2. Drehen Sie die Platte um, um die Lösung auszugießen, und waschen Sie die Platte dreimal gründlich mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platte sofort mit einem Haartrockner oder einem komprimierten CO2- oderN2-Gas , um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten.
    3. Sterilisieren Sie die beschichtete Platte durch UV-Strahlung in einer sauberen Bank für 1 h. Verwenden Sie die beschichtete Platte sofort oder verschließen Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.

2. Isolierung von PBMCs aus menschlichem peripherem Blut

  1. Entnehmen Sie 15 ml Blut aus der Vene, nachdem Sie die schriftliche Einverständniserklärung des Blutspenders eingeholt haben (ethische Abstimmung: 287/2020B02).
  2. Verdünnen Sie 15 ml frisches Blut mit einem gleichen Volumen PBS und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umkehren oder die Mischung in und aus einer Pipette ziehen.
  3. Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Rohr mit 15 ml Dichtegradientenlösung (z. B. Ficoll, Table of Materials) pro Tube vor. Kippen Sie das Röhrchen und schichten Sie vorsichtig 30 ml verdünnte Blutprobe auf die 15 ml Dichtegradientenlösung (verdünnte Blutprobe: Dichtegradientenlösung, Verhältnis 1: 0,5-1).
    HINWEIS: Achten Sie beim Überlagern der Probe darauf, die Dichtegradientenlösung nicht mit der verdünnten Blutprobe zu mischen.
  4. Zentrifuge bei 810 x g für 20 min bei 20 °C in einem Schwenkschaufelrotor ohne Bremse.
  5. Aspirieren Sie die obere Schicht und lassen Sie die mononukleäre Zellschicht (Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten) in der Interphase ungestört.
  6. Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig auf eine neue konische 50-ml-Röhre.
  7. Füllen Sie das Röhrchen mit PBS, Mix und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 20 °C (Bremse kann ab dieser Stufe verwendet werden).
  8. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig. Resuspendiert das Zellpellet in 50 ml PBS und zentrifugiert bei 300 x g für 10 min bei 20 °C. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig.
  9. Zur Entfernung von Blutplättchen das Zellpellet in 50 ml PBS resuspendieren und bei 200 x g für 10 min bei 20 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig.
  10. Transfer von resuspendierten Zellen in Zellkulturflaschen zur Expansion von OC-Vorläufern.

3. Erweiterung der OC-Vorläufer

  1. Resuspendiert PBMCs in vollständigem α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% Amphotericin B) mit 20 ng/mL M-CSF. Saat-PBMCs mit einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/cm2. Normalerweise können Zellen, die aus 15-20 ml frischem Blut isoliert wurden, in einem 75 cm 2 Kolben (1,5-2 x 107 Zellen) ausgesät werden.
  2. Füttern Sie die Zellen jeden dritten Tag mit frischem komplettem α-MEM mit 20 ng/mL M-CSF, bis die angehängten Zellen einen gewünschten Zusammenfluss erreichen. Typische Erträge sind 1,5-2 x 10 6 Zellen/Kolben, wenn die Zellen zu 95% konfluent sind. Normalerweise dauert die Expansionsphase 6 Tage.
    HINWEIS: Das osteoklastogene Potential der Vorläufersubstanzen kann mit längerer Kultivierungszeit abnehmen.

