Name: Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die Regeneration des Darmepithels nach Gammabestrahlung bei Mäusen. Diese Methode untersucht Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen zur Erforschung von Stammzellverhalten bei Darmkrebsbehandlungen.

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Die Autoren danken dem Stony Brook Cancer Center Histology Research Core für die fachkundige Unterstützung bei der Vorbereitung von Gewebeproben und der Abteilung für Labortierressourcen an der Stony Brook University für die Unterstützung bei der Pflege und Handhabung der Tiere. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK124342 unterstützt, die an Agnieszka B. Bialkowska und DK052230 an Dr. Vincent W. Yang vergeben wurden.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Es ermöglicht die genaue Analyse der Veränderungen des Darmepithels im Verlauf von 7 Tagen nach der Verletzung. Wichtig ist, dass die ausgewählten Zeitpunkte entscheidende Stadien der Verletzung widerspiegeln und durch deutliche Veränderungen des Darms (Verletzungs-, Apoptose-, Regenerations- und Normalisierungsphasen) gekennzeichnet sind60. Dieses Bestrahlungsmodell wurde etabliert und sorgfältig bewertet und...

Das menschliche Darmepithel würde ungefähr die Oberfläche eines halben Badmintonfeldes bedecken, wenn es vollständig flach platziert würde1. Stattdessen wird diese einzelne Zellschicht, die den Menschen vom Inhalt seines Darms trennt, zu einer Reihe von fingerartigen Fortsätzen, Zotten und Vertiefungen, Krypten, verdichtet, die die Oberfläche des Darms maximieren. Die Zellen des Epithels differenzieren sich entlang einer Krypten-Zotten-Achse. Die Zotten bestehen hauptsächlich aus nährstoffabsorbierenden Enterozyten, schleimabsondernden Becherzellen und den hormonproduzierenden enteroendokrinen Zellen, während die Krypten hauptsächlich aus Defensin-produzierenden Paneth-Zellen, aktiven und Reserve-Stammzellen sowie Vorläuferzellen bestehen 2,3,4,5. Darüber hinaus erzeugen die bidirektionale Kommunikation dieser Zellen mit den Stroma- und Immunzellen des darunter liegenden mesenchymalen Kompartiments und der Mikrobiota des Lumens ein komplexes Netzwerk von Interaktionen, das die Darmhomöostase aufrechterhält und für die Genesung nach Verletzungen entscheidend ist 6,7,8.
Das Darmepithel ist das sich am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im menschlichen Körper, mit einer Umsatzrate von 2-6 Tagen 9,10,11. Während der Homöostase teilen sich aktive Stammzellen an der Basis von Darmkrypten (kryptenbasensäulenförmige Zellen), die durch die Expression des Leucin-reichen, wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 5 (LGR5) gekennzeichnet sind, schnell und liefern Vorläuferzellen, die sich in alle anderen intestinalen Epithellinien differenzieren. Aufgrund ihrer hohen Mitoserate reagieren aktive Stammzellen und ihre unmittelbaren Vorläuferzellen jedoch besonders empfindlich auf Schäden durch Gammastrahlung und unterliegen nachBestrahlung einer Apoptose 5,12,13,14. Nach ihrem Verlust werden Reservestammzellen und Nicht-Stammzellen (Subpopulationen von Vorläuferzellen und einige terminal differenzierte Zellen) in Darmkrypten aktiviert und füllen das basale Kryptenkompartiment wieder auf, das dann Zellpopulationen der Zotten rekonstituieren und so das Darmepithel regenerieren kann15. Mehrere Forschungsgruppen haben gezeigt, dass Reservestammzellen (ruhende Stammzellen) in der Lage sind, die Regeneration nach dem Verlust aktiver Stammzellen zu unterstützen 13,16,17,18,19,20,21,22. Diese Zellen zeichnen sich durch das Vorhandensein des Polycomb-Komplex-Protein-1-Onkogens (Bmi1), des Maus-Telomerase-Reverse-Transkriptase-Gens (mTert), der Hopfen-Homöobox (Hopx) und des Leucin-reichen Repeat-Protein-1-Gens (Lrig1) aus. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nicht-Stammzellen in der Lage sind, Darmkrypten bei einer Verletzung wieder aufzufüllen 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass Vorläuferzellen von sekretorischen Zellen und Enterozyten bei einer Verletzung eine Dedifferenzierung erfahren, zu stammähnlichen Zellen zurückkehren und die Regeneration des Darmepithels unterstützen. Neuere Studien haben Zellen identifiziert, die mehrere Marker exprimieren, die die Fähigkeit besitzen, bei einer Verletzung stammähnliche Eigenschaften zu erwerben (z. B. DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Überraschenderweise zeigten Yu et al., dass auch reife Paneth-Zellen (LYZ+) zur Darmregeneration beitragen können37. Darüber hinaus führt die Bestrahlung nicht nur zur Apoptose von Darmepithelzellen und zur Störung der epithelialen Barrierefunktion, sondern auch zu einer Dysbiose der Darmflora, zur Aktivierung von Immunzellen und zur Initiierung einer entzündungsfördernden Reaktion sowie zur Aktivierung von mesenchymalen und stromalen Zellen38,39.
Gammastrahlung ist ein wertvolles therapeutisches Mittel in der Krebsbehandlung, insbesondere bei Darmtumoren40. Die Bestrahlung beeinträchtigt jedoch die Darmhomöostase erheblich, indem sie die Zellen schädigt, was zu Apoptose führt. Die Strahlenbelastung verursacht mehrere Störungen, die die Genesung eines Patienten verlangsamen, und ist gekennzeichnet durch Schleimhautverletzungen und Entzündungen in der akuten Phase und langfristig durch Durchfall, Inkontinenz, Blutungen und Bauchschmerzen. Diese Vielzahl von Erscheinungsformen wird als gastrointestinale Strahlentoxizität bezeichnet. Darüber hinaus kann sich das strahleninduzierte Fortschreiten der transmuralen Fibrose und/oder vaskulären Sklerose erst Jahre nach der Behandlung manifestieren38,41. Gleichzeitig mit der Verletzung selbst induziert die Strahlung in den Darmzellen eine Reparaturreaktