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Methodenartikel

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

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DOI:

10.3791/64028

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27. Juli 2022

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1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Magen-Darm-Trakt ist eines der empfindlichsten Organe für Verletzungen bei strahlentherapeutischen Krebsbehandlungen. Es ist gleichzeitig ein Organsystem mit einer der höchsten Regenerationskapazitäten nach solchen Beleidigungen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Untersuchung der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels.

Zusammenfassung

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, enthält jedoch mehrere Arten von terminal differenzierten Zellen, die durch die aktive Proliferation von Darmstammzellen am Boden von Darmkrypten erzeugt werden. Bei einer akuten Darmschädigung kommt es jedoch zu einem Zelltod dieser aktiven Darmstammzellen. Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs, die zwar therapeutisch wirksam ist, aber den Nebeneffekt hat, dass der aktive Stammzellpool erschöpft ist. In der Tat kommt es häufig zu einem gastrointestinalen Strahlensyndrom, während sie sich einer Strahlentherapie unterziehen, was zum Teil auf einen aktiven Stammzellabbau zurückzuführen ist. Der Verlust aktiver intestinaler Stammzellen in intestinalen Krypten aktiviert einen Pool von typischerweise ruhenden intestinalen Reservestammzellen und induziert eine Dedifferenzierung von sekretorischen und enterozytenartigen Vorläuferzellen. Ohne diese Zellen wäre das Darmepithel nicht in der Lage, sich von einer Strahlentherapie und anderen schweren Gewebeverletzungen zu erholen. Neue Fortschritte in der Abstammungsverfolgung ermöglichen es, die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration zu verfolgen und wurden erfolgreich eingesetzt, um dies im Darm zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zur Analyse von Zellen im Darmepithel der Maus nach Strahlenschädigung darzustellen.

Einleitung

Das menschliche Darmepithel würde ungefähr die Oberfläche eines halben Badmintonfeldes bedecken, wenn es vollständig flach platziert würde1. Stattdessen wird diese einzelne Zellschicht, die den Menschen vom Inhalt seines Darms trennt, zu einer Reihe von fingerartigen Fortsätzen, Zotten und Vertiefungen, Krypten, verdichtet, die die Oberfläche des Darms maximieren. Die Zellen des Epithels differenzieren sich entlang einer Krypten-Zotten-Achse. Die Zotten bestehen hauptsächlich aus nährstoffabsorbierenden Enterozyten, schleimabsondernden Becherzellen und den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, während die Krypten hauptsächlich aus Defensin-produzierenden Paneth-Zellen, aktiven und Reserve-Stammzellen sowie Vorläuferzellen bestehen 2,3,4,5. Darüber hinaus erzeugen die bidirektionale Kommunikation dieser Zellen mit den Stroma- und Immunzellen des darunter liegenden mesenchymalen Kompartiments und der Mikrobiota des Lumens ein komplexes Netzwerk von Interaktionen, das die Darmhomöostase aufrechterhält und für die Genesung nach Verletzungen entscheidend ist 6,7,8.

Das Darmepithel ist das sich am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im menschlichen Körper, mit einer Umsatzrate von 2-6 Tagen 9,10,11. Während der Homöostase teilen sich aktive Stammzellen an der Basis von Darmkrypten (kryptenbasensäulenförmige Zellen), die durch die Expression des Leucin-reichen, wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 5 (LGR5) gekennzeichnet sind, schnell und liefern Vorläuferzellen, die sich in alle anderen intestinalen Epithellinien differenzieren. Aufgrund ihrer hohen Mitoserate reagieren aktive Stammzellen und ihre unmittelbaren Vorläuferzellen jedoch besonders empfindlich auf Schäden durch Gammastrahlung und unterliegen nachBestrahlung einer Apoptose 5,12,13,14. Nach ihrem Verlust werden Reservestammzellen und Nicht-Stammzellen (Subpopulationen von Vorläuferzellen und einige terminal differenzierte Zellen) in Darmkrypten aktiviert und füllen das basale Kryptenkompartiment wieder auf, das dann Zellpopulationen der Zotten rekonstituieren und so das Darmepithel regenerieren kann15. Mehrere Forschungsgruppen haben gezeigt, dass Reservestammzellen (ruhende Stammzellen) in der Lage sind, die Regeneration nach dem Verlust aktiver Stammzellen zu unterstützen 13,16,17,18,19,20,21,22. Diese Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Polycomb-Komplex-Protein-1-Onkogens (Bmi1), des Maus-Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gens (mTert), der Hopfen-Homöobox (Hopx) und des Leucin-reichen Repeat-Protein-1-Gens (Lrig1) aus. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nicht-Stammzellen in der Lage sind, Darmkrypten bei einer Verletzung wieder aufzufüllen 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Vorläuferzellen von sekretorischen Zellen und Enterozyten bei einer Verletzung eine Dedifferenzierung erfahren, zu stammähnlichen Zellen zurückkehren und die Regeneration des Darmepithels unterstützen. Neuere Studien haben Zellen identifiziert, die mehrere Marker exprimieren, die die Fähigkeit besitzen, bei einer Verletzung stammähnliche Eigenschaften zu erwerben (z. B. DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Überraschenderweise zeigten Yu et al., dass auch reife Paneth-Zellen (LYZ+) zur Darmregeneration beitragen können37. Darüber hinaus führt die Bestrahlung nicht nur zur Apoptose von Darmepithelzellen und zur Störung der epithelialen Barrierefunktion, sondern auch zu einer Dysbiose der Darmflora, zur Aktivierung von Immunzellen und zur Initiierung einer entzündungsfördernden Reaktion sowie zur Aktivierung von mesenchymalen und stromalen Zellen38,39.

Gammastrahlung ist ein wertvolles therapeutisches Mittel in der Krebsbehandlung, insbesondere bei Darmtumoren40. Die Bestrahlung beeinträchtigt jedoch die Darmhomöostase erheblich, indem sie die Zellen schädigt, was zu Apoptose führt. Die Strahlenbelastung verursacht mehrere Störungen, die die Genesung eines Patienten verlangsamen, und ist gekennzeichnet durch Schleimhautverletzungen und Entzündungen in der akuten Phase und langfristig durch Durchfall, Inkontinenz, Blutungen und Bauchschmerzen. Diese Vielzahl von Erscheinungsformen wird als gastrointestinale Strahlentoxizität bezeichnet. Darüber hinaus kann sich das strahleninduzierte Fortschreiten der transmuralen Fibrose und/oder vaskulären Sklerose erst Jahre nach der Behandlung manifestieren38,41. Gleichzeitig mit der Verletzung selbst induziert die Strahlung in den Darmzellen eine Reparaturreaktion, die Signalwege aktiviert, die für die Initiierung und Orchestrierung der Regeneration verantwortlich sind42. Eine strahleninduzierte Dünndarmerkrankung kann durch eine Strahlentherapie des Beckens oder des Abdomens mit anderen Organen (wie Gebärmutterhals, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Rektum) verursacht werden41,43,44,45,46. Darmbestrahlungsschäden sind daher ein bedeutendes klinisches Problem, und ein besseres Verständnis der daraus resultierenden Pathophysiologie wird wahrscheinlich die Entwicklung von Interventionen zur Linderung der mit der Strahlentherapie verbundenen gastrointestinalen Komplikationen vorantreiben. Neben der Bestrahlung gibt es noch andere Techniken, die es ermöglichen, den regenerativen Zweck des Darmepithels zu untersuchen. Es wurden transgene und chemische Mausmodelle entwickelt, um Entzündungen und die anschließende Regeneration zu untersuchen47. Dextran-Natriumsulfat (DSS) induziert Entzündungen im Darm und führt zur Entwicklung von Merkmalen, die denen einer entzündlichen Darmerkrankung ähneln48. Eine Kombination der DSS-Behandlung mit dem prokarzinogenen Wirkstoff Azoxymethan (AOM) kann zur Entwicklung von Kolitis-assoziiertem Krebs führen48,49. Die Ischämie-Reperfusions-induzierte Schädigung ist eine weitere Methode, um das regenerative Potenzial des Darmepithels zu untersuchen. Diese Technik erfordert Erfahrung und chirurgische Kenntnisse50. Darüber hinaus verursachen die oben genannten Techniken andere Arten von Verletzungen als Strahlung und können dazu führen, dass andere Regenerationsmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind diese Modelle zeitaufwändig, während die Bestrahlungstechnik relativ kurz ist. In jüngster Zeit wurden In-vitro-Methoden unter Verwendung von Enteroiden und Kolonoiden, die aus dem Darm und dem Dickdarm erzeugt wurden, in Kombination mit Strahlenschäden eingesetzt, um die Mechanismen der Darmregeneration zu untersuchen51,52. Diese Techniken rekapitulieren jedoch nicht vollständig das Organ, das sie modellieren53,54.

Das vorgestellte Protokoll beinhaltet die Beschreibung eines murinen Modells der Gammastrahlenschädigung in Kombination mit einem genetischen Modell, das nach einer Tamoxifenbehandlung die Rückverfolgung von Abstammungslinien aus der Reservestammzellpopulation ermöglicht (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dieses Modell verwendet eine 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung, die eine ausreichend signifikante Darmschädigung induziert, um Reservestammzellen zu aktivieren, während gleichzeitig die anschließende Untersuchung der intestinalen Regenerationsfähigkeit innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung ermöglichtwird 55.

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Protokoll

Alle Mäuse wurden in der Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) der Stony Brook University untergebracht. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University genehmigte alle Studien und Verfahren mit Tierversuchen. Versuche mit Tieren wurden streng in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierhandhabungsprotokoll (IACUC #245094) durchgeführt.

ANMERKUNG: Die Mausstämme B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) und B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und gekreuzt, um Bmi1-Cre ER zu erhalten; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) Mäuse, wie zuvor beschrieben56,57,58.

1. Gehäuse von Bmi1-CRE ER; Rosa26 eYFP-Mäuse

  1. Halten Sie die Mäuse in einer Tieranlage bei einer Temperatur zwischen 68 und 72 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30 bis 70 % in einem 12 h / 12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Wasser und normalem Chow ad libitum.
  2. Vor den Experimenten werden die Genotypen der Mäuse mit einer Standard-PCR-Genotypisierungstechnik bestätigt57,58.

2. Vorbereitung der Tiere und Materialien

  1. Bringen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor jedem Experiment in den Versuchsraum, damit sich die Mäuse akklimatisieren können.
  2. Ordnen Sie Versuchs- und Kontrolltiere nach Geschlecht und Alter zu.
  3. Die Kontrolltiere werden einer Tamoxifen-induzierten Cre-vermittelten Rekombination, aber nicht einer Bestrahlung unterzogen (Scheinbehandlung, 0 Gy), wobei darauf geachtet wird, dass die Versuchstiere die Tamoxifen-Injektion erhalten und einer Gammabestrahlung ausgesetzt werden.
  4. Bereiten Sie die Tamoxifenlösung vor. Tamoxifenpulver in sterilem Maiskeimöl in einer Konzentration von 30 mg/ml resuspendieren. Beschallen Sie 3 Minuten lang in Zyklen von 30 s EIN und 30 s AUS mit 60 % Amplitude und drehen Sie dann 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Tamoxifen-Lösung kann bei −20 °C eingefroren werden, aber frieren/tauen Sie sie nicht mehr als einmal ein. Bereiten Sie vorzugsweise jedes Mal eine frische Lösung zu und lagern Sie sie nicht.
    HINWEIS: Tamoxifen ist lichtempfindlich. Wickeln Sie es während der Drehung bei Raumtemperatur mit Alufolie ein.
    ACHTUNG: Tamoxifen ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefahr (GHS08) und Umweltgefahr (GHS09).
  5. 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Stammlösung herstellen. Resuspendieren Sie EdU-Pulver in 1/5 des Gesamtvolumens an sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) und fügen Sie langsam die restlichen 4/5 des Gesamtvolumens des sterilen Reinstwassers hinzu. Nach vollständiger Auflösung aliquotieren und bei −20 °C lagern.
    ACHTUNG: 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind potenziell gefährliche Substanzen: Gesundheitsgefährdend (H340 und H631 bzw. H227, H315 und H319). EdU kann genetische Defekte verursachen und steht im Verdacht, die Fruchtbarkeit oder ungeborene Kinder zu schädigen, und DMSO kann Haut- und Augenreizungen verursachen.
  6. Bereiten Sie Reagenzien für die Gewebeentnahme und -fixierung vor: Verdünnen Sie Ethanol, um eine 70%ige Wasserlösung herzustellen, kühlen Sie DPBS auf 4 °C ab und bereiten Sie modifizierten Bouin-Fixierpuffer (50 % Ethanol und 5 % Essigsäure in destilliertemH2O) und 10 % gepuffertes Formalin vor.
    ACHTUNG: Ethylalkohol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H225-H319), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (GHS07). Essigsäure ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H226-H314), brennbar (GHS02) und ätzend (GHS05). Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.
  7. Bereiten Sie die für die Euthanasie erforderlichen Geräte nach einer zugelassenen Methode vor (z. B. CO2 -Kammer), ein Mäusepräparationsset (Schere, Pinzette), Petrischalen und eine 16-G-Sondennadel an einer 10-ml-Spritze zum Spülen des Darms und histologische Kassetten.

3. Ganzkörper-Gammabestrahlung (SHT) und Gewebeentnahme

  1. Zwei Tage vor der Gammabestrahlung injizieren Sie den Versuchstieren eine Einzeldosis Tamoxifen, um eine Cre-vermittelte Rekombination und BMI1/EYFP+ -Zelllinienverfolgung zu induzieren. Wiegen Sie jedes Tier und berechnen Sie eine Dosis von 40 mg/kg Körpergewicht von Tamoxifen, das in Maisöl resuspendiert wurde. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70%igem Ethanol und verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal mit einer 27G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist.
  2. Beobachten Sie die Tiere in den folgenden 48 Stunden, um eine mögliche Tamoxifen-Toxizität auszuschließen.
  3. Bringen Sie die Mäuse in den Bestrahlungsraum, wie von der örtlichen Einrichtung angegeben.
  4. Berechnen Sie die Bestrahlungszeit, die von der 137Cs-Quelle freigesetzt wird, entsprechend der aktuellen Exaktordosisleistung. Wenn z. B. die aktuelle Dosisleistung 75,9 rad/min (0,759 Gy min− 1 = 75,9 cGy m−1) beträgt, wird die Expositionszeit in Minuten als die gewünschte Dosis/0,759 berechnet. Um die Tiere mit einer Dosis von 12 Gy TBI zu bestrahlen, beträgt die Belichtungszeit ~15,81 min (15 min und 48 s).
  5. Desinfizieren Sie die Probenkammer im Gammastrahler mit 70%iger Ethanollösung. Legen Sie die absorbierende Matte und die Tiere in die Probenkammer.
    HINWEIS: Mit Scheinbehandlung behandelte Tiere sollten in den Bestrahlungsraum gebracht, aber nicht der Gammastrahlung ausgesetzt werden.
  6. Setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie die Kammer.
  7. Programmieren Sie den Gammastrahler so, dass die Tiere 12 Gy TBI ausgesetzt werden.
    1. Schalten Sie die Maschine ein, indem Sie den Schlüssel in die Position START drehen.
    2. Geben Sie die Bedienernummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    3. Geben Sie die PIN-Nummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    4. Drücken Sie 1 , um Optionen anzuzeigen.
    5. Drücken Sie 1 für die Timer-Einstellungen.
    6. Drücken Sie 1 für die Bestrahlungszeit.
    7. Geben Sie die Timer-Einstellung für den nächsten Zyklus über eine numerische Tastatur (hh:mm:ss-Format) ein und bestätigen Sie mit ENTER.
    8. Bestätigen Sie die Einstellungen noch einmal mit ENTER.
    9. Kehren Sie zum Home-Menü zurück, indem Sie 2x auf CLEAR drücken.
    10. Drücken Sie START, um die Belichtung zu starten.
  8. Verlassen Sie den Raum für die Zeit der aktiven Exposition. Das Gerät stoppt automatisch nach Ablauf der voreingestellten Zeit und beginnt zu piepen.
    ACHTUNG: Cäsium-137 (137Cs) ist ein tödlicher Gefahrstoff (Gesundheitsgefahr: H314). Die äußere Exposition gegenüber großen Mengen von 137Cs kann zu Verbrennungen, akuter Strahlenkrankheit und sogar zum Tod führen.
  9. Schalten Sie die Maschine aus, indem Sie den Schlüssel in die Position STOP drehen.
  10. Öffnen Sie die Probenkammer, nehmen Sie den Deckel ab, setzen Sie die Tiere zurück in den Käfig und desinfizieren Sie die Probenkammer mit 70%iger Ethanollösung.
  11. Bringen Sie die Tiere zurück in den konventionellen Stallraum und beobachten Sie ihren Zustand nach der Behandlung.
  12. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere jeden Tag und schläfern Sie sie sofort (trotz des geplanten Zeitpunkts) ein, wenn Symptome eines veränderten Wohlbefindens, einer Belastung oder eines Gewichtsverlusts von mehr als 15 % des Ausgangskörpergewichts beobachtet werden.
  13. Drei Stunden vor der geplanten Euthanasie wird der Bauchbereich desinfiziert und den Mäusen mit einer 28G-Insulinspritze 100 μl EdU-Stammlösung injiziert (intraperitoneal verabreicht).
  14. Entnahme des proximalen Darms um 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 168 h nach der Bestrahlung.
    1. Führen Sie die CO2 - Euthanasie nach den Standards der Heimateinrichtung durch.
      ACHTUNG: Kohlendioxid ist ein gefährlicher Stoff (H280). Enthält Gas unter Druck; kann explodieren, wenn es erhitzt wird. Kann Sauerstoff verdrängen und schnelles Ersticken verursachen.
    2. Dann wird der proximale Teil des Dünndarms dispräpariert, das anhaftende Gewebe entfernt, mit einer 16-G-Nadel, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, mit kaltem DPBS gespült, mit einer modifizierten Bouin-Fixierpuffer unter Verwendung einer 16-G-Injektionsnadel fixiert, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, in Längsrichtung aufgeschnitten und den proximalen Darm mit der Swiss-Roll-Technik wie zuvor beschrieben gerollt59.
  15. Legen Sie das Gewebe in eine histologische Kassette und lassen Sie es 24-48 h bei Raumtemperatur in einem Behälter mit 10% gepuffertem Formalin stehen. Das Volumen des Formalins sollte ausreichen, um die histologischen Kassetten vollständig abzudecken. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die histologischen Kassetten mit einer Pinzette in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter übertragen. Fahren Sie dann mit der Einbettung von Gewebeparaffin fort.
    HINWEIS: Die Einbettung von Gewebeparaffin wurde vom Research Histology Core Laboratory an der Stony Brook University durchgeführt. Hier kann der Vorgang gestoppt und Paraffinblöcke bei Raumtemperatur gelagert werden.
    VORSICHT: Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.

4. Histologische Analyse

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat alten) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
    Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol und Hämatoxylin unter der chemischen Haube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
    ACHTUNG: Xylol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: brennbar (GHS02), akut toxisch (GHS07) und gesundheitsgefährdend (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Die potenziell gefährlichen Auswirkungen sind, dass es tödlich ist, wenn es verschluckt wird oder in die Atemwege gelangt, und Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen kann. Darüber hinaus kann es die motorischen Funktionen beeinträchtigen, indem es Schläfrigkeit oder Schwindel verursacht, und bei längerer oder wiederholter Exposition Organschäden verursachen.
  5. Rehydrieren Sie Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 2 min; 95% Ethanol, 2 min; 70% Ethanol, 2 Min.
  6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  7. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Hämatoxylinlösung gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang (unter der chemischen Haube).
  8. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den mit Leitungswasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn unter fließendem Leitungswasser aus, bis sich die Hämatoxylinfärbung bläulich verfärbt, typischerweise nach 2 Minuten.
  9. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den Behälter, der mit 5%iger (w/v) Lithiumcarbonatlösung gefüllt ist. 10x eintauchen.
    ACHTUNG: Lithiumcarbonat ist eine potenziell gefährliche Substanz, die akute Toxizität (GHS07) und eine Gesundheitsgefahr (H302 - H319) verursacht. Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, schädlich bei Kontakt mit der Haut und verursacht schwere Augenreizungen.
  10. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  11. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Eosin gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang.
  12. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter und spülen Sie ihn kurz aus (10 s).
  13. Entwässern Sie die Abschnitte, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in die mit Ethanol-Gradientenlösungen gefüllten Behälter legen: 95% Ethanol, 5 Dips; 100% Ethanol, 5 Dips.
  14. Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in den mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
  15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gestell, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmittel auf Xylolbasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht unter der chemischen Haube lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie mit einem leeren Objektträger einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  17. Wenn die Objektträger ausgetrocknet sind, analysieren Sie die Histologie des Gewebes mit einem Lichtmikroskop oder einem fortschrittlicheren Mikroskop mit Hellfeldkanal.
    1. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Histologie im Vergleich zu Kontrollgeweben (scheinbestrahlt) zu analysieren.
    2. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, nehmen Sie auch Bilder auf.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 30 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
    Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol undH2O2/Methanol unter der chemischen Haube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
  5. Beenden Sie die endogene Peroxidase, indem Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einem mit 2%iger Wasserstoffperoxidlösung in Methanol gefüllten Behälter unter der chemischen Haube inkubieren.
    VORSICHT: Methylalkohol ist eine potenziell gefährliche Substanz: Gesundheitsgefährdend (H225-H301, H311, H331-H370), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) (GHS08). Wasserstoffperoxid ist ein potenziell gefährlicher Stoff: ätzend (GHS05) und verursacht akute Toxizität (GHS07).
  6. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
  7. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  8. Um die Antigene zu gewinnen, überführen Sie den Objektträgerhalter in einen Behälter mit 250 ml Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween-20, pH 6,0) und kochen Sie ihn 10 Minuten lang bei 110 °C in einer Enttarnungskammer.
  9. Den gesamten Behälter in den Kühlraum stellen und im Laufe von 30 Minuten allmählich abkühlen lassen.
  10. Ersetzen Sie nach 30 Minuten die Citratpufferlösung durch destilliertes Wasser und spülen Sie sie unter fließendem destilliertem Wasser ab, bis alle schwimmenden Paraffinstücke entfernt sind.
  11. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
  12. Blockieren Sie mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBS-Tween, indem Sie 200 μl der Lösung auf die Oberfläche einer Probe geben. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen vorhanden sind. Bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer für 30 min inkubieren.
  13. Entfernen Sie die blockierende Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Wieder in eine befeuchtete Kammer geben. 100 μl der entsprechenden Konzentration der Primärantikörper in einem Blockierungspuffer resuspendieren und bei 4 °C unter leichtem Schaukeln über Nacht inkubieren. Verwenden Sie für BMI1/EYFP Hühnchen-Anti-GFP (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Kaninchen-Anti-Ki-67 (Verdünnung 1:200).
  14. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  15. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der entsprechenden Konzentration an Sekundärantikörpern hinzu, die in einem Blockierungspuffer resuspendiert wurden, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C. Sekundäre Antikörper sollten mit einem Fluorophor konjugiert werden. Verwenden Sie für BMI1/EYFP das Esel-Anti-Huhn Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500).
  16. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  17. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der EdU-Färbelösung hinzu, die gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung des Fluorophors Alexa Fluor 555 hergestellt wurde.
  18. Entfernen Sie die EdU-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
  19. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  20. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
  21. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Objektträgerhalter, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  22. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 Stunden. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Verwenden Sie eine leere Folie. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  23. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung von Ki-67-, EdU- und BMI1/EYFP-Färbungen (535 nm, 646 nm bzw. 700 nm) ermöglichen.
  24. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie die Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

6. TUNEL-Färbung

  1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
    1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
  2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen.
    HINWEIS: Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 Stunden. Bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern ist es jedoch nicht ratsam. Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die Chemikalienhaube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol und Ethanol unter der Chemikalienhaube durch.
  3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
  4. Entparaffinieren Sie das Gewebe, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
    Anmerkungen: Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
  5. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 90% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
  6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 1 Minute lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
  7. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
  8. Inkubation mit DNase-freier Proteinase K. 100 μl der DNase-freien Proteinase-K-Lösung (Verdünnung 1:25 in DPBS) auf die Oberfläche der Probe innerhalb der hydrophoben Barriere. Bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer 15 Minuten inkubieren.
    ACHTUNG: Proteinase K ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H315 - H319 - H334).
  9. Entfernen Sie die Proteinase-K-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
  10. Bereiten Sie das TUNEL-Reaktionsgemisch vor: Mischen Sie die Etikettenlösung (1x) mit der Enzymlösung (10x). Gut pipettieren.
  11. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. 50 μl TUNEL-Reaktionsgemisch auf die Oberfläche der Probe geben und im Dunkeln bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer 60 min inkubieren. Verwenden Sie für eine Negativkontrolle nur die Etikettenlösung (ohne TdT).
  12. Entfernen Sie die TUNEL-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
  13. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
  14. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
  15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Diahalter. Trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
  16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
  17. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung der TUNEL-Färbung (535 nm) ermöglichen.
  18. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

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Ergebnisse

Die Verwendung der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung (SHT) in Kombination mit der genetischen Abstammungsverfolgung von Mäusen ermöglicht eine gründliche Analyse der Folgen von Strahlenschäden im Darm. Um zu beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine einzige Tamoxifen-Injektion, die eine verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) innerhalb einer Bmi1+ -Reservestammzellpopulation induziert. Zwei Tage nach der Tamoxifen-Injektion wurden die Mäuse einer Bes...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Es ermöglicht die genaue Analyse der Veränderungen des Darmepithels im Verlauf von 7 Tagen nach der Verletzung. Wichtig ist, dass die ausgewählten Zeitpunkte entscheidende Stadien der Verletzung widerspiegeln und durch deutliche Veränderungen des Darms (Verletzungs-, Apoptose-, Regenerations- und Normalisierungsphasen) gekennzeichnet sind60. Dieses Bestrahlungsmodell wurde etabliert und sorgfältig bewertet und...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Stony Brook Cancer Center Histology Research Core für die fachkundige Unterstützung bei der Vorbereitung von Gewebeproben und der Abteilung für Labortierressourcen an der Stony Brook University für die Unterstützung bei der Pflege und Handhabung der Tiere. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK124342 unterstützt, die an Agnieszka B. Bialkowska und DK052230 an Dr. Vincent W. Yang vergeben wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeBD
309659-16G Wiederverwendbare Nadeln für die Fütterung von Kleintieren: GeradeVWR20068-630-27G
x 1/2" NadelBD
305109-28G x 1/2" Monoject 1 mL InsulinspritzeCovidien
1188128012-5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterilem DMSO:Wasser (1:4 v/v), aliquot und lagern in -20°; C
Azer Wissenschaftlich  10% neutrales gepuffertes FormalinFisher Scientific22-026-213-B6.129X1-GT
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JDer Jackson LaboratoryStamm #:006148
B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Rinderserumalbuminfraktion V, HitzeschockMillipore-Sigma3116956001
Huhn Anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-Maisöl
Millipore-SigmaC8267-Enttarnungskammer
Biocare MedicalDC2012-Dimethylsulfoxid
(DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100lichtempfindliche
DNase-freie Proteinase KInvitrogenC10618H25x verdünnt in DPBS
Esel Anti-Huhn AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-Eosin
Fisher ScientificS176
Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse 90i Helles und fluoreszierendes Licht, mit Objektiven: 10X, 20XNikon
Fluoromount Wässriges EindeckmediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0,759 Gy min-1
>Ziege Anti-Kaninchen AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hämatoxylin-Lösung, Kieme Nr. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotationsmikrotom von Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrat (Bis-Benzimid)Thermo Fisher ScientificH3569Verdünnung 1:1000
Wasserstoffperoxidlösung, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-In
Situ Kit zur Erkennung des Zelltods, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithiumcarbonat (Pulver/ACS-zertifiziert), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000,5g/1L dH2O
Luer-Lok Spritze steril, Einmalgebrauch, 10 mLVWR89215-218-Methanol
VWRBDH1135-4LP
Pharmco Produkte  Ethylalkohol, 200 PROOFFisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Essigsäure ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-Kaninchen
Anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL EindeckmediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Inkubator-Genie zum Backen von Objektträgern bei 65 GradFisher Scientific50-728-103
Natriumcitrat-DihydratFisher ScientificS279-500
Edelstahl-PräpariersetVWR25640-002
Superfrost Plus Mikro-Objektträger [Größe: 25 x 75 x 1 mm]VWR  48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/ml in sterilem Maisöl, vorzugsweise frisch oder kurzfristig gelagert in -20°; C, lichtempfindliche
Tissue-Tek 24-Objektträgerhalter mit abnehmbarem GriffSakura4465
Tissue-Tek  Akku-Kante  Klingen mit niedrigem ProfilSakura4689
Tissue-Tek  Manuelles Objektträger-FärbesetSakura4451
Tissue-Tek Färbeschale, grün mit DeckelSakura4456
Tissue-Tek Färbeschale, weiß mit DeckelSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette VerarbeitungskassettenVWR87002-292-VWR
Micro Cover GläserVWR48393-081
XylolFisher ScientificX5P-1GAL

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