Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Zusammenfassung

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Zusammenfassung

Die visuelle Biochemie ist eine leistungsfähige Technik zur Beobachtung der stochastischen Eigenschaften einzelner Enzyme oder Enzymkomplexe, die in der Mittelung in Massenphasenstudien verdeckt werden. Um eine Visualisierung zu erreichen, werden zwei optische Pinzetten, bei denen eine Falle fest und die andere beweglich ist, in einen Kanal einer Multi-Stream-Mikrofluidikkammer fokussiert, die auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops positioniert ist. Die optische Pinzette fängt einzelne Moleküle fluoreszenzmarkierter DNA ein und Flüssigkeit fließt durch die Kammer und vorbei an den gefangenen Perlen, dehnt die DNA in B-Form (unter minimaler Kraft, dh 0 pN), wobei die Nukleinsäure als weiße Schnur vor einem schwarzen Hintergrund beobachtet wird. DNA-Moleküle werden von einem Strom zum nächsten bewegt, indem die Stufe senkrecht zum Fluss übersetzt wird, um die Einleitung von Reaktionen auf kontrollierte Weise zu ermöglichen. Um erfolgreich zu sein, werden mikrofluidische Geräte mit optisch klaren Kanälen mit Glasspritzen verbunden, die in einer Spritzenpumpe gehalten werden. Optimale Ergebnisse sind fest mit der Durchflusszelle verbundene Steckverbinder, mechanisch steife und chemisch beständige Schläuche, die mit Schaltventilen verbunden sind, die Blasen eliminieren, die eine laminare Strömung verhindern.

Einleitung

Die Fähigkeit, Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit zu visualisieren, hat einen signifikanten Einblick in die Genomstabilität geliefert ^1,2. Zusätzlich zur Arbeit mit einzelnen DNA-Molekülen bietet die Möglichkeit, Transaktionen zwischen einzelnen Molekülen in der Nähe anzuzeigen, zusätzliche Einblicke ^3,4,5. Die Manipulation zusätzlicher DNA-Moleküle erfordert sowohl zusätzliche optische Fallen als auch hochwertige, mehrkanalige, mikrofluidische Flusszellen⁶.

Es gibt mehrere Methoden, um mehr als eine optische Falle zu erzeugen. Dazu gehören Galvanometer-Scanning-Spiegel, akustische optische Modulatoren und diffraktive Optiken, die holographische optische Pinzetten 4,7,8,9 erzeugen. Oft erzeugen scannende Spiegel und akustische optische Modulatoren Fallen, die Timesharing ermöglichen. In dem hier beschriebenen Aufbau wird der Strahl eines einzelnen Nd:YAG-Lasers auf Polarisation aufgeteilt, und dann steuern Galvanometer-Laserscanning-Spiegel die Position der sogenannten mobilen Falle (Abbildung 1)⁴. Um die Positionierung von Spiegeln und Filtern zu erleichtern, um den Einfangstrahl auf die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs zu lenken, wird ein HeNe-Laser verwendet. Dies erleichtert die Gesamtausrichtung, da der HeNe-Strahl mit bloßem Auge sichtbar ist, Infrarotstrahlen hingegen nicht. Der HeNe-Strahl ist auch sicherer zu arbeiten, wodurch die Positionierung von Spiegeln und anderen Komponenten weniger belastend wird. Zunächst ist der Strahlengang für diesen Laser vom 1064-nm-Strahl getrennt, wird aber in denselben Strahlengang und dann in das Mikroskopobjektiv eingeführt. Sobald die physikalische Ausrichtung erreicht ist, wird der 1064-nm-Strahl auf dem HeNe-Strahl positioniert, was durch die Verwendung eines Infrarot-Viewers und verschiedener Strahlbildgebungswerkzeuge zur Visualisierung der Strahlposition und -qualität erleichtert wird. Dann wird der Strahlexpander eingeführt und der resultierende erweiterte Infrarotstrahl wird auf die hintere Öffnung des Objektivs ausgerichtet. Schließlich wird das Objektiv entfernt und die Leistung in jedem polarisierten Strahl wird gemessen und unter Verwendung von λ/2-Wellenplatten so eingestellt, dass sie gleich ist (Abbildung 1C). Leistungsmessungen werden auch durchgeführt, sobald das Objektiv zurückgegeben wird, und in der Regel gibt es einen Leistungsverlust von 53%. Es ist jedoch genügend Energie vorhanden, um stabile feste und bewegliche optische Fallen in der Brennebene zu bilden (Abbildung 1D).

Für die Abbildung von DNA-Transaktionen spielen mikrofluidische Flusszellen eine Schlüsselrolle, da sie kontrollierte Messungen auf Einzelmolekülebene mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen (Abbildung 2). Der Begriff Mikrofluidik bezieht sich auf die Fähigkeit, Flüssigkeiten in einem oder mehreren Kanälen mit Abmessungen von 5-500 μm^10,11 zu manipulieren. Der Begriff Strom bezieht sich auf die tatsächliche Flüssigkeit innerhalb eines Kanals und der Kanal bezieht sich auf den physikalischen Kanal, in dem sich ein oder mehrere Flüssigkeitsströme bewegen. Einkanal-Durchflusszellendesign hat einen gemeinsamen, physikalischen Kanal, in dem Reaktionen beobachtet werden und typischerweise nur ein Flüssigkeitsstrom vorhanden ist. Daher werden diese Designs als Single-Stream-Durchflusszellen bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind Multi-Stream-Durchflusszellen als mikrofluidische Vorrichtung definiert, bei der zwei oder mehr Eintrittskanäle zu einem einzigen, gemeinsamen, physikalischen Kanal konvergieren (Abbildung 2A). Innerhalb des gemeinsamen Kanals fließen die aus den einzelnen Kanälen stammenden Flüssigkeitsströme parallel zueinander und bleiben getrennt, wobei aufgrund der Diffusion nur eine minimale Durchmischung zwischen ihnen auftritt (Abbildung 2B). In den meisten Versuchsaufbauten drückt eine einzige Pumpe Flüssigkeiten mit der gleichen Geschwindigkeit in jeden Kanal. Im Gegensatz dazu drücken bei der Grenzlenkung drei oder mehr unabhängig voneinander gesteuerte Pumpen Flüssigkeiten durch die Kanäle. Jede Pumpe arbeitet jedoch mit einer anderen Drehzahl, aber der Nettodurchfluss im gemeinsamen Kanal ist konstant¹². Dies ermöglicht den schnellen Austausch von Hauptkanalkomponenten durch einfache Änderung der Pumpendrehzahl.

Neben der laminaren Strömung ist ein weiterer kritischer Faktor das parabolische Geschwindigkeitsprofil innerhalb des laminaren Strömungsstroms. Die höchste Strömungsgeschwindigkeit tritt in der Mitte des Stroms auf, die langsamste in der Nähe der Oberflächen (Abbildung 2C)¹³. Dieses Profil muss berücksichtigt werden, um ein DNA-Molekül, das an eine im Strom gehaltene Perle gebunden ist, vollständig zu dehnen, um fluoreszierende DNA präzise zu visualisieren und genaue Einzelmolekülanalysen durchzuführen. Hier wird die DNA zur B-Form gestreckt und unter 0 pN Kraft an Ort und Stelle gehalten. Um dies zu erreichen, sollte die Fokussierung der optischen Fallenposition auf eine Position 10-20 μm von der unteren Deckglasoberfläche erfolgen (Abbildung 2D). Es muss darauf geachtet werden, dass das DNA-Molekül nicht über die B-Form hinaus gestreckt wird, da dies Enzymreaktionen hemmen kann. Unter typischen Pufferbedingungen ist 1 μm = 3.000 bp DNA¹⁴. Darüber hinaus wird der DNA-Komplex durch das Einfangen von 10-20 μm vom Deckglas weit von der Oberfläche entfernt, wodurch Oberflächeninteraktionen minimiert werden.

Viele Methoden wurden verwendet, um mikrofluidische Gerätekanäle zu erzeugen, und diese können im Labor durchgeführt werden oder Durchflusszellen können aus kommerziellen Quellen gekauft werden 6,15,16,17. Die optimalen Materialien, die für die Konstruktion der Durchflusszellen verwendet werden, müssen mechanisch steif, optisch transparent mit geringer Fluoreszenz und undurchlässig für organische Lösungsmittel sein⁶. Häufig wird Borosilikat-Floatglas oder Quarzglas verwendet, um eine stabile Strömungsumgebung für eine längere Zeit bereitzustellen, die für optisches Einfangen, Visualisierung und Krafterkennung geeignet ist. Diese Materialien ermöglichen auch die Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln (z. B. spektrophotometrisches Methanol), um die Oberflächenbenetzung und Entfernung von Luftblasen zu vereinfachen, und Denaturierungsmitteln (z. B. 6M Guanidiniumhydrochlorid) oder Reinigungsmitteln zur Reinigung der Durchflusszelle. Schließlich variieren die Methoden zum Einbringen von Flüssigkeiten in Durchflusszellen von komplexen Vakuumpumpensystemen bis hin zu einzelnen Spritzenpumpen 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bei dem hier beschriebenen Ansatz wird eine Spritzenpumpe verwendet, die bis zu 10 Spritzen aufnehmen kann (Abbildung 3A). Dies bietet Flexibilität für den Einsatz von einkanaligen Durchflusszellen oder Durchflusszellen mit mehreren Einlasskanälen. Hier wird eine dreikanalige Durchflusszelle verwendet, die mit Spritzen verbunden ist, die an der Spritzenpumpe mit Polyetherether-Keton-Schläuchen (PEEK) befestigt sind (Abbildung 3A-C). Der Durchfluss von Flüssigkeiten wird durch Vierwegeschaltventile gesteuert und dient somit dazu, das Einbringen von Blasen in die Durchflusszelle zu minimieren (Bild 3A,D). Darüber hinaus werden gasdichte Hamilton-Spritzen mit steifen Glaswänden und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben empfohlen, da sie eine außergewöhnlich gleichmäßige Kolbenbewegung bieten, die für einen reibungslosen Fluss unerlässlich ist^14,27.

In dem beschriebenen Versuchssystem wurden Flusszellen mit zwei bis fünf Einlasskanälen eingesetzt. Die Anzahl der Einlasskanäle wird durch das durchgeführte Experiment bestimmt. Für die Untersuchung von RecBCD und Hop2-Mnd1 waren zwei Stromkanäle ausreichend^14,28. Für die Helikase wurde das Enzym an das freie Ende der DNA gebunden und in einen Strom mit Magnesium und ATP übersetzt, um die Translokation und den Abbau einzuleiten. Für Hop2-Mnd1 wurde optisch eingeschlossene DNA in den angrenzenden Flüssigkeitsstrom übersetzt, der Proteine und Puffer ± zweiwertigen Metallionen enthält. Die Verwendung von Dreikanal-Flusszellen ermöglicht es, DNA in Strom 1 einzufangen, die DNA in Strom 2 zu übersetzen, um eine Proteinbindung zu ermöglichen, und dann in Strom 3, wo ATP vorhanden ist, um beispielsweise Reaktionen auszulösen. Eine Variation des oben Gesagten besteht darin, fluoreszierendes Protein in Kanal 2 zu verwenden, was dazu führt, dass der Flüssigkeitsstrom vollständig weiß ist und die Visualisierung der DNA ausschließt. Wenn dieses Molekül in Strom 3 übersetzt wird, sind nun sowohl Proteine als auch DNA sichtbar, wenn Reaktionen ausgelöst werden.

Die Verwendung von Vierwege-Schaltventilen zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses ist eine kritische Komponente des Systems, um Blasen in den Durchflusszellen zu eliminieren. Blasen sind schädlich für eine stabile Flüssigkeitsströmung, da sie sich auf unvorhersehbare Weise zusammenziehen und ausdehnen, was zu schnellen Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit und der Einführung von Turbulenzen führt. Wenn die Ventile zwischen Spritzen und Einlassschlauch positioniert sind, wird der Durchflusspfad durch Umschalten der Ventilposition beim Spritzenwechsel getrennt. Wenn die neue Spritze eingesetzt wird, kann der Kolben manuell gedrückt werden, so dass >6 μL (das Totvolumen des Ventils) ausgestoßen werden und Blasen fast vollständig eliminiert werden.

Die Befestigung von Steckverbindern an Durchflusszellen ist häufig der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Verwendung von Durchflusszellen. Wir beschreiben die Verwendung von zwei Arten von Steckverbindern: abnehmbare sogenannte Press-Fit-Steckverbinder und permanente (Nanoport-Baugruppen). Die abnehmbaren Verbinder lassen sich einfach auf eine Durchflusszelle kleben und mit diesen Steckverbindern können neben dem empfohlenen PTFE auch verschiedene Arten von flexiblen Schläuchen getestet werden. Dies ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Schläuche und Steckverbinder zu testen, ohne auf teurere Glasdurchflusszellen verzichten zu müssen. Im Gegensatz dazu sind Nanoport-Baugruppen dauerhaft angebracht, halten Drücken bis zu 1.000 psi stand und in unseren Händen ist ihre Verwendung auf PEEK-Schläuche unterschiedlicher Durchmesser beschränkt. Dies ist kein Nachteil, da vorzugsweise PEEK-Schläuche verwendet werden. Eine einzelne Glasdurchflusszelle mit festen Baugruppen kann bei sorgfältigem Gebrauch länger als 1 Jahr wiederverwendet werden.

Protokoll

1. Laserfallenausrichtung und Prüfung mit Styroporperlen

HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 1A,B.

