Summary
Das Protokoll zeigt, dass es durch die Durchführung einer Mikrotransplantation synaptischer Membranen in Xenopus laevis-Eizellen möglich ist, konsistente und zuverlässige Reaktionen von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure- und γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren aufzuzeichnen.
Abstract
Erregende und inhibitorische ionotrope Rezeptoren sind die Haupttore der Ionenflüsse, die die Aktivität von Synapsen während der physiologischen neuronalen Kommunikation bestimmen. Daher wurden Veränderungen in ihrer Häufigkeit, Funktion und Beziehung zu anderen synaptischen Elementen als ein Hauptkorrelat von Veränderungen der Gehirnfunktion und kognitiven Beeinträchtigungen bei neurodegenerativen Erkrankungen und psychischen Störungen beobachtet. Zu verstehen, wie die Funktion von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Rezeptoren durch Krankheit verändert wird, ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung wirksamer Therapien. Um krankheitsrelevante Informationen zu gewinnen, ist es wichtig, die elektrische Aktivität von Neurotransmitterrezeptoren aufzuzeichnen, die im erkrankten menschlichen Gehirn funktionsfähig bleiben. Bisher ist dies der nächstliegende Ansatz, um pathologische Veränderungen in der Funktion von Rezeptoren zu beurteilen. In dieser Arbeit wird eine Methodik vorgestellt, um eine Mikrotransplantation von synaptischen Membranen durchzuführen, die darin besteht, synaptische Membranen aus eingefrorenem menschlichem Hirngewebe, das menschliche Rezeptoren enthält, durch Injektion und posteriore Fusion in die Membran von Xenopus laevis-Eizellen zu reaktivieren. Das Protokoll bietet auch die methodische Strategie, um konsistente und zuverlässige Antworten auf α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) und γ-Aminobuttersäure (GABA) -Rezeptoren zu erhalten, sowie neuartige detaillierte Methoden, die für die Normalisierung und rigorose Datenanalyse verwendet werden.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen betreffen einen großen Prozentsatz der Bevölkerung. Obwohl ihre verheerenden Folgen bekannt sind, ist der Zusammenhang zwischen den funktionellen Veränderungen der Neurotransmitterrezeptoren, die für die Gehirnfunktion entscheidend sind, und ihrer Symptomatologie noch wenig verstanden. Interindividuelle Variabilität, chronische Natur der Krankheit und schleichendes Auftreten von Symptomen sind nur einige der Gründe, die das Verständnis der vielen Gehirnstörungen verzögert haben, bei denen chemische Ungleichgewichte gut dokumentiert sind 1,2. Tiermodelle haben unschätzbare Informationen generiert und unser Wissen über die Mechanismen, die der Physiologie und Pathophysiologie in evolutionär konservierten Systemen zugrunde liegen, erweitert; Mehrere Interspeziesunterschiede zwischen Nagetieren und Menschen schließen jedoch die direkte Extrapolation der Rezeptorfunktion aus Tiermodellen auf das menschliche Gehirnaus 3 aus. Daher wurden erste Bemühungen, native menschliche Rezeptoren zu untersuchen, vom Labor von Ricardo Miledi mit chirurgisch entferntem Gewebe und gefrorenen Proben entwickelt. Diese ersten Experimente verwendeten ganze Membranen, die neuronale synaptische und extrasynaptische Rezeptoren sowie nicht-neuronale Neurotransmitterrezeptoren enthalten, und obwohl sie wichtige Informationen über erkrankte Zustände liefern, besteht die Sorge, dass die Mischung der Rezeptoren die Interpretation der Daten 4,5,6,7 erschwert. Wichtig ist, dass Synapsen das Hauptziel bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen sind 8,9; Daher sind Assays zum Testen der funktionellen Eigenschaften betroffener Synapsen von grundlegender Bedeutung, um Informationen über krankheitsrelevante Veränderungen zu erhalten, die die synaptische Kommunikation beeinflussen. Hier wird eine Modifikation der ursprünglichen Methode beschrieben: Mikrotransplantation synaptischer Membranen (MSM), die sich auf die physiologische Charakterisierung angereicherter synaptischer Proteinpräparate konzentriert und erfolgreich zur Untersuchung von Ratten- und Humansynaptosomen angewendet wurde 10,11,12,13,14,15 . Mit dieser Methodik ist es möglich, synaptische Rezeptoren, die einst im menschlichen Gehirn arbeiteten, zu transplantieren, eingebettet in ihre eigenen nativen Lipide und mit ihrer eigenen Kohorte assoziierter Proteine. Da MSM-Daten quantitativ sind, ist es außerdem möglich, diese Daten für die Integration in große Proteomik- oder Sequenzierungsdatensätze10 zu verwenden.
Es ist wichtig zu beachten, dass viele pharmakologische und biophysikalische Analysen von synaptischen Rezeptoren an rekombinanten Proteinendurchgeführt werden 16,17. Während dieser Ansatz einen besseren Einblick in die Struktur-Funktions-Beziehungen von Rezeptoren bietet, kann er keine Informationen über komplexe multimere Rezeptorkomplexe in Neuronen und deren Krankheitsveränderungen liefern. Daher sollte eine Kombination aus nativen und rekombinanten Proteinen eine umfassendere Analyse der synaptischen Rezeptoren ermöglichen.