4. Induktion der Osteoklastogenese in CaP-beschichteten Platten

  1. Um die Zelladhäsion zu erleichtern, inkubieren Sie die CaP-beschichteten Platten mit 50 μL FBS für 1 h in einem 37 °C Inkubator.
  2. Um die OC-Vorläufer zu lösen, waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS, um tote oder nicht adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 4 ml Trypsin (Table of Materials) pro 75 cm2 Kolben für 30 min hinzu.
    1. Fügen Sie 4 ml vollständiges α-MEM hinzu, um die Verdauung zu stoppen, lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellenschaber und übertragen Sie die Zellen in eine 50-ml-Röhre.
    2. Ermitteln Sie die Gesamtzellzahl mit einer Neubauer-Kammer oder ähnlichem.
  3. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 7 min bei 350 x g. Resuspendiert das Pellet in ausreichend vollständigem α-MEM mit 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL RANKL, um eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
  4. Aspirieren Sie FBS-Lösung aus der CaP-beschichteten 96-Well-Platte und pipettieren Sie 200 μL Zellsuspension pro Well (2 x 105 Zellen/Well).
  5. Inkubieren Sie die OC-Vorläufer für den gewünschten Zeitraum oder mit den gewünschten Reagenzien, die für das experimentelle Design relevant sind. Normalerweise kann eine hohe Anzahl von großen und mehrkernigen OCs nach 6 Tagen beobachtet werden und wenn sich Resorptionsgruben bilden. Futterzellen mit frischem komplettem α-MEM-Medium mit 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL RANKL jeden dritten Tag.
  6. Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen, mit 4% Paraformaldehyd für 10 min fixieren und erneut mit PBS waschen.
  7. Verwenden Sie die festen OCs direkt zur Fluoreszenzfärbung oder lagern Sie sie bei 4 °C.

5. Fluoreszenzfärbung von OCs und CaP-Beschichtung

  1. Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Permeabilisierungspuffer (0,1% Triton in PBS) für 5 min.
  2. Färben Sie Aktinfilamente mit 100 μL AlexaFluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 min und aspirieren Sie die Färbelösung. 100 μL Hoechst 33342 Färbelösung (10 μg/ml in PBS) für 10 min in die Färbung von Kernen geben. DAPI kann auch verwendet werden.
  3. Färbung CaP-Beschichtung mit 100 μL 10 μM Calcein in PBS für 10 min. Dreimal mit PBS waschen und Bilder aufnehmen.
  4. Nach der Fluoreszenzbildgebung können die gleichen Platten verwendet werden, um die Resorptionsgrubenfläche durch Von-Kossa-Färbung zu quantifizieren. Waschen Sie dazu die Platten zweimal mit entionisiertem Wasser.

6. Quantifizierung der gesamten Resorptionsgrubenfläche

  1. Um die CaP-Beschichtung mit Von-Kossa-Färbung zu färben, inkubieren Sie mit 50 μL von 5% AgNO3 in deionisiertem Wasser pro Bohrung unter UV-Strahlung für 1 h, bis die Beschichtung auf dem Boden der Bohrlöcher braun geworden ist.
  2. Waschen Sie die Platte dreimal mit deionisiertem Wasser und nehmen Sie Hellfeldbilder auf. Ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, z. B. ein 1,25-faches Objektiv, kann verwendet werden, um den gesamten Brunnen in einem Bild zu erfassen. Dies erleichtert die anschließende Bildanalyse. Alternative Methoden zur Erfassung des gesamten Bereichs des Brunnens können angewendet werden.
  3. Öffnen Sie eine Bilddatei mit ImageJ: File | | öffnen Bild | Typ | 8-Bit. Überprüfen Sie die Maßstabseinheit in der unteren rechten Ecke des Bildes mit der | "Gerade Linie" | analysieren Skalieren einstellen. Geben Sie die Länge in die Decke "Bekannte Entfernung" ein, geben Sie unter Längeneinheit eine neue Maßstabseinheit ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global.
  4. Liste der zu analysierenden Messparameter: | analysieren Legen Sie die Maße fest. Aktivieren Sie im Fenster Messwerte festlegen die Kontrollkästchen Fläche und Limit auf Schwellenwert.
  5. Messen Sie die Fläche der Gruben: Bild | | anpassen Schwellenwert. Aktivieren Sie im Fenster Schwellenwert das Kontrollkästchen Dunkler Hintergrund , und klicken Sie auf Auto. Der Bereich der Gruben färbt sich rot. Schließen Sie das Fenster Schwellenwert und wählen Sie | analysieren aus. Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei: Datei | Speichern unter.

