Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

Das menschliche Darmepithel würde ungefähr die Oberfläche eines halben Badmintonfeldes bedecken, wenn es vollständig flach platziert würde¹. Stattdessen wird diese einzelne Zellschicht, die den Menschen vom Inhalt seines Darms trennt, zu einer Reihe von fingerartigen Fortsätzen, Zotten und Vertiefungen, Krypten, verdichtet, die die Oberfläche des Darms maximieren. Die Zellen des Epithels differenzieren sich entlang einer Krypten-Zotten-Achse. Die Zotten bestehen hauptsächlich aus nährstoffabsorbierenden Enterozyten, schleimabsondernden Becherzellen und den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, während die Krypten hauptsächlich aus Defensin-produzierenden Paneth-Zellen, aktiven und Reserve-Stammzellen sowie Vorläuferzellen bestehen 2,3,4,5. Darüber hinaus erzeugen die bidirektionale Kommunikation dieser Zellen mit den Stroma- und Immunzellen des darunter liegenden mesenchymalen Kompartiments und der Mikrobiota des Lumens ein komplexes Netzwerk von Interaktionen, das die Darmhomöostase aufrechterhält und für die Genesung nach Verletzungen entscheidend ist ^6,7,8.

Das Darmepithel ist das sich am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im menschlichen Körper, mit einer Umsatzrate von 2-6 Tagen 9,10,11. Während der Homöostase teilen sich aktive Stammzellen an der Basis von Darmkrypten (kryptenbasensäulenförmige Zellen), die durch die Expression des Leucin-reichen, wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 5 (LGR5) gekennzeichnet sind, schnell und liefern Vorläuferzellen, die sich in alle anderen intestinalen Epithellinien differenzieren. Aufgrund ihrer hohen Mitoserate reagieren aktive Stammzellen und ihre unmittelbaren Vorläuferzellen jedoch besonders empfindlich auf Schäden durch Gammastrahlung und unterliegen nach^{Bestrahlung einer} Apoptose ^5,12,13,14. Nach ihrem Verlust werden Reservestammzellen und Nicht-Stammzellen (Subpopulationen von Vorläuferzellen und einige terminal differenzierte Zellen) in Darmkrypten aktiviert und füllen das basale Kryptenkompartiment wieder auf, das dann Zellpopulationen der Zotten rekonstituieren und so das Darmepithel regenerieren kann¹⁵. Mehrere Forschungsgruppen haben gezeigt, dass Reservestammzellen (ruhende Stammzellen) in der Lage sind, die Regeneration nach dem Verlust aktiver Stammzellen zu unterstützen 13,16,17,18,19,20,21,22. Diese Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Polycomb-Komplex-Protein-1-Onkogens (Bmi1), des Maus-Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gens (mTert), der Hopfen-Homöobox (Hopx) und des Leucin-reichen Repeat-Protein-1-Gens (Lrig1) aus. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nicht-Stammzellen in der Lage sind, Darmkrypten bei einer Verletzung wieder aufzufüllen 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Vorläuferzellen von sekretorischen Zellen und Enterozyten bei einer Verletzung eine Dedifferenzierung erfahren, zu stammähnlichen Zellen zurückkehren und die Regeneration des Darmepithels unterstützen. Neuere Studien haben Zellen identifiziert, die mehrere Marker exprimieren, die die Fähigkeit besitzen, bei einer Verletzung stammähnliche Eigenschaften zu erwerben (z. B. DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1⁺)^{32,33,34,35,36}. Überraschenderweise zeigten Yu et al., dass auch reife Paneth-Zellen (LYZ⁺) zur Darmregeneration beitragen können³⁷. Darüber hinaus führt die Bestrahlung nicht nur zur Apoptose von Darmepithelzellen und zur Störung der epithelialen Barrierefunktion, sondern auch zu einer Dysbiose der Darmflora, zur Aktivierung von Immunzellen und zur Initiierung einer entzündungsfördernden Reaktion sowie zur Aktivierung von mesenchymalen und stromalen Zellen^38,39.