ACHTUNG: Der Experimentator sollte während der Laserstrahlausrichtung eine geeignete Schutzbrille oder Laserschutzbrille tragen. Da das hierin beschriebene optische Pinzettensystem sowohl HeNe- als auch IR-Strahlen verwendet, sind zwei separate Sätze von Laserschutzgläsern erforderlich.

1. HeNe-Strahl-Ausrichtung
   1. Positionieren Sie alle optischen Komponenten auf dem Steckbrett. Richten Sie das Steckbrett so aus, dass es so nah wie möglich an einem 90°-Winkel relativ zum Mikroskop ist.
   2. Befestigen Sie das Gegenrohr mit dem Objektiv und der Telanlinse am Mikroskop (Abbildung 1A-11,12).
      HINWEIS: Das Telan-Objektiv ist ein Linsensystem, das verwendet wird, um das Bild auf der Zwischenbildebene in den Okularen zu fokussieren.
   3. Schalten Sie den HeNe-Laser ein, und öffnen Sie den Verschluss (Abbildung 1A-18). Der Strahl sollte in einer Höhe von 54 mm auf den Filter (Abbildung 1A-3) treffen und 50 % des Lichts auf Spiegel 5 reflektieren (Abbildung 1A-5). Die restlichen 50 % des Strahls treffen auf Spiegel 4 (Abbildung 1A-4) auf der gleichen Höhe wie Spiegel 3.
   4. Stellen Sie Spiegel 4 (Abbildung 1A-4) so ein, dass der Strahl in einer Höhe von 51 mm auf Spiegel 6 (Abbildung 1A-6) trifft.
   5. Stellen Sie Spiegel 6 (Abbildung 1A-6) so ein, dass der Strahl in 51 mm Höhe auf den unteren galvanischen Spiegel gerichtet wird. Der Strahl, der aus dem oberen galvanischen Spiegel austritt, beträgt 57,5 mm.
   6. Stellen Sie Spiegel 3 (Abbildung 1A-3) so ein, dass dieser Strahl in einer Höhe von 57,5 mm auf Spiegel 5 (Abbildung 1A-5) trifft. Nach der Reflexion von Spiegel 5 sollte der Strahl in gleicher Höhe auf Spiegel 9 (Abbildung 1A-9) treffen. Der Strahl wird effektiv am Spiegel 9 rekombiniert, geht durch das Objektiv und das Telan-Linsensystem auf den Spiegel 21 (Abbildung 1A-21), der ihn in das Objektiv reflektiert.
   7. Legen Sie einen sauberen Objektträger auf den Tisch des Mikroskops. Schalten Sie die Kamera ein und bilden Sie die Strahlen der festen und scannenden Strahlen einzeln auf dem Bildschirm ab. Beginnend mit Spiegel 3, dann 5 und 9, schließlich 21, führen Sie kleine Anpassungen durch, um den festen Strahl in der Mitte des Bildschirms zu positionieren.
   8. Um sicherzustellen, dass der Winkel des Strahlaustritts aus dem Spiegel 21 90° beträgt, ändern Sie die Z-Höhe des Mikroskops und positionieren Sie den abgebildeten Strahl auf der Ober- und Unterseite des Objektträgers. Wenn sie identisch sind, befindet sich der Strahl in der richtigen Position, die senkrecht zur Bühne steht. Schließen Sie diesen Strahl mit Verschluss 19 (Abbildung 1A-19).
   9. Beginnen Sie mit den Spiegeln 4 und 6, führen Sie kleine Anpassungen durch, um den festen Strahl in der Mitte des Bildschirms zu positionieren. Schließen Sie diesen Strahl.
2. Infrarot (IR) Strahlausrichtung
   ACHTUNG: Führen Sie alle Schritte aus Sicherheitsgründen bei geringer Laserleistung durch.
   1. Stellen Sie die Wellenplatte 14 (Abbildung 1A-14) ein, um das Verhältnis von übertragenen und reflektierten Strahlen einzustellen, die am Strahlteiler 2 aufgeteilt werden (Abbildung 1A-2). Der Strahlteiler 2 reflektiert die s-Komponente des Laserstrahls und überträgt die p-Komponente.
   2. Der Strahl, der durch 2 hindurchgeht, trifft auf Spiegel 7 (Abbildung 1A-7), der den Strahl auf den unteren galvanischen Spiegel ablenkt. Es sollte dem Weg des HeNe-Strahls auf Spiegel 21 folgen. Führen Sie kleine Bewegungen des Spiegels 7 aus, um diese Positionierung zu erreichen.
   3. Stellen Sie Spiegel 2 so ein, dass der von Spiegel 2 reflektierte Strahl in einer Höhe von 57,5 mm auf Spiegel 10 trifft (Abbildung 1A-10).
   4. Der Strahl wird von Spiegel 10 auf Spiegel 8 (Abbildung 1A-8) in einer Höhe von 57,5 mm reflektiert. Der nachfolgende Strahl sollte auf gleicher Höhe auf Spiegel 9 treffen. Wenn nicht, nehmen Sie bei Bedarf kleine Anpassungen an den Spiegeln 10 und 8 vor.
   5. Entfernen Sie das Objektiv und platzieren Sie den Kopf des Leistungsmessers über dem Port im Objektivturm.
   6. Verwenden Sie die Platten 14, 15 und 16 (Abbildung 1A-14,15,16), um die Leistung jedes Laserstrahls so einzustellen, dass sie gleich sind, wie in Abbildung 1C gezeigt.
   7. Setzen Sie den Strahlaufweiter 1 (Abbildung 1A-1) ein. Stellen Sie den expandierten Laserstrahl so ein, dass er kreisförmig ohne Koma oder Astigmatismus ist.
   8. Um die optischen Fallen zu testen, stellen Sie eine Lösung aus 1 μm Polystyrolperlen her, die in Wasser suspendiert sind. Geben Sie dann 10 μL dieser Lösung auf einen Objektträger, legen Sie ein Deckglas darauf und verschließen Sie es mit Nagellack. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und testen Sie die optischen Fallen, indem Sie diese 1 μm Perlen einfangen. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in die Fallen gesaugt und stabil gehalten werden, wenn die Bühne bewegt wird. Das Fangen sollte von allen Seiten der Falle gleichermaßen effizient erfolgen.