Es gibt viele Methoden, um Synaptosomen 10,11,12,13,14,15 herzustellen, die an die Anforderungen eines Labors angepasst werden können. Das Protokoll beginnt mit der Annahme, dass synaptosomal angereicherte Präparate isoliert wurden und bereit sind, für Mikrotransplantationsexperimente verarbeitet zu werden. Im Labor wird die Syn-Per-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers angewendet. Dies geschieht aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit in elektrophysiologischen Experimenten10,11. Es gibt auch reichlich Literatur, die erklärt, wie man Xenopus-Eizellen 18,19 isoliert, die auch injektionsfertigerworben werden können 20.
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Protocol
Alle Forschungsarbeiten werden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom institutionellen Animal Care and Use Committee der University of California Irvine (IACUC-1998-1388) und der University of Texas Medical Branch (IACUC-1803024) genehmigt. Der temporale Kortex aus einem Nicht-Alzheimer-Gehirn (AD) (weiblich, 74 Jahre alt, postmortales Intervall 2,8 h) und einem AD-Gehirn (weiblich, 74 Jahre alt, postmortales Intervall 4,5 h) wurde vom Alzheimer-Forschungszentrum der University of California Irvine (UCI-ADRC) bereitgestellt. Die Einwilligung nach Aufklärung zur Gehirnspende wurde von UCI-ADRC eingeholt.
HINWEIS: Nicht fixiertes menschliches Hirngewebe sollte als Quelle für durch Blut übertragene Krankheitserreger (BBP) behandelt werden. Dementsprechend ist vor Beginn der Experimente ein BBP-Training erforderlich. Dieses Protokoll wird in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) gemäß BSL2-Anforderungen durchgeführt. Zu den Richtlinien und Vorsichtsmaßnahmen im Labor gehören: keine Speisen oder Getränke im Labor erlaubt, gute Laborpraktiken müssen befolgt werden, persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, keine offenen Schuhe) ist erforderlich und die Tür muss jederzeit geschlossen sein.
1. Xenopus-Eizell-Mikroinjektionspräparat
- Um Injektionsnadeln herzustellen, ziehen Sie 3,5 Zoll Borosilikatröhrchen mit einem Mikropipettenabzieher. Sobald die Mikroinjektionsnadeln gezogen sind, verwenden Sie ein Mikroskop und eine Rasierklinge, um genug von der Nadelspitze abzuschneiden, so dass eine Mikroinjektion durchgeführt werden kann (normalerweise zwischen 2-3 mm).
HINWEIS: Die Länge der zu schneidenden Nadelspitze kann variieren. - Bereiten Sie 1x Barths Lösung vor, indem Sie 200 ml Barths Stammlösung (5x) zu 800 ml destilliertem Wasser hinzufügen. Füllen Sie eine 24-Well-Flachboden-Gewebekulturplatte mit 18 °C 1x Barth-Lösung.
- Bereiten Sie 5x Barths Lagerlösung wie folgt vor. In 1 l destilliertem Wasser werden 25,71 g NaCl (Natriumchlorid), 0,372 g KCl (Kaliumchlorid), 0,301 g CaCl2 (Calciumdichlorid), 0,389 g Ca(NO 3)2(4H2O) (Calciumnitrattetrahydrat), 1,01 g MgSO4(7H2O) (Magnesiumsulfat-Heptahydrat), 1,008 g NaHCO 3 (Natriumbicarbonat), und 11,91 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure).
- Isolieren Sie Xenopus-Eizellen unter Verwendung der in18,19 beschriebenen Protokolle und mit einem 2x vergrößerten Stereoskop, wobei Sie gesund aussehende V-VI-Eizellen auswählen. Legen Sie etwa 10 Eizellen pro Vertiefung und verwenden Sie eine der Vertiefungen, um nicht injizierte Eizellen unterzubringen, die bei der Durchführung von Aufzeichnungen als Kontrollzellen verwendet werden.
- Holen Sie sich eine kleine Petrischale, 1 cm hoch und 6 cm im Durchmesser, und legen Sie Nylongewebe hinein, so dass es den Boden der Schale bedeckt. Gießen Sie dann 15 ml 1x Barth-Lösung, die für die Durchführung von Mikroinjektionen der Eizellen verwendet wird.
- Platzieren Sie einen Nanoinjektor entlang der Mittellinie der Mikroskopplattform. Drehen Sie den Magneten in die Aus-Position und bewegen Sie den Nanoinjektor langsam in die gewünschte Position, während Sie ihn vorsichtig unterstützen. Wenn der Nanoinjektor richtig positioniert ist, drehen Sie den Magneten wieder in die Position " Voll Ein" und stellen Sie sicher, dass er sicher ist.
- Für eine Probengröße von 50,6 nL verwenden Sie die folgenden Einstellungen an der Seite des Nanoinjektors: 1 ist D (unten), 2 ist D, 3 ist U (oben), 4 ist D und 5 ist U. Positionieren Sie ein Stück selbstdichtenden Thermoplast oder eine Mikrozentrifugenröhrenkappe auf dem Mikroskopständer und richten Sie es an der Flugbahn des Nanoinjektors aus.
HINWEIS: 50 nL ist in der Nähe der maximalen Menge an injiziertem Material, der das Zytoplasma21 standhalten kann. - Füllen Sie eine Insulinspritze etwa die Hälfte ihres Volumens mit Mineralöl (ca. 0,5 ml/cc). Mit dieser Spritze füllen Sie die Mikroinjektionsnadel mit Mineralöl. Stellen Sie sicher, dass eine sichtbare Ölperle an der Spitze der Nadel zu sehen ist.
- Setzen Sie den Nanoinjektorkolben mindestens 1-2 cm aus. Halten Sie dazu die EMPTY-Taste gedrückt, bis der Kolben in der gewünschten Länge sichtbar ist. Sobald der Kolben freigelegt ist, legen Sie langsam und vorsichtig die mit Mineralöl gefüllte Mikroinjektions-Glasnadel auf den Nanoinjektorkolben und stellen Sie sicher, dass sie gut durch den schwarzen Widerstands-O-Ring passt und am weißen Widerstandsring anhält. Achten Sie darauf, den Nanoinjektorkolben dabei nicht zu verbiegen.
- Sobald die Mikroinjektions-Glasnadel sicher und an Ort und Stelle ist, drücken Sie LEER , um mögliche Luftblasen zu entleeren. Reinigen Sie vorsichtig mit einem Papiertuch das überschüssige Mineralöl.
2. Laden der Probe
- Bereiten Sie synaptosomal angereicherte Präparate (Proben) aus der interessierenden Region des menschlichen Gehirns vor, wie in 10,11,12,13,14,15 beschrieben, und lagern Sie sie in Aliquots von etwa 5 μL bei -80 °C bis zum Zeitpunkt der Injektion.
- Übertragen Sie das Aliquot vor der Injektion auf nasses Eis und halten Sie es jederzeit auf Eis, mit Ausnahme der Beschallung und des Abrufens. Die Anzahl und Art der Proben wird durch das Versuchsdesign bestimmt.
- Beschallen Sie die ausgewählten Proben 3x in einem Bad mit schwimmendem Nasseis, um ein Aufwärmen der Probe zu vermeiden. Verwenden Sie jedes Mal 5 Zyklen und warten Sie 1 Minute auf nassem Eis zwischen den Zyklen.
- 1 μL Probe auf den Thermoplast geben. Nehmen Sie bei Bedarf vor der Platzierung der Probe eine Einkerbung in der Oberfläche vor, um eine Bewegung der Probe zu verhindern.
- Verwenden Sie die Knöpfe des Manipulators, der den Nanoinjektor hält, um die Nadel zu positionieren und in Richtung der zu füllenden Probe zu bewegen. Sobald sich die Nadelspitze in der Probe befindet, halten Sie die FILL-Taste gedrückt, bis genügend Probe aufgenommen ist. Etwa 0,5 μL werden für 10 Eizellen benötigt. Bewegen Sie die Nadel des Nanoinjektors mit den Knöpfen zurück in die höchste Position.
3. Injektion der Eizellen
HINWEIS: Standardisierte synaptosomale Membranen des Rattenkortex werden in allen Experimenten auch in eine Reihe von Eizellen injiziert, um Veränderungen der Fusionskapazität zwischen verschiedenen Chargen von Eizellen zu messen.
- Legen Sie ausgewählte Eizellen auf die kleine Petrischale mit dem angepassten Nylonnetz und Barths Lösung (ca. 10 Eizellen). Ordnen Sie Eizellen so an, dass sie nicht übereinander liegen; Dies wird während des Injektionsprozesses hilfreich sein.
- Bewegen Sie die Nadel mit den Knöpfen des Manipulators, der den Nanoinjektor hält, in Richtung der Eizellen. Sobald die Nadel in die Barth-Lösung eingetaucht ist, verwenden Sie das Fußpedal für den Nanoinjektor, um sicherzustellen, dass die Mikroinjektionsnadel die Probe freigibt. Wenn die Probe freigegeben wird, ist sie aus der Mikroskopansicht sichtbar.
- Sobald feststeht, dass die Probe freigegeben wird, fahren Sie mit der Mikroinjektion der Eizelle fort. Wenn die Probe nicht freigegeben wird, wiederholen Sie den Vorgang des Füllens der Nadel.
- Dringen Sie mit der Nadel in die Eizelle direkt unter der Oberfläche ein, nicht tiefer, und verwenden Sie das Fußpedal, um die Probe zu injizieren. Das Fußpedal gibt einen Signalton von sich, wenn das Sample freigegeben wird. Warten Sie ca. 2-3 s. Wenn die Injektion erfolgreich war, dehnt sich die Zelle aus. Sobald dies geschieht, verwenden Sie die Knöpfe am Manipulator, um die Zelle zu verlassen.
HINWEIS: Die Fusion von Membranen in der Eizelle ist ein polarisierter Prozess; Daher sollte die Eizelle in die Tierseite der Zelle, vorzugsweise über dem Äquator, mit dem Winkel der Nadel zur Tierseite injiziert werden, um die Membranfusion zu maximieren. - Bewegen Sie die Petrischale so, dass die nächste Eizelle mit der Nadel ausgerichtet ist, und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Eizellen in der Schale injiziert wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Eizellen injiziert wurde. Stellen Sie sicher, dass eine Zelle der Eizellen nicht injiziert bleibt, um als Kontrolle verwendet zu werden.