Gammastrahlung ist ein wertvolles therapeutisches Mittel in der Krebsbehandlung, insbesondere bei Darmtumoren⁴⁰. Die Bestrahlung beeinträchtigt jedoch die Darmhomöostase erheblich, indem sie die Zellen schädigt, was zu Apoptose führt. Die Strahlenbelastung verursacht mehrere Störungen, die die Genesung eines Patienten verlangsamen, und ist gekennzeichnet durch Schleimhautverletzungen und Entzündungen in der akuten Phase und langfristig durch Durchfall, Inkontinenz, Blutungen und Bauchschmerzen. Diese Vielzahl von Erscheinungsformen wird als gastrointestinale Strahlentoxizität bezeichnet. Darüber hinaus kann sich das strahleninduzierte Fortschreiten der transmuralen Fibrose und/oder vaskulären Sklerose erst Jahre nach der Behandlung manifestieren^38,41. Gleichzeitig mit der Verletzung selbst induziert die Strahlung in den Darmzellen eine Reparaturreaktion, die Signalwege aktiviert, die für die Initiierung und Orchestrierung der Regeneration verantwortlich sind⁴². Eine strahleninduzierte Dünndarmerkrankung kann durch eine Strahlentherapie des Beckens oder des Abdomens mit anderen Organen (wie Gebärmutterhals, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Rektum) verursacht werden41,43,44,45,46. Darmbestrahlungsschäden sind daher ein bedeutendes klinisches Problem, und ein besseres Verständnis der daraus resultierenden Pathophysiologie wird wahrscheinlich die Entwicklung von Interventionen zur Linderung der mit der Strahlentherapie verbundenen gastrointestinalen Komplikationen vorantreiben. Neben der Bestrahlung gibt es noch andere Techniken, die es ermöglichen, den regenerativen Zweck des Darmepithels zu untersuchen. Es wurden transgene und chemische Mausmodelle entwickelt, um Entzündungen und die anschließende Regeneration zu untersuchen⁴⁷. Dextran-Natriumsulfat (DSS) induziert Entzündungen im Darm und führt zur Entwicklung von Merkmalen, die denen einer entzündlichen Darmerkrankung ähneln⁴⁸. Eine Kombination der DSS-Behandlung mit dem prokarzinogenen Wirkstoff Azoxymethan (AOM) kann zur Entwicklung von Kolitis-assoziiertem Krebs führen^48,49. Die Ischämie-Reperfusions-induzierte Schädigung ist eine weitere Methode, um das regenerative Potenzial des Darmepithels zu untersuchen. Diese Technik erfordert Erfahrung und chirurgische Kenntnisse⁵⁰. Darüber hinaus verursachen die oben genannten Techniken andere Arten von Verletzungen als Strahlung und können dazu führen, dass andere Regenerationsmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind diese Modelle zeitaufwändig, während die Bestrahlungstechnik relativ kurz ist. In jüngster Zeit wurden In-vitro-Methoden unter Verwendung von Enteroiden und Kolonoiden, die aus dem Darm und dem Dickdarm erzeugt wurden, in Kombination mit Strahlenschäden eingesetzt, um die Mechanismen der Darmregeneration zu untersuchen^51,52. Diese Techniken rekapitulieren jedoch nicht vollständig das Organ, das sie modellieren^53,54.

Das vorgestellte Protokoll beinhaltet die Beschreibung eines murinen Modells der Gammastrahlenschädigung in Kombination mit einem genetischen Modell, das nach einer Tamoxifenbehandlung die Rückverfolgung von Abstammungslinien aus der Reservestammzellpopulation ermöglicht (Bmi1-Cre^ER; Rosa26^eYFP). Dieses Modell verwendet eine 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung, die eine ausreichend signifikante Darmschädigung induziert, um Reservestammzellen zu aktivieren, während gleichzeitig die anschließende Untersuchung der intestinalen Regenerationsfähigkeit innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung ermöglicht^{wird 55}.

Alle Mäuse wurden in der Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) der Stony Brook University untergebracht. Das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University genehmigte alle Studien und Verfahren mit Tierversuchen. Versuche mit Tieren wurden streng in Übereinstimmung mit dem genehmigten Tierhandhabungsprotokoll (IACUC #245094) durchgeführt.

ANMERKUNG: Die Mausstämme B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) und B6.129X1-Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos/J (Rosa26^eYFP) wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und gekreuzt, um Bmi1-Cre ER zu erhalten; Rosa26^eYFP (Bmi1^ctrl) Mäuse, wie zuvor beschrieben^56,57,58.

1. Gehäuse von Bmi1-CRE ^ER; Rosa26 ^eYFP-Mäuse

1. Halten Sie die Mäuse in einer Tieranlage bei einer Temperatur zwischen 68 und 72 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30 bis 70 % in einem 12 h / 12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Wasser und normalem Chow ad libitum.
2. Vor den Experimenten werden die Genotypen der Mäuse mit einer Standard-PCR-Genotypisierungstechnik bestätigt^57,58.