2. Mikrofluidische Kammervorbereitung

1. Wenn es sich bei der Durchflusszelle um ein kommerziell hergestelltes Gerät aus Polydimethylsiloxan (PDMS) auf einem Deckglas handelt, fahren Sie mit Schritt 3 fort. Wenn es sich um ein Glasgerät mit angeschlossenen Anschlüssen handelt, fahren Sie mit Schritt 4 fort.
2. Wenn an der Durchflusszelle keine Anschlüsse angebracht sind, verkleben Sie diese zuerst mit den Eintrittslöchern am Objektträger. Die Schritte zum Anschließen von Steckverbindern finden Sie in Schritt 3.

3. Flusszellenverbindungen mit einer PDMS-Durchflusszelle

HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2D.

1. Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Oberfläche. Halten Sie den PTFE-Schlauch mit einer Pinzette 3 mm vom freien Ende entfernt. Schieben Sie den Schlauch in den vorgeformten Anschluss (der Anschluss kann einen Leitungsdruck von 2 bar unterstützen).
2. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Ports. Schließen Sie die Einlassöffnungen an die Spritzenpumpe und den Auslass an eine Abfallflasche an (Abbildung 4A,B).
3. Füllen Sie jede Glasspritze mit 1 ml spektrophotometrischem Methanol. Befestigen Sie jede Spritze an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass der Auslass des Ventils auf Abfall gerichtet ist, und spülen Sie jede Leitung mit 50 μl Methanol (Abbildung 4C, geschlossene Position).
4. Schalten Sie die Ausgangsposition auf die Durchflusszelle (Abbildung 4C, offene Position). Pumpen Sie 800 μL Methanol mit einer Durchflussrate von 100 μL/h durch die Durchflusszelle, um die Oberflächen zu benetzen und Blasen zu beseitigen.
5. Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 μL Reinstwasser. Die Durchflusszelle ist nun einsatzbereit.

4. Befestigung von Einpressschlauchverbindern

HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2F.

1. Wenn Einpressschlauchverbinder verwendet werden sollen, entfernen Sie vorsichtig das Klebeband von einer Seite des Steckers und legen Sie es über das Loch im Objektträger. Drücken Sie einige Sekunden lang nach unten. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Konnektoren.
2. Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Oberfläche. Halten Sie den PTFE-Schlauch mit einer Pinzette 3 mm vom freien Ende entfernt. Schieben Sie den Schlauch in das vorgeformte Loch im Anschluss, und wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Anschlüsse.
3. Befestigen Sie die Schläuche von den Einlässen an den Schaltventilen. Fahren Sie mit Schritt 7 fort.

5. Befestigung von ständigen Versammlungen

HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 2A-C.

1. Führen Sie die Befestigung entweder auf einer sauberen, ebenen Oberfläche oder auf einem speziell angefertigten Verteiler durch, um die Durchflusszelle und die Anschlüsse während der Verklebung an Ort und Stelle zu halten.
2. Stellen Sie die Durchflusszelle auf eine saubere, ebene Fläche oder in den vertieften Bereich des Verteilers (Abbildung 2B). Legen Sie eine kleine Menge Glaskleber auf den Boden der Baugruppe und setzen Sie die Dichtung ein.
3. Positionieren Sie den Nanoport über einem der Eintrittslöcher auf dem Objektträger. Drücken Sie vorsichtig nach unten und halten Sie es ohne seitliche Bewegung fest. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Ports.
4. Im Krümmer trocknen lassen oder festklemmen. Entfernen Sie die Durchflusszelle vorsichtig aus dem Verteiler und stellen Sie sicher, dass die Baugruppen gut an den Eingangsöffnungen in der Durchflusszelle ausgerichtet sind. Fahren Sie mit Schritt 7 fort, wenn Sie fertig sind.

6. Flusszellenanschlüsse und Aufbereitung

HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 4A,B.

1. Legen Sie eine Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Schlauch mit den fingerfesten Anschlüssen.
2. Füllen Sie jede Glasspritze mit 1 ml spektrophotometrischem Methanol. Befestigen Sie jede Spritze an einem Schaltventil. Stellen Sie sicher, dass der Auslass des Ventils auf Abfall gerichtet ist, und spülen Sie jede Leitung mit 50 μl Methanol (Abbildung 4C, geschlossene Position).
3. Schalten Sie die Ausgangsposition auf die Durchflusszelle (Abbildung 4C, offene Position). Pumpen Sie 800 μL Methanol mit einer Durchflussrate von 100 μL/h durch die Durchflusszelle, um die Oberflächen zu benetzen und Blasen zu beseitigen.
4. Am nächsten Tag wiederholen Sie diesen Vorgang mit 800 μL Reinstwasser. Die Durchflusszelle ist nun einsatzbereit.

7. Steuerung des Flüssigkeitsflusses

1. Drehen Sie die Schaltventile in die geschlossene Stellung (Abbildung 4C). Entfernen Sie die Spritzen, entsorgen Sie das Restwasser und füllen Sie die Spritzen mit experimentellen Lösungen, z. B. DNA-Perlen; Enzym; und ATP. Bringen Sie die Spritzen zur Pumpe zurück und schließen Sie sie an die Schaltventile an.
2. In dieser Position drücken Sie die Kolben manuell 5-10 μL nach unten, um Blasen zu entfernen. Ändern Sie die Schaltventilstellung auf Offen.
3. Verwenden Sie das Durchflussrateschema, um eine optimale Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit für das Abfangen und die Visualisierung zu erreichen, wie in Tabelle 1 beschrieben. Der optimale Flüssigkeitsfluss für das optische Einfangen sollte ein stabiles Einfangen von Perlen ermöglichen und sobald die DNA gedehnt ist, sollte sie B-Form haben (~ 3.000 bp / μm).

8. Einfangen von Polystyrolperlen mit einzelnen DNA-Molekülen

1. Lokalisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung die Grenze zwischen den Flüssigkeitsströmen in der Nähe der Kanaleintrittspunkte. Öl in das 100-fache Objektiv geben und zur höheren Vergrößerung wechseln.
2. Öffnen Sie die Verschlüsse für die optischen Fallen (entweder beide oder eine gleichzeitig). Die fokussierten Laserstrahlen sollten Perlen einfangen und DNA sollte sich sofort ausdehnen.
3. Sobald ein Komplex eingeschlossen wurde, übersetzen Sie die Stufe senkrecht zur Strömung (Abbildung 3A, C, Einschub). Dadurch wird der eingeschlossene Komplex aus der DNA-Perlenlösung in Strom 2 verschoben. Durch die weitere Übersetzung wird der Komplex in Stream 3 verschoben.

9. Durchflusszellenreinigung

HINWEIS: Führen Sie dies täglich durch.

1. Schalten Sie die Pumpe aus, wenn das Experiment abgeschlossen ist. Drehen Sie die Schaltventile in die geschlossene Stellung (Abbildung 4C).
2. Entfernen Sie die Spritzen und leeren Sie sie. Dreimal mit gefiltertem destilliertem Wasser abspülen.
3. Füllen Sie die Spritzen mit Reinigungslösung. Setzen Sie Spritzen in die Pumpe ein und schließen Sie die Schaltventile an.
4. Spülen Sie die Schaltventile und ändern Sie die Position zum Öffnen. Pumpen Sie 800 μL Reinigungslösung bei einer Durchflussrate von 100 μL/h typischerweise über Nacht.
5. Schließen Sie am nächsten Tag die Schaltventile, entfernen und spülen Sie die Spritzen mit Wasser ab. Spülen Sie die Durchflusszelle und die Leitungen mit 4-800 μL Wasser bei einer Durchflussrate von 400-800 μL/h. Wenn eine anstrengendere Reinigung der Durchflusszellen erforderlich ist, ersetzen Sie die Reinigungslösung durch 6 M Guanidiumhydrochlorid.