- Sobald alle Eizellen injiziert wurden, ziehen Sie den Nanoinjektor in seine ursprüngliche Position zurück und entfernen Sie die Nadel.
4. Aufzeichnung von Ionenströmen mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme
- Um zwei Elektrodenspannungsklemmen (TEVC) Elektrodennadeln herzustellen, ziehen Sie 15 cm lange feuerpolierte Borosilikatglasröhren mit dem Mikropipettenzieher. Sobald das Ziehen abgeschlossen ist, füllen Sie mit langen Kapillarnadeln mit 3 M KCl oder tauchen Sie die Nadeln alternativ ein und kochen Sie sie in 3 M KCl-Lösung für 15 Minuten unter einem kontinuierlichen Vakuum. Die hohe Temperatur hilft beim Befüllen der Elektroden und beim Entfernen von Luftblasen.
- Bereiten Sie eine 3 M KCl-Elektrodenfülllösung vor, indem Sie KCl in kristalliner Form und deionisiertem Wasser verwenden, und befolgen Sie diese Schritte sorgfältig, damit das Referenzpotential der Elektroden nicht verändert wird. Trocknen Sie den KCl vorsichtig in einem Ofen für 2-3 h. Mit einer Analysenwaage 223,68 g KCl vorsichtig wiegen. Den KCl in eine 1 L Glasflasche geben. Verwenden Sie diese Lösung, um Silberelektrodendrähte zu chlorieren.
HINWEIS: Zum Ziehen von Glaselektroden kann das Pipettenkochbuch hier heruntergeladen werden: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
- Bereiten Sie eine 3 M KCl-Elektrodenfülllösung vor, indem Sie KCl in kristalliner Form und deionisiertem Wasser verwenden, und befolgen Sie diese Schritte sorgfältig, damit das Referenzpotential der Elektroden nicht verändert wird. Trocknen Sie den KCl vorsichtig in einem Ofen für 2-3 h. Mit einer Analysenwaage 223,68 g KCl vorsichtig wiegen. Den KCl in eine 1 L Glasflasche geben. Verwenden Sie diese Lösung, um Silberelektrodendrähte zu chlorieren.
- Schalten Sie alle Geräte ein, die für die Aufzeichnung von Ionenströmen verwendet werden: Hauptsysteme, Lösungsventile, Mikroskoplicht, Ventilsysteme, Eizellklemme und Vakuumsystem. Schalten Sie den Desktopcomputer ein, melden Sie sich bei WinEDR V3.9.1. an und stellen Sie sicher, dass das Programm ausgeführt wird und dass die Setup-Werte wie folgt korrekt sind: Aufzeichnen auf Festplatte, Aufzeichnungsdauer festlegen und Simulatoroption deaktivieren.
- Geben Sie die folgenden Ersteinrichtungswerte für den Verstärker an: Schalten Sie für den Abschnitt "Spannungselektrode" (Vm) die negative Kapazitätskompensation (-C) aus. Stellen Sie für den Abschnitt Badelektroden (Im) den Verstärkungswahlschalter (Bereich von 0,1 bis 10) auf 10 und den dreistufigen Kippschalter, der den Verstärkungsmultiplikator (x0.1, x1.0 und x10) auswählt, auf x1.0 ein. Die LED-Leuchten zeigen die Auswahl des Verstärkungsmultiplikators an. Schalten Sie für den Klemmabschnitt den Klemmmoduswähler aus, stellen Sie den DC-Verstärkungsregler auf IN und den Verstärkungsregler mit voller Bandbreite (Bereich 0 bis 2000) auf etwa 1200 ein. für Befehle auf 40 mV einstellen und die Halteregler negativ und Skalenmultiplikator auf x2 einstellen; Verwenden Sie für die Stromelektrode den Ve-Offset, um eine Nullreferenz herzustellen, bevor Sie die Eizelle aufspießen.
- Öffnen Sie zum Aufzeichnen die WinEDR V3.9.1-Software, gehen Sie zum oberen Menü und wählen Sie Datei > Neue Datei öffnen. Erstellen Sie Ihren eigenen Ordner und speichern Sie die Datei.
- Als nächstes wählen Sie im Hauptmenü Record > Record to Disk. Wenn sich die beiden Elektroden im Ooctyte befinden, schalten Sie den Klingelton im VC-8-Ventilregler ein und drehen Sie die Klemme im OC-725C-Verstärker auf Slow . Gehen Sie dann zurück zur WinEDR-Software und wählen Sie oben links auf dem Bildschirm Record (Aufzeichnen ) aus.
- Notieren Sie sich im Markierungsdiagramm unten links Ihr anfängliches Membranpotential und drücken Sie die Eingabetaste. Während das Experiment weitergeht, können Sie den Namen der verwendeten Medikamente aufschreiben. Wenn das Experiment beendet ist, wählen Sie oben links auf dem Bildschirm Stopp aus.
HINWEIS: Wir verwenden WinEDR- oder WinWCP-Software, um TEVC durchzuführen, da diese kostenlos und gut für Experimente geeignet sind, aber jede andere verfügbare Software kann verwendet werden.
- Stellen Sie alle Arzneimittellösungen zusammen, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind (z. B. GABA, Kainate), und bestätigen Sie, dass die Lösungsventile ordnungsgemäß funktionieren, indem Sie sie ein- und ausschalten und die Verschiebung der Quetschventile beobachten.