7. Quantifizierung der OC-Anzahl und -Größe sowie der normalisierten Resorptionsgrubenfläche

  1. Öffnen Sie ein Fluoreszenzbild von Osteoklasten mit ImageJ und überprüfen Sie die Skalierungseinheit (siehe Schritt 6.3).
  2. Liste der zu analysierenden Messparameter: | analysieren Legen Sie die Maße fest. Aktivieren Sie im Fenster Messwerte festlegen das Kontrollkästchen Bereich .
  3. Skizzieren Sie die OCs mit ROI Manager und Polygon-Auswahl: Analysieren | Tools | ROI-Manager. Klicken Sie im Toolset auf Polygonauswahl, skizzieren Sie ein OC (Zellen mit Aktinring und ≥ drei Kernen) und klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf [t] hinzufügen . Wiederholen Sie die Gliederung, bis alle OCs enthalten sind.
  4. Anzahl und Größe von OCs messen: Wählen Sie alle Elemente im ROI-Manager aus und klicken Sie auf Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei: Datei | Speichern unter (Abbildung 3E).
  5. Messen Sie die Grubenfläche von Fluoreszenzbildern. Öffnen Sie das fluoreszierende Bild der Beschichtung, die mit dem Bild in Schritt 7.3 korreliert ist, und überprüfen Sie die Maßstabseinheit (siehe Schritt 6.3).
    1. Listen Sie die zu analysierenden Messparameter auf (siehe Schritt 6.4). Bild | auswählen | anpassen Schwellenwert. Deaktivieren Sie im Fenster Schwellenwert alle Kontrollkästchen, und klicken Sie auf Auto. Der Bereich der Gruben färbt sich rot. Schließen Sie das Fenster Schwellenwert und wählen Sie | analysieren aus. Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei.
  6. Berechnen Sie die normalisierte Grubenfläche anhand der OC-Zahl.

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Results

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Die Calciumphosphatbeschichtung auf dem Boden der Zellkulturplatten wurde in zwei Beschichtungsschritten durchgeführt, die eine 3-tägige Vorverkalkung und einen 1-tägigen Verkalkungsschritt umfassten. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde gleichmäßig verteiltes Calciumphosphat auf der Unterseite der 96-Well-Platten erhalten. Die Beschichtung haftet nach den durchgeführten Waschschritten sehr gut am Boden.

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Discussion

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Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay unter Verwendung von OCs, die in vitro von PBMCs abgeleitet und expandiert wurden. Die verwendeten CaP-beschichteten Zellkulturplatten können mit laborverfügbaren Materialien einfach vorbereitet und visualisiert werden. Zusätzlich zu den unsortierten PBMCs, die in diesem Protokoll übernommen wurden, wurden OCs, die aus murinen monozytären Zellen21 und Knochenmarkmakrophagenzellen

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde teilweise vom China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394] finanziert. W.C. wurde von CSC finanziert.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Silbernitrat
a-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, keine Nukleoside
Amphotericin BBiochrom03-028-1BAmphotericin B Lösung
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GCalciumchlorid-Dihydrat
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524fötales Rinderserum
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
FixierungspufferBiolegend420801Paraformaldehyd
HClMerk1.09057.1000Salzsäure
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Rekombinantes humanes M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Magnesiumchlorid
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Natriumhydrogenphosphat wasserfrei
NaClMerkS7653-250GNatriumchlorid
NaHCO3MerkK15322429Natriumbikarbonat
PBSLonza17-512FDulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X), DBPS ohne Calcium und Magnesium
Pen-StrepLonzaDE17-602EPenicillin-Streptomycin-Gemisch
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01Rekombinanter humaner sRANK-Ligand (E.coli-abgeleitet)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkylphenyl-Polyethylenglykol
TrypLE ExpressGibco12605010rekombinante Zelldissoziationsenzyme

References

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