Ergebnisse

Die erste Prüfung der Fallenausrichtung und -festigkeit erfolgt mit 1 μm, nicht fluoreszierenden Polystyrolperlen. Da der Großteil der im Labor durchgeführten Forschung Fluoreszenz verwendet, testen wir die Fallenstärke mit 1 μm, Dragon grünen Polystyrolperlen (Abbildung 1D, E). Danach wechseln die Arbeiten zum optischen Einfangen von DNA-Perlenkomplexen, bei denen die DNA mit dem bis-interkalierenden Farbstoff YOYO-1^14,29...

Diskussion

Die sorgfältige Montage des Strömungssystems ist entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis der Experimente ^4,6. Einer der schwierigsten Aspekte des Protokolls ist die Befestigung von Steckern an der Glasoberfläche. Dazu verwenden wir die folgenden zwei Ansätze: Einpressschlauchverbinder und Nanoport-Baugruppen. Einpressverbinder haften leicht auf Glas, gefolgt von PTFE-Schläuchen in die vorgeformten Löcher mit einer Pinzette. Wenn eine stabilere Befestigung erfo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100-fach Objektiv	Leica	506318 oder 506038	Öl-Immersionsobjektive; Nur Bildgebung und optisches Trapping; Plan APO-Objektive, optimiert für die Fluoreszenzbildgebung
10X Objektiv	Leica	506263	Wird verwendet, um Laserstrahlen-Spots während der Ausrichtung zu lokalisieren, um den Fokus und die X-Y-Position in der Durchflusszelle zu bestimmen
1 mm fluoreszierende Kügelchen	Bangs	Labs FSDG004	Wird für die Abstichleistung und die Bestimmung der Brennposition
1 mm Polystyrolkügelchen	Bangs Labs	CPO1004	Wird zur Bewertung der Trap-Leistung und zur Bindung an biotinylierte Moleküle
verwendet 63x Objektiv	Leica	506081	Wird verwendet, um Laserstrahlspots während der Ausrichtung zu lokalisieren und um den Fokus und die X-y-Position in der Durchflusszelle zu finden; kann für optisches Trapping verwendet werden, da es einen identischen Durchmesser der hinteren Apertur wie die 100X hat; Öl-Immersionslinse
Alignment-Laser	Lumentum	1100 series	10 mW HeNe-Laser, der mit bloßem Auge sichtbar ist und zur Positionierung der Optik verwendet wird
Strahlausrichtungskamera	Amscope	MU303	Eine einfache, kostengünstige und softwaregesteuerte Kamera zur Abbildung der Strahlposition
Kamerasteuerungs- und Bilderfassungssoftware	Hamamatsu	HCImage	Koordiniert die Aktivitäten des Lambda DG4 mit der Kamera, um ein schnelles Umschalten der Wellenlänge zu ermöglichen
Kamera; Orca Flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD-Kamera für die Bildgebung von Einzelmolekülexperimenten
C-Mount für die Strahlausrichtungskamera Spot-Imaging-Lösungen		DE50CMT	Bietet eine optimale Positionierung der Kamera für die Abbildung von Laserstrahlen während der Ausrichtung
C-Mount für die Orca Flash 4 Kamera			Verfügt über einen Haltering, um einen IR-Sperrfilter an Ort und Stelle zu halten. Dadurch wird der reflektierte IR-Strahl von den optischen Fallen eliminiert und eine klarere Abbildung von gefangenen Objekten ermöglicht.
Cy5  Fluoreszenzfilterwürfel	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Wird in Verbindung mit Lambda DG4 verwendet, um nur Cy5 abzubilden
Fitc-Txred  Fluoreszenzfilterwürfel	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Wird in Verbindung mit Lambda DG4 verwendet, um FITC- und TXRed-Fluidikschläuche
	abzubilden Grace Bio	46004	PTFE-Schläuche als Alternative zu PEEK; Funktioniert gut mit einigen Durchflusszellen. Kann mit PDMS-Durchflusszellen oder Glasdurchflusszellen verwendet werden, wenn Grace Bio fit Schlauchverbinder verwendet werden
GFP-Fluoreszenzfilterwürfel	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Wird in Verbindung mit Lambda DG4 verwendet, um nur GFP abzubilden
Glasdurchflusszellen	Translume	Custom	Klare Durchflusskanäle für die Bildgebung (Abb. 2E)
Glaskleber	Loctite	233841	Verbindet Nanoport-Baugruppen sicher und einfach mit Glasdurchflusszellen