- Füllen Sie die Röhrchen, indem Sie die entsprechende Lösung auf den mit dem Schlauch verbundenen Spritzenbehälter gießen und den Ventilregler so kennzeichnen, dass er mit den Lösungsröhrchen korreliert. Stellen Sie sicher, dass der Lösungsfluss gleichmäßig ist, keine Blasen vorhanden sind und dass das Vakuumsystem ordnungsgemäß funktioniert.
- Richten Sie das Mikroskop und den Aufnahmekammerbereich ein. Platzieren Sie die Agarbrücken (siehe unten) in den jeweiligen kreisförmigen Löchern hinter der Aufnahmekammer (distal vom Handhabungsbereich) und verbinden Sie die Vertiefungen für die als Bodenreferenz verwendeten Elektroden mit der Aufnahmekammer. Fügen Sie Ringers Arbeitslösung (1x) der Aufnahmekammer und den Bodenreferenzelektrodenvertiefungen hinzu.
- Agarbrücken sind U-förmige Borosilikatrohre, 2-3 cm lang, gefüllt mit 3% Agar in Ringer-Lösung. Machen Sie U-förmige Röhrchen, indem Sie 15 cm lange Röhrchen schneiden, sie auf der offenen Flamme biegen und sie dann mit einer Insulinspritze mit heißem 3% Agar füllen. Lagern Sie gefüllte Agarbrücken in Ringers Lösung bis zur Verwendung im Kühlschrank.
- Machen Sie 20x Ringer's Stammlösung wie folgt: In 1 l destilliertem Wasser 134,4 g NaCl, 2,982 g KCl, 5,29 g CaCl 2 und 23,83 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure) hinzufügen. Für die Arbeitslösung von 1x Ringer fügen Sie in einem Messkolben 200 ml Stammlösung von Ringer (20x) zu 3.800 ml destilliertem Wasser hinzu.
- Bereiten Sie vor jedem Experiment durch Elektrolyse chlorierte Silberelektroden vor, indem Sie Silberdrähte in 3 M KCl-Lösung legen und die Silberelektrode an den Pluspol einer 9-V-Batterie anschließen. Nach ca. 3 min lagert sich eine feste braune Schicht AgCl in der Elektrode ab. Setzen Sie die chlorierten Silberelektrodendrähte in das Elektrodengehäuse ein.
HINWEIS: Bodenreferenz- und Aufzeichnungschlorelektroden sind Silber / Silberchlorid (Ag / AgCl) -Elektroden. - Entfernen Sie die Borosilikatnadeln aus der KCl-Lösung. Verwenden Sie eine Spritze, um eine kleine Menge KCl-Lösung aus dem offenen Ende der Elektrodennadel zu extrahieren und die KCl-Lösung durch Mineralöl zu ersetzen. Dadurch werden Wasserverdunstungen und Änderungen der KCl-Konzentration in der Nadel vermieden. Schieben Sie die Glasnadel über den chlorierten Silberelektrodendraht und ziehen Sie sie fest.
- Mit dem rechten und linken Manipulator, der die Elektroden hält, führen Sie die Elektrodennadeln in die Aufnahmekammer, die mit Ringer's Solution gefüllt ist.
- Überprüfen Sie den Widerstand jeder Elektrode, indem Sie die Vm- und Ve-Offset-Regler auf Null setzen und dann die Elektrodentesttasten drücken. Der Widerstand sollte zwischen 0,5-3 MΩ liegen (direkt als 5-30 mV im Bildschirm abgelesen). Wenn der Widerstand außerhalb des Bereichs liegt, ersetzen Sie ihn durch neue Mikroelektroden.
- Füllen Sie die Aufnahmekammer mit frischer Ringer-Lösung. Platzieren Sie mit einer Glaspipette eine nicht injizierte oder mikrotransplantierte Eizelle in der Mitte der Aufnahmekammer. Stellen Sie sicher, dass die Eizelle unter dem Mikroskop deutlich sichtbar ist, mit der Tierseite nach oben (siehe HINWEIS in Schritt 3.4).
- Führen Sie die Elektrode in die Lösung des Ringers, bis sie die Eizellmembran berühren. Durchbohren Sie vorsichtig die Eizellmembran auf der Tierseite (siehe HINWEIS in Schritt 3.4) mit beiden Elektroden und zeichnen Sie das ruhende Membranpotential auf. Aktivieren Sie den Lösungsfluss des Ringers.
- Ändern Sie mit dem Oozytenklemmverstärker den Modus auf Voltage Clamp und stellen Sie die Haltespannung von -80 mV ein. Der Strom auf dem Monitor sollte negativ sein, normalerweise zwischen 0 und 0,4 Mikroampere.
- Erstellen Sie eine neue Datei, um die Aufzeichnung als Datei > Neue > Speichern Sie die Aufzeichnung in der Software. Starten Sie die Aufnahme, drücken Sie Record > Record to Disk. Fügen Sie der Datei mithilfe des Markierungsfelddialogfelds relevante Informationen hinzu (Testname, verwendete Medikamente usw.).
- Wenden Sie Agonisten (z. B. GABA, Glutamat oder Kainate) zur chemischen Stimulation an, indem Sie die Ventile öffnen und sie für 15 s in die Aufnahmekammer perfundiert. Verwenden Sie normalerweise eine Verstärkung von 10x, um die maximale Anzahl von Punkten darzustellen und die Antwort zu rekonstruieren. Wenn die Ströme sehr klein sind, erhöhen Sie die Verstärkung oder den Gewinn, damit sie ausgewertet und sichtbar sind. Notieren Sie sich diese Änderungen immer.
HINWEIS: Die Dauer der Perfusion hängt vom experimentellen Paradigma ab. Wenn das Hauptziel darin besteht, die maximale Amplitude zu messen, reichen 15 s aus, um den Höhepunkt für GABA oder das Plateau für Kainate zu erreichen. - Überwachen Sie immer die Lösungsebenen. Die Lösung von Ringer muss häufig nachgefüllt werden, da sie zwischen allen Lösungsverwendungen verwendet wird. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, drehen Sie die Spannungsklemme in die OFF-Position und schalten Sie das Lösungsventil des Ringers aus. Entfernen Sie die Eizelle. Beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Datei. Wiederholen Sie diese Schritte für alle injizierten Eizellen.
5. Analyse von TEVC-Aufnahmen
- Speichern Sie eine Kopie der Aufnahmen auf einem USB-Laufwerk. Von dort aus öffnen Sie die gewünschte Datei, die analysiert werden soll. In der sich öffnenden Datei kann die Aufzeichnung angezeigt, markiert und gemessen werden. Die gebräuchlichste Analyse umfasst die Messung der maximalen Amplitude, der Aktivierungszeit, der Desensibilisierung und des Rundowns von sich wiederholenden Anwendungen.
- Messen Sie die maximale AMPA-Reaktion und die GABA-Spitzenantwort. Um diese Messungen zu erfassen, legen Sie zunächst einen Nullpegel oder eine Basislinie fest, indem Sie die rote Linie mit dem Cursor suchen und auf den von der Ringer-Anwendung oder Baseline generierten Strom ziehen.
- Sobald der Nullwert festgelegt ist, bestimmen Sie die Antwortmessungen, indem Sie den grünen, vertikalen Auslesecursor mit der Maus auf den gewünschten Teil des Graph-Tracers ziehen. Exportieren Sie bei Bedarf die zu analysierenden Spuren in eine andere bevorzugte Software
HINWEIS: Wenn der Nullpegel nicht definiert werden kann oder zu viel Rauschen auf dem Tracer angezeigt wird, exportieren Sie die WinEDR-Datei in eine Offline-Analysesoftware, die Änderungen zur Bereitstellung einer Pegelbasislinie und das Hinzufügen von Filtern zur Reduzierung des Rauschens ermöglicht.
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Representative Results
Innerhalb weniger Stunden nach der Injektion beginnen die synaptischen Membranen, die ihre Neurotransmitterrezeptoren und Ionenkanäle tragen, mit der Plasmamembran der Eizelle zu verschmelzen. Abbildung 1 zeigt Aufzeichnungen von AMPA- und GABA-A-Rezeptoren, die in Xenopus-Eizellen mikrotransplantiert wurden. Für den größten Teil der Analyse wurden die Reaktionen von zwei oder drei Eizellen pro Probe mit zwei oder drei Chargen von Eizellen aus verschiedenen Fröschen gemessen, was insgesamt sechs bis neun Eizellen pro Probe ergibt. Dies geschieht für eine große Kohorte menschlicher Probanden, um Gruppenunterschiede zu beobachten. Die Analyse ist unkompliziert und misst die Amplitude der Antworten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Fusion der transplantierten Membranen ein polarisierter Prozess ist, daher ist die Auswahl der Injektionsstelle sehr wichtig. Die Injektion in die pflanzliche Hemisphäre oder in den Äquator führt zu konsistenten Ergebnissen, wobei alle injizierten Eizellen erfolgreich Rezeptoren einführen und Ionenströme erzeugen, die einer unimodalen Verteilung folgen22. Interessanterweise folgten die Eizellenreaktionen, als die Membranen ursprünglich in den Tierpol injiziert wurden, einer bimodalen Verteilung: Eine Gruppe von Eizellen hatte keine oder sehr niedrige Reaktionen, während die andere Gruppe große Reaktionen aufwies, die sogar größer waren als die von Eizellen, die in den Pflanzenpol oder in den Äquator injiziert wurden. Um festzustellen, ob einige der Eizellen, die in den Tierpol injiziert wurden, geringe Reaktionen hatten, weil die menschlichen Membranen injiziert und im Kern der Eizelle eingeschlossen wurden, wurde eine Mischung aus Membranen, die aus dem elektrischen Organ von Torpedo isoliert wurden, und cDNA, die für die GABAρ1-Untereinheit kodieren, in den Pol der Tierseite injiziert. Die Nikotinrezeptoren aus den Torpedomembranen zeigten eine schnelle Aktivierung und schnelle Desensibilisierung während der Perfusion von Acetylcholin 23, während die ρ1-Untereinheit homomere GABAρ1-Rezeptoren bildet, die während der kontinuierlichen Perfusion von GABA 24,25,26,27 nicht desensibilisieren. Wenn die co-injizierte Probe versehentlich in den Zellkern und nicht in das Zytoplasma abgegeben wurde, würde die cDNA in RNA transkribiert und in funktionelle GABAρ1-Rezeptoren übersetzt. Abbildung 2 zeigt, dass, wenn die Injektion auf den Zellkern gerichtet war, Eizellen mit hohen Reaktionen auf Acetylcholin keine GABAρ1-Rezeptoren exprimierten; Umgekehrt exprimierten Eizellen mit null oder geringer Reaktion auf Acetylcholin GABA-Rezeptoren. Die Ergebnisse dieses Experiments deuten erstens darauf hin, dass sich bei Eizellen mit geringer Reaktion Membranen versehentlich im Zellkern der Eizelle ablagerten; Zweitens stört die Injektion von Torpedomembranen in den Kern die Transkription von ρ1 cDNA nicht wesentlich. Einige co-injizierte Eizellen hatten große Reaktionen sowohl auf Acetylcholin als auch auf GABA, was auf eine Ruptur des Kerns während der Injektion hindeutet. Die verstärkte Insertion von transplantierten Membranen in die tierische Hemisphäre der Eizelle spiegelt die polarisierte Lokalisation der heterologen exprimierten Neurotransmitterrezeptoren wider 26,28. Daher ist es durch Injektion in die tierische Hemisphäre, ohne auf den Kern abzuzielen, möglich, größere Reaktionen zu erhalten. Dies ist wichtig, um Proben mit geringer Dichte an Rezeptoren zu untersuchen, zum Beispiel aus Alzheimer-Gewebe (AD) mit geringer Anzahl von Rezeptoren (Abbildung 3).