2. Vorbereitung der Tiere und Materialien

1. Bringen Sie die Mäuse mindestens 7 Tage vor jedem Experiment in den Versuchsraum, damit sich die Mäuse akklimatisieren können.
2. Ordnen Sie Versuchs- und Kontrolltiere nach Geschlecht und Alter zu.
3. Die Kontrolltiere werden einer Tamoxifen-induzierten Cre-vermittelten Rekombination, aber nicht einer Bestrahlung unterzogen (Scheinbehandlung, 0 Gy), wobei darauf geachtet wird, dass die Versuchstiere die Tamoxifen-Injektion erhalten und einer Gammabestrahlung ausgesetzt werden.
4. Bereiten Sie die Tamoxifenlösung vor. Tamoxifenpulver in sterilem Maiskeimöl in einer Konzentration von 30 mg/ml resuspendieren. Beschallen Sie 3 Minuten lang in Zyklen von 30 s EIN und 30 s AUS mit 60 % Amplitude und drehen Sie dann 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln. Tamoxifen-Lösung kann bei −20 °C eingefroren werden, aber frieren/tauen Sie sie nicht mehr als einmal ein. Bereiten Sie vorzugsweise jedes Mal eine frische Lösung zu und lagern Sie sie nicht.
   HINWEIS: Tamoxifen ist lichtempfindlich. Wickeln Sie es während der Drehung bei Raumtemperatur mit Alufolie ein.
   ACHTUNG: Tamoxifen ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefahr (GHS08) und Umweltgefahr (GHS09).
5. 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Stammlösung herstellen. Resuspendieren Sie EdU-Pulver in 1/5 des Gesamtvolumens an sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) und fügen Sie langsam die restlichen 4/5 des Gesamtvolumens des sterilen Reinstwassers hinzu. Nach vollständiger Auflösung aliquotieren und bei −20 °C lagern.
   ACHTUNG: 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU) und Dimethylsulfoxid (DMSO) sind potenziell gefährliche Substanzen: Gesundheitsgefährdend (H340 und H631 bzw. H227, H315 und H319). EdU kann genetische Defekte verursachen und steht im Verdacht, die Fruchtbarkeit oder ungeborene Kinder zu schädigen, und DMSO kann Haut- und Augenreizungen verursachen.
6. Bereiten Sie Reagenzien für die Gewebeentnahme und -fixierung vor: Verdünnen Sie Ethanol, um eine 70%ige Wasserlösung herzustellen, kühlen Sie DPBS auf 4 °C ab und bereiten Sie modifizierten Bouin-Fixierpuffer (50 % Ethanol und 5 % Essigsäure in destilliertem_H2O) und 10 % gepuffertes Formalin vor.
   ACHTUNG: Ethylalkohol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H225-H319), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (GHS07). Essigsäure ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H226-H314), brennbar (GHS02) und ätzend (GHS05). Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.
7. Bereiten Sie die für die Euthanasie erforderlichen Geräte nach einer zugelassenen Methode vor (z. B. CO₂ -Kammer), ein Mäusepräparationsset (Schere, Pinzette), Petrischalen und eine 16-G-Sondennadel an einer 10-ml-Spritze zum Spülen des Darms und histologische Kassetten.

3. Ganzkörper-Gammabestrahlung (SHT) und Gewebeentnahme

1. Zwei Tage vor der Gammabestrahlung injizieren Sie den Versuchstieren eine Einzeldosis Tamoxifen, um eine Cre-vermittelte Rekombination und BMI1/EYFP⁺ -Zelllinienverfolgung zu induzieren. Wiegen Sie jedes Tier und berechnen Sie eine Dosis von 40 mg/kg Körpergewicht von Tamoxifen, das in Maisöl resuspendiert wurde. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70%igem Ethanol und verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal mit einer 27G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist.
2. Beobachten Sie die Tiere in den folgenden 48 Stunden, um eine mögliche Tamoxifen-Toxizität auszuschließen.
3. Bringen Sie die Mäuse in den Bestrahlungsraum, wie von der örtlichen Einrichtung angegeben.
4. Berechnen Sie die Bestrahlungszeit, die von der ¹³⁷Cs-Quelle freigesetzt wird, entsprechend der aktuellen Exaktordosisleistung. Wenn z. B. die aktuelle Dosisleistung 75,9 rad/min (0,759 Gy min⁻ 1 = 75,9 cGy m⁻¹) beträgt, wird die Expositionszeit in Minuten als die gewünschte Dosis/0,759 berechnet. Um die Tiere mit einer Dosis von 12 Gy TBI zu bestrahlen, beträgt die Belichtungszeit ~15,81 min (15 min und 48 s).
5. Desinfizieren Sie die Probenkammer im Gammastrahler mit 70%iger Ethanollösung. Legen Sie die absorbierende Matte und die Tiere in die Probenkammer.
   HINWEIS: Mit Scheinbehandlung behandelte Tiere sollten in den Bestrahlungsraum gebracht, aber nicht der Gammastrahlung ausgesetzt werden.
6. Setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie die Kammer.
7. Programmieren Sie den Gammastrahler so, dass die Tiere 12 Gy TBI ausgesetzt werden.
   1. Schalten Sie die Maschine ein, indem Sie den Schlüssel in die Position START drehen.
   2. Geben Sie die Bedienernummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
   3. Geben Sie die PIN-Nummer über eine numerische Tastatur ein und bestätigen Sie mit ENTER.
   4. Drücken Sie 1 , um Optionen anzuzeigen.
   5. Drücken Sie 1 für die Timer-Einstellungen.
   6. Drücken Sie 1 für die Bestrahlungszeit.
   7. Geben Sie die Timer-Einstellung für den nächsten Zyklus über eine numerische Tastatur (hh:mm:ss-Format) ein und bestätigen Sie mit ENTER.
   8. Bestätigen Sie die Einstellungen noch einmal mit ENTER.
   9. Kehren Sie zum Home-Menü zurück, indem Sie 2x auf CLEAR drücken.
   10. Drücken Sie START, um die Belichtung zu starten.
8. Verlassen Sie den Raum für die Zeit der aktiven Exposition. Das Gerät stoppt automatisch nach Ablauf der voreingestellten Zeit und beginnt zu piepen.
   ACHTUNG: Cäsium-137 (¹³⁷Cs) ist ein tödlicher Gefahrstoff (Gesundheitsgefahr: H314). Die äußere Exposition gegenüber großen Mengen von ¹³⁷Cs kann zu Verbrennungen, akuter Strahlenkrankheit und sogar zum Tod führen.
9. Schalten Sie die Maschine aus, indem Sie den Schlüssel in die Position STOP drehen.
10. Öffnen Sie die Probenkammer, nehmen Sie den Deckel ab, setzen Sie die Tiere zurück in den Käfig und desinfizieren Sie die Probenkammer mit 70%iger Ethanollösung.
11. Bringen Sie die Tiere zurück in den konventionellen Stallraum und beobachten Sie ihren Zustand nach der Behandlung.
12. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere jeden Tag und schläfern Sie sie sofort (trotz des geplanten Zeitpunkts) ein, wenn Symptome eines veränderten Wohlbefindens, einer Belastung oder eines Gewichtsverlusts von mehr als 15 % des Ausgangskörpergewichts beobachtet werden.
13. Drei Stunden vor der geplanten Euthanasie wird der Bauchbereich desinfiziert und den Mäusen mit einer 28G-Insulinspritze 100 μl EdU-Stammlösung injiziert (intraperitoneal verabreicht).
14. Entnahme des proximalen Darms um 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 168 h nach der Bestrahlung.
    1. Führen Sie die CO_{2 -} Euthanasie nach den Standards der Heimateinrichtung durch.
       ACHTUNG: Kohlendioxid ist ein gefährlicher Stoff (H280). Enthält Gas unter Druck; kann explodieren, wenn es erhitzt wird. Kann Sauerstoff verdrängen und schnelles Ersticken verursachen.
    2. Dann wird der proximale Teil des Dünndarms dispräpariert, das anhaftende Gewebe entfernt, mit einer 16-G-Nadel, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, mit kaltem DPBS gespült, mit einer modifizierten Bouin-Fixierpuffer unter Verwendung einer 16-G-Injektionsnadel fixiert, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist, in Längsrichtung aufgeschnitten und den proximalen Darm mit der Swiss-Roll-Technik wie zuvor beschrieben gerollt⁵⁹.
15. Legen Sie das Gewebe in eine histologische Kassette und lassen Sie es 24-48 h bei Raumtemperatur in einem Behälter mit 10% gepuffertem Formalin stehen. Das Volumen des Formalins sollte ausreichen, um die histologischen Kassetten vollständig abzudecken. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die histologischen Kassetten mit einer Pinzette in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter übertragen. Fahren Sie dann mit der Einbettung von Gewebeparaffin fort.
    HINWEIS: Die Einbettung von Gewebeparaffin wurde vom Research Histology Core Laboratory an der Stony Brook University durchgeführt. Hier kann der Vorgang gestoppt und Paraffinblöcke bei Raumtemperatur gelagert werden.
    VORSICHT: Formalin ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H350, H315, H317, H318, H370) und ätzend. Formalin kann Krebs, Haut- und Augenreizungen, Organschäden und allergische Hautreaktionen verursachen.

4. Histologische Analyse

1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
   1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat alten) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
   Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol und Hämatoxylin unter der chemischen Haube durch.
3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
   Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
   ACHTUNG: Xylol ist ein potenziell gefährlicher Stoff: brennbar (GHS02), akut toxisch (GHS07) und gesundheitsgefährdend (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Die potenziell gefährlichen Auswirkungen sind, dass es tödlich ist, wenn es verschluckt wird oder in die Atemwege gelangt, und Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen kann. Darüber hinaus kann es die motorischen Funktionen beeinträchtigen, indem es Schläfrigkeit oder Schwindel verursacht, und bei längerer oder wiederholter Exposition Organschäden verursachen.
5. Rehydrieren Sie Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 2 min; 95% Ethanol, 2 min; 70% Ethanol, 2 Min.
6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
7. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Hämatoxylinlösung gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang (unter der chemischen Haube).
8. Setzen Sie den Objektträgerhalter in den mit Leitungswasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn unter fließendem Leitungswasser aus, bis sich die Hämatoxylinfärbung bläulich verfärbt, typischerweise nach 2 Minuten.
9. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den Behälter, der mit 5%iger (w/v) Lithiumcarbonatlösung gefüllt ist. 10x eintauchen.
   ACHTUNG: Lithiumcarbonat ist eine potenziell gefährliche Substanz, die akute Toxizität (GHS07) und eine Gesundheitsgefahr (H302 - H319) verursacht. Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, schädlich bei Kontakt mit der Haut und verursacht schwere Augenreizungen.
10. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
11. Legen Sie den Objektträgerhalter in einen mit Eosin gefüllten Behälter und färben Sie ihn 5 Minuten lang.
12. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in den mit 70%igem Ethanol gefüllten Behälter und spülen Sie ihn kurz aus (10 s).
13. Entwässern Sie die Abschnitte, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in die mit Ethanol-Gradientenlösungen gefüllten Behälter legen: 95% Ethanol, 5 Dips; 100% Ethanol, 5 Dips.
14. Reinigen Sie die Objektträger, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in den mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gestell, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmittel auf Xylolbasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht unter der chemischen Haube lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie mit einem leeren Objektträger einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
17. Wenn die Objektträger ausgetrocknet sind, analysieren Sie die Histologie des Gewebes mit einem Lichtmikroskop oder einem fortschrittlicheren Mikroskop mit Hellfeldkanal.
    1. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Histologie im Vergleich zu Kontrollgeweben (scheinbestrahlt) zu analysieren.
    2. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, nehmen Sie auch Bilder auf.
       HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 30 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

5. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
   1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen. Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 h. Dies ist jedoch bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern nicht ratsam.
   Anmerkungen: Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die chemische Haube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol, Ethanol und_H2O2/Methanol unter der chemischen Haube durch.
3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
4. Entparaffinieren Sie die Taschentücher, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
   Anmerkungen: Stellen Sie von diesem Moment an sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
5. Beenden Sie die endogene Peroxidase, indem Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einem mit 2%iger Wasserstoffperoxidlösung in Methanol gefüllten Behälter unter der chemischen Haube inkubieren.
   VORSICHT: Methylalkohol ist eine potenziell gefährliche Substanz: Gesundheitsgefährdend (H225-H301, H311, H331-H370), brennbar (GHS02) und verursacht akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ) (GHS08). Wasserstoffperoxid ist ein potenziell gefährlicher Stoff: ätzend (GHS05) und verursacht akute Toxizität (GHS07).
6. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
7. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 2 Minuten lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
8. Um die Antigene zu gewinnen, überführen Sie den Objektträgerhalter in einen Behälter mit 250 ml Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween-20, pH 6,0) und kochen Sie ihn 10 Minuten lang bei 110 °C in einer Enttarnungskammer.
9. Den gesamten Behälter in den Kühlraum stellen und im Laufe von 30 Minuten allmählich abkühlen lassen.
10. Ersetzen Sie nach 30 Minuten die Citratpufferlösung durch destilliertes Wasser und spülen Sie sie unter fließendem destilliertem Wasser ab, bis alle schwimmenden Paraffinstücke entfernt sind.
11. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
12. Blockieren Sie mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBS-Tween, indem Sie 200 μl der Lösung auf die Oberfläche einer Probe geben. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen vorhanden sind. Bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer für 30 min inkubieren.
13. Entfernen Sie die blockierende Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Wieder in eine befeuchtete Kammer geben. 100 μl der entsprechenden Konzentration der Primärantikörper in einem Blockierungspuffer resuspendieren und bei 4 °C unter leichtem Schaukeln über Nacht inkubieren. Verwenden Sie für BMI1/EYFP Hühnchen-Anti-GFP (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Kaninchen-Anti-Ki-67 (Verdünnung 1:200).
14. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
15. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der entsprechenden Konzentration an Sekundärantikörpern hinzu, die in einem Blockierungspuffer resuspendiert wurden, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C. Sekundäre Antikörper sollten mit einem Fluorophor konjugiert werden. Verwenden Sie für BMI1/EYFP das Esel-Anti-Huhn Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500); Verwenden Sie für Ki-67 Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500).
16. Entfernen Sie die Antikörperlösung, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 3x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
17. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus der Halterung, entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen, und legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer. Fügen Sie 100 μl der EdU-Färbelösung hinzu, die gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung des Fluorophors Alexa Fluor 555 hergestellt wurde.
18. Entfernen Sie die EdU-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion TBS-Tween-Puffer.
19. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
20. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Objektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit TBS-Tween gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
21. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Objektträgerhalter, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
22. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 Stunden. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Verwenden Sie eine leere Folie. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht unter der Chemikalienhaube stehen. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
23. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung von Ki-67-, EdU- und BMI1/EYFP-Färbungen (535 nm, 646 nm bzw. 700 nm) ermöglichen.
24. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie die Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Die Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

6. TUNEL-Färbung

1. Kühlen Sie die histologischen Kassetten mit paraffineingebetteten Gewebeproben ab, indem Sie sie mindestens 1 h lang auf Eis legen. Bereiten Sie mit einem Mikrotom 5 μm dicke Schnitte für die Färbung vor. Jedes Gewebe sollte horizontal geschnitten werden, um die gesamte gerollte Probe zu bedecken.
   1. Nach dem Schneiden des Paraffinblocks werden die Gewebeschnitte in ein auf 45 °C erwärmtes Wasserbad überführt und auf beladene Objektträger gelegt. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen.
      HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden, und die Objektträger können bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Die Objektträger in einen Objektträgerhalter legen und über Nacht bei 65 °C backen.
   HINWEIS: Die Folien können kürzer gebacken werden, 1-2 Stunden. Bei frisch (weniger als 1 Monat) geschnittenen Objektträgern ist es jedoch nicht ratsam. Legen Sie das manuelle Objektträger-Färbeset unter die Chemikalienhaube und führen Sie die Inkubationen mit Xylol und Ethanol unter der Chemikalienhaube durch.
3. Kühlen Sie die Objektträger am nächsten Tag ab, indem Sie sie für 10 Minuten in einen Objektträgerhalter unter der chemischen Haube legen.
4. Entparaffinieren Sie das Gewebe, indem Sie den Objektträgerhalter für 3 Minuten in einen mit 100 % Xylol gefüllten Behälter legen. Wiederholen Sie die Inkubation mit frischem 100% Xylol.
   Anmerkungen: Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Proben jederzeit feucht gehalten werden.
5. Rehydrieren Sie die Schnitte in einem Ethanolgradienten, indem Sie den Objektträgerhalter nacheinander in Behälter legen, die mit den folgenden Lösungen gefüllt sind: 100% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 90% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 70% Ethanol, 3 Min.
6. Übertragen Sie den Objektträgerhalter in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Behälter und spülen Sie ihn 1 Minute lang unter fließendem destilliertem Wasser aus.
7. Nehmen Sie die Objektträger (nacheinander) aus dem Halter, klopfen Sie auf ein Papiertuch und trocknen Sie den Bereich um die Probe vorsichtig mit einem Papiertuch ab. Zeichnen Sie eine geschlossene Form um die Probe herum mit einem Stift, der eine hydrophobe Barriere bietet (PAP-Stift). In eine befeuchtete Kammer geben.
8. Inkubation mit DNase-freier Proteinase K. 100 μl der DNase-freien Proteinase-K-Lösung (Verdünnung 1:25 in DPBS) auf die Oberfläche der Probe innerhalb der hydrophoben Barriere. Bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer 15 Minuten inkubieren.
   ACHTUNG: Proteinase K ist ein potenziell gefährlicher Stoff: Gesundheitsgefährdend (H315 - H319 - H334).
9. Entfernen Sie die Proteinase-K-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
10. Bereiten Sie das TUNEL-Reaktionsgemisch vor: Mischen Sie die Etikettenlösung (1x) mit der Enzymlösung (10x). Gut pipettieren.
11. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. 50 μl TUNEL-Reaktionsgemisch auf die Oberfläche der Probe geben und im Dunkeln bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer 60 min inkubieren. Verwenden Sie für eine Negativkontrolle nur die Etikettenlösung (ohne TdT).
12. Entfernen Sie die TUNEL-Lösung, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in einen mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger unter Schütteln für 5 Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang 2x. Verwenden Sie jedes Mal eine neue Portion DPBS.
13. Nehmen Sie die Dias aus der Halterung (eine nach der anderen); Entfernen Sie überschüssige Waschlösung, indem Sie mit dem Glasschieber auf ein Papiertuch klopfen und in eine befeuchtete Kammer geben. Führen Sie eine Hoechst 33258-Gegenfärbung durch, indem Sie 100 μl der Hoechst 33258-Lösung (Verdünnung 1:1000 in TBS-Tween) auf die Oberfläche der Probe geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
14. Entfernen Sie die Lösung Hoechst 33258, indem Sie mit dem Glasobjektträger auf ein Papiertuch klopfen. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und geben Sie sie in den mit DPBS gefüllten Behälter. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter Schütteln.
15. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Diahalter. Trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einem Papiertuch ab und geben Sie je nach Größe der Probe ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf Aquabasis auf die Oberfläche der Probe. Montieren Sie, indem Sie vorsichtig ein Deckglas auf den Objektträger legen (achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen). Bei Bedarf leicht drücken. Die gesamte Oberfläche des Glases sollte abgedeckt und versiegelt sein.
16. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln liegen lassen. In der Regel verfestigt sich das Eindeckmedium in weniger als 24 h. Um sicherzustellen, dass die Objektträger trocken sind, kann ein Probeobjektträger angefertigt werden. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums hinein und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Berühren Sie am nächsten Tag den Tropfen und prüfen Sie, ob er erstarrt ist.
17. Wenn die Objektträger austrocknen, kann das gefärbte Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden, das mit Emissionswellenlängenfiltern ausgestattet ist, die die Visualisierung der TUNEL-Färbung (535 nm) ermöglichen.
18. Legen Sie einen Objektträger auf den Tisch, bewegen Sie sich, bis sich die Probe in der Mitte des Sichtfelds befindet, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein und verwenden Sie eine Objektivlinse mit 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung, um die Färbung im Vergleich zu Kontrollgewebe (scheinbestrahlt) zu analysieren. Wenn das Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet ist, können auch Bilder aufgenommen werden. Nehmen Sie Bilder für jeden Kanal separat auf und fügen Sie sie später zusammen.
    HINWEIS: Der Vorgang kann hier gestoppt werden. Objektträger können bei 4 °C gelagert und später analysiert werden. Bewahren Sie die Objektträger nicht länger als 14 Tage auf, da die Färbung langsam verblasst.