Glas/PDMS-Sandwich-Durchflusszellen	CIDRA Präzisions-Dienstleistungen	Kundenspezifisches Design	Durchflusszellen, die nach Ihren Spezifikationen gebaut werden; die Bildkanäle sind klar (Abb. 2C)
Hamilton Reinigungslösung	Hamilton	18311	Schonende, aber effiziente Reinigungslösung für Glasdurchflusszellen; sprudelt bei vorsichtiger Anwendung nicht
Sutter	Sutter Instrument	Lamda DG4	Nicht mehr unterstützt, also weiterempfehlen Lambda 721
Beleuchtungssystem	Sutter Instrument	Lamda DG4	Nicht mehr unterstützt, also empfehlen Lambda 721
Bildanalysesoftware	Medienkybernetik	Image Pro Premiere	Analyse von Bildern und Einzelmolekülverfolgung
Bildanalysesoftware	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analyse von Bildern und Einzelmolekülverfolgung
Bild Anzeigekarte	Melles Griot	06 DLA 001	Alternativprodukt von Thorlabs: VRC5
Immersionsöl	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluoreszenzfrei
Laserstrahlausrichtungswerkzeuge	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Balken horizontal und in der richtigen Höhe sind
Laserstrahlbetrachter	Canadian Photonics Labs	IR 3150	Zur Abbildung von IR-Strahlflecken auf Spiegeln und  Zielen
Laserleistungsmesser	Thor Labs		Messung der Laserleistung sowie der Trap-Stärke
Laserschutzbrille (HeNe)	Thor Labs	LG7 oder 8	Blöcke >3 OD Einheiten Licht mit Wellenlängen >600 nm
Laserschutzbrille (IR)	Thor Labs	LG11	Blöcke >7 OD Einheiten Licht der Wellenlängen ³ 1000 nm
Mcherry  Fluoreszenzfilterwürfel	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Wird in Verbindung mit Lambda DG4 nur zur Abbildung von mcherry verwendet
Mikroskop	Leica	DMIRE2	DIC-Anschluss wurde entfernt, um dichroitische Fallen-/Ausrichtungsspiegel aufzunehmen
Mikroskopsteuerungssoftware	UCSF/Shareware	uManager	Steuert das Mikroskop, ermöglicht die fokale Ausrichtung von Objektiven sowie die Tischsteuerung
Nanoport-Montage	IDEX	N333	Steckverbinder, die mit Durchflusszellen verbunden sind
Optische Tischhalterung	Thor Labs	PA52502	Aktive Isolationstischhalterung
Optiken und Objektive	Solar TII	Verschiedenes	Interferenzspiegel, Teleskope und Linsen speziell für das System
PDMS-Durchflusszellen	ufluidix	Custom	Flow-Zellen, die nach Ihren Spezifikationen gebaut werden; die Bildkanäle sind klar (Abb. 2B und D)
PEEK-Schlauch	IDEX	1532	Bietet eine hervorragende Verbindung zu Durchflusszellen und Schaltventilen
Pinkel Fluoreszenzfilterwürfel	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Wird in Verbindung mit Lambda DG4 verwendet, um mehrere Fluorophore schnell abzubilden
Einpress-Schlauchverbinder	GraceBio	46003	Transparenter Silikonverbinder mit Klebstoff, der sich gut an Glas bindet
Scanning-Spiegel	GSI Lumonics	VM500	Wird zur Steuerung der zweiten optischen Falle verwendet. GSI Lumonics existiert nicht mehr. Ähnliche Spiegel können bei Cambridge Scientific Stage erworben werden
	Leica
Tischmikrometer	Elektronenmikroskopie Sciences	68042-08	Bietet auf dem Bildschirm ein Lineal zur Positionierung des Strahls und zur Systemkalibrierung
Schaltventile	IDEX	V-101T	Steuert die Richtung des Flüssigkeitsflusses und verhindert das Einbringen von Blasen in die Durchflusszellen
Spritze und Ventilverteiler	Maschinenwerkstatt	Keine	Sonderanfertigung
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	PHD 2000	Steuert den Flüssigkeitsfluss durch Durchflusszellen
Software für die Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	70-6000	Durchflussregelung ermöglicht eine nahtlose, programmierbare Steuerung des Flüssigkeitsflusses
	Spritzen Hamilton	81320	Gasdichter PTFE-Luer-Lock, Glaszylinder mit Teflonbeschichtete Stößel
Tischplatte	Thor Labs	T36H	Optische Tischplatte oder Steckbrett
Fallenlaser	Newport/Spectra Physics	J-Serie; BL106C	Nd:YAG-Laser; 1064 nm; 5-W-Laser