Abbildung 1: Repräsentative Ionenströme von Eizellen. Ionenströme von Eizellen, denen Membranen von menschlichen synaptischen Rezeptoren injiziert wurden, wurden aufgezeichnet. AMPA-Rezeptoren wurden mit 100 mM Kainate und GABA-A-Rezeptoren mit 1 mM GABA aktiviert. VH = -80 mV. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Koinjektion von Torpedo und GABAρ1. Die gemeinsame Injektion von gefilterten Membranen (0,1 μm) aus dem elektrischen Organ von Torpedo, das reich an Acetylcholinrezeptoren ist, und cDNA, die für den GABAρ1-Rezeptor kodieren, in den Tierpol erzeugte hauptsächlich zwei Gruppen von Eizellen basierend auf ihren Reaktionen: Eine Gruppe von Eizellen (A) hatte große Reaktionen auf Acetylcholin (Ach; 1 mM), aber keine Reaktionen auf 1 μM GABA (Spannung auf -80 mV geklemmt), und Eizellen in Gruppe (B) hatten null oder niedrige Reaktionen auf ACh, aber große Reaktionen auf GABA. (C) Das Diagramm zeigt den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) des Spitzenstroms in Gruppe 1 (n = 5 Eizellen) und Gruppe 2 (n = 11 Eizellen). Eine Eizelle in Gruppe 2 hatte große GABA- und ACh-Reaktionen, was auf eine Ruptur des Kerns hindeutet; Folglich war die Verteilung der Antworten auf niedrige Werte verzerrt, wie die Differenz zwischen Mittelwert und Median der Verteilung des Membranstroms (22 nA vs. 6 nA) zeigt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine der Ursachen für Eizellen mit geringer Reaktion darin besteht, dass die Membranen injiziert und in den Zellkern der Eizelle eingeschlossen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Polarisiertes Einfügen von Zellmembranen in Xenopus-Eizellen. GABA- und Kainate-Reaktionen von Eizellen, die in die tierischen oder pflanzlichen Pole injiziert wurden, mit ungefilterten Membranen, die aus einem Nicht-AD-Gehirn (weiblich, 74 Jahre alt, postmortales Intervall 2,8 h) und einem AD-Gehirn (weiblich, 74 Jahre alt, postmortales Intervall 4,5 h) erhalten wurden. Eizellen, die in der Nähe des Tierpols injiziert wurden, ohne auf den Kern abzuzielen, gaben größere Reaktionen als Eizellen, die in den Pflanzenpol injiziert wurden, was die Untersuchung von Gewebeproben mit einer sehr geringen Anzahl von Rezeptoren ermöglichte. Schüler-t-Test zwischen pflanzlichen und tierischen Polen: ** p < 0,01, *** p < 0,001, Balken geben den Mittelwert ± SEM Spitzenstrom an, n = 5 Eizellen pro Spalte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Analyse nativer Proteinkomplexe aus dem menschlichen Gehirn ist erforderlich, um homöostatische und pathologische Prozesse bei Hirnerkrankungen zu verstehen und therapeutische Strategien zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten zu entwickeln. So sind Gehirnbanken, die eingefrorene Proben enthalten, eine unschätzbare Quelle für einen großen und meist ungenutzten Reichtum physiologischer Informationen29,30. Ein erstes Anliegen bei der Verwendung von postmortalem Gewebe ist die klare Möglichkeit eines mRNA- oder Proteinabbaus, der die Interpretation der Daten durcheinander bringen könnte. Zum Beispiel zeigt der pH-Wert des Gehirns durchweg eine positive Korrelation mit der Quantifizierung von mRNA durch quantitative Real-Time-PCR, und diese Korrelation ist unabhängig von derPathologie 31. Unterschiede zwischen den Subjekten des pH-Werts können zu Unterschieden in der mRNA-Quantifizierung mit großen Varianzen führen, die die Interpretation der Ergebnisse verdeckenkönnen 32. Interessanterweise werden trotz der geringeren Quantifizierung von mRNA-Transkripten, wenn der pH-Wert ansäuert, die Kovarianzen zwischen den verschiedenen Transkriptenbeibehalten 33, was einen Rahmen für die Erzielung einer zuverlässigen Transkriptomprofilierung pathologischer Zustände bietet. Wichtig ist, dass, während mRNA stark abbaubar ist, Transmembranproteine im postmortalen Gewebe sehr resistent gegen den Abbausind 34. Frühere Experimente im Labor haben gezeigt, dass GABA- und Glutamatrezeptoren des menschlichen Gehirns nach extrem großen postmortalen Intervallenfunktionsfähig sind 35. Darüber hinaus ermöglicht die MSM-Methode die direkte Messung der Auswirkungen potenzieller Störfaktoren wie pH-Wert zum Zeitpunkt des Todes, Agonalzustand und mRNA- und Proteinabbau direkt auf die Funktion von Rezeptoren und bietet so Möglichkeiten, diese Informationen bei der Analyse und Interpretation von Daten zu verwenden.