Die Verwendung der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung (SHT) in Kombination mit der genetischen Abstammungsverfolgung von Mäusen ermöglicht eine gründliche Analyse der Folgen von Strahlenschäden im Darm. Um zu beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine einzige Tamoxifen-Injektion, die eine verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) innerhalb einer Bmi1+ -Reservestammzellpopulation induziert. Zwei Tage nach der Tamoxifen-Injektion wurden die Mäuse einer Bestrahlung oder Scheinbestrahlung unterzogen. Drei Stunden vor der Euthanasie wurde den Mäusen EdU injiziert. Nach der Euthanasie wurden Dünndarmproben zur Analyse um 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 7 Tage nach der Bestrahlung entnommen. Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Bilder (H&E) (Abbildung 1) aus dem oben genannten Zeitverlauf veranschaulichen die Reaktion des Darmepithels auf eine Verletzung. Der 0-h-Zeitpunkt veranschaulicht das homöostatische Darmepithel (Abbildung 1); Darauf folgt die apoptotische Phase, die durch einen Zellverlust in Kryptenkompartimenten zwischen 3 h und 48 h gekennzeichnet ist (Abbildung 1). Dann folgt die regenerative Phase, in der hochproliferative Zellen die Krypten zwischen 72 h und 96 h besiedeln (Abbildung 1). Dies führt schließlich zur Normalisierungsphase, die hier durch den 7-Tage-Zeitpunkt dargestellt wird (Abbildung 1).