Modifikationen und Fehlerbehebung der Technik
Wie bereits erwähnt, ist das MSM eine leichte Modifikation der ursprünglichen Transplantation von Totalmembranen, eine Methode, die von vielen Labors in Akademikern und der pharmazeutischen Industrie weitgehend validiert und bestätigt wurde 12,36,37,38,39,40. Zum Beispiel war die Mikrotransplantation von Rezeptoren wichtig bei der Entwicklung von Eli Lillys LY3130481, einem TARP-gamma-8-selektiven Antagonisten von AMPA-Rezeptoren, der die Selektivität der Gehirnregion zeigt12. MSM folgt dem gleichen Mikrotransplantationsprinzip unter Verwendung von synaptosomal angereicherten Präparaten; Daher ist es wichtig, gute synaptosomale Präparate zu haben. Wir verwenden die Syn-Per-Methode, weil die Ergebnisse, die mit diesem Verfahren erzielt werden, sehr konsistent sind und die Amplitude der Ionenströme sehr gut mit den Spiegeln synaptischer Proteine in proteomischen Experimentenkorreliert 10. Die Mikrotransplantation oder das MSM kann jedoch angepasst werden, um Rezeptoren aus vielen Quellen (z. B. Insektenmembranen38,39, Neurolemma40) mit hervorragenden Ergebnissen zu untersuchen. Es gibt einige Erkrankungen, bei denen Synapsen stark betroffen sind, wie die Alzheimer-Krankheit, oder in geringen Mengen verfügbar sind; In diesem Fall hilft die Injektion der Membranen in die Tierseite, größere Ströme zu bekommen. Die Erhöhung der Menge des injizierten Proteins erhöht auch die Fusion der Membranen und die Größe der Reaktionen. Obwohl es eine negative Korrelation zwischen der Konzentration der injizierten Membranen und dem Überleben der Eizellen gibt, ist es möglich, eine geeignete Konzentration von Membranen zu finden, die die gegebene experimentelle Analyse ermöglicht.
Einschränkungen von MSM
Das MSM ist eine quantitative Methode, die für die Untersuchung menschlicher Rezeptoren oder Ionenkanäle entwickelt wurde; Daher ist es gut geeignet, Gewebe mit begrenzter Verfügbarkeit zu untersuchen. Da Xenopus-Eizellen keine endogenen Glutamat- oder GABA-Rezeptoren haben, kommt jede Reaktion auf GABA oder Glutamat in mikrotransplantierten Eizellen von den injizierten Rezeptoren, die mit der Membran der Eizellen verschmolzen sind. Eine wichtige Einschränkung von MSM ist jedoch die Untersuchung von Ionenkanälen oder Transportern, die auch in Eizellen endogen exprimiert werden, da die Trennung von Ionenströmen von mikrotransplantierten und endogenen Kanälen/Transportern schwierig ist. Zukünftige Studien, die endogene Gene zum Schweigen bringen, können bei dieser Einschränkung hilfreich sein.
Die Bedeutung bestehender Methoden besteht darin, dass MSM die native Membran mit ihren entsprechenden Proteinen und Rezeptoren einbezieht und somit eine physiologischere Umgebung für die Analyse bietet. Es wurde festgestellt, dass die Eigenschaften der Rezeptoren in ihrer nativen Membran nach der Transplantation in die Eizellen erhalten bleiben, wie sie in den Neurotransmitterrezeptoren AMPA-Typ GluR1, α7-AcChoRs und α4β2-AcChoRs aus kultivierten Zellen41 beobachtet wurden.
Zukünftige Anwendungen der Technik umfassen die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften verschiedener Proteine und Rezeptoren, die in den Membranen von kultivierten und nicht kultivierten Zellen und Geweben aus gesunden und kranken menschlichen Gehirnen von Interesse sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIA/NIH-Zuschüsse R01AG070255 und R01AG073133 an AL unterstützt. Wir danken auch dem Alzheimer-Forschungszentrum der University of California Irvine (UCI-ADRC) für die Bereitstellung des in diesem Manuskript gezeigten menschlichen Gewebes. Das UCI-ADRC wird durch den NIH/NIA-Zuschuss P30 AG066519 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
References
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