Abbildung 2 zeigt Veränderungen im proliferativen Status von intestinalen Kryptenzellen, die durch Immunfluoreszenzfärbung von EdU (Marker von Zellen in der S-Phase) und Ki-67 (Marker von Zellen in G1-, S- und G2/M-Phasen) bewertet wurden, während Lineage Tracing (EYFP+-Zellen) Zellen markiert, die von Bmi1+-Reservestammzellen stammen. Während der Homöostase (Abbildung 2, 0 h Schein) sind die Bmi1+-positiven Zellen, die durch die Expression von EYFP markiert sind, auf die +4-+6-Position innerhalb der Krypten beschränkt. Während der apoptotischen Phase (24 h und 48 h) nimmt die Anzahl der EYFP-positiven Zellen ab (Abbildung 2). Die regenerative Phase (72 h und 96 h) ist durch schnell proliferierende Bmi1+-positive Zellen und deren Vorläuferzellen gekennzeichnet (Abbildung 2); 7 Tage nach der Bestrahlung haben weitere Proliferation und Migration die Darmkryptenzellen wieder aufgefüllt und die Integrität des Darmepithels wiederhergestellt (Abbildung 2).

In scheinbestrahlten Mäusen (Kontrolle) färben EdU und Ki-67 EYFP-negative proliferative Zellen der intestinalen Krypten, die typisch für eine normale intestinale Homöostase sind und sich von aktiven Stammzellen über die transitamplifizierende Zone erstrecken (Abbildung 2). Strahlenschäden führen zu einem Verlust hochproliferativer Zellen während der apoptotischen Phase, wie die Reduktion der EdU- und Ki-67-Färbung zeigt (Abbildung 2). Die Aktivierung von Reservestammzellen (in diesem Beispiel EYFP-markierte Bmi1+ -positive Zellen) und ihre Proliferation führen zu einem Anstieg von EdU- und Ki-67-positiven Zellen, die 72 h und 96 h nach der Verletzung deutlich sichtbar sind, wobei die Krypten fast ausschließlich aus Zellen bestehen, die mit EYFP, EdU und Ki-67 co-gefärbt wurden. Die beobachteten Proliferationswerte normalisieren sich 7 Tage nach der Verletzung (Abbildung 2).

Um die durch Strahlenschäden verursachte Apoptose zu veranschaulichen, wurde eine TUNEL-Färbung durchgeführt, und repräsentative Bilder sind in Abbildung 3 enthalten. Während der Homöostase (Abbildung 3) durchlaufen nur wenige Zellen Apoptose, was typisch für den normalerweise schnellen Darmepithelumsatz ist. Eine deutliche Zunahme der TUNEL-Färbung ist spät in der apoptotischen Phase (24 h und 48 h) nach der Bestrahlung zu beobachten (Abbildung 3). Während der Regenerationsphase nimmt die TUNEL-Färbung in den regenerierenden Krypten stetig ab und ist nach Normalisierung der Krypten wieder nahezu nicht mehr vorhanden (Abbildung 3). Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zugängliche Immunfluoreszenz-Färbemethode, die eine einfache und weit verbreitete Kombination von Markierungstechniken (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) verwendet, die in der Lage ist, Einblicke in das Verhalten von Darmzellen nach einer Verletzung (hier Bestrahlung) zu geben. Mit diesem Ansatz können die Mechanismen untersucht werden, die regenerative Prozesse im Darmepithel unter bestimmten Bedingungen regulieren. Mit diesem und ähnlichen Ansätzen sollen alternative Regenerationsprozesse nach verschiedenen intestinalen Insultationen beleuchtet und therapeutische Strategien zur Verhinderung des Verlusts der Barrierefunktion untersucht werden.

Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H&E)-gefärbten Schnitten von Dünndarmgewebe nach einem zeitlichen Verlauf nach Ganzkörperbestrahlung. Bmi1-CREER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Alle Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von Dünndarmschnitten nach Bestrahlung. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Die Gewebeschnitte wurden mit EdU gefärbt, um Zellen in der S-Phase (rosa) und mit Ki-67 zu markieren, um Zellen in den Phasen G0, S und G2/M (gelb) zu markieren. EYFP (grün) markiert Bmi1+ -Zellen und ihre Vorläuferzellen und demonstriert die Rückverfolgung der Abstammungslinie. Die Schnitte wurden zusätzlich mit DAPI (blau) gegengefärbt, um die Kerne sichtbar zu machen. Die Daten werden als zusammengefügte Bilder bei 10-facher Vergrößerung und Einschübe einzelner Flecken bei 20-facher Vergrößerung angezeigt (diese stammen aus 10-fachen Bildern). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder der immunfluoreszierenden TUNEL-Färbung von Dünndarmschnitten nach Bestrahlung. Bmi1-CREER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine Dosis Tamoxifen 2 Tage vor der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung oder Scheinbestrahlung. Mäuse wurden geopfert und Dünndarmgewebe zu den in der Abbildung angegebenen Zeitpunkten gesammelt. TUNEL (rot) färbt apoptotische Zellen. Diese Bilder wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt, um Kerne sichtbar zu machen. Die gezeigten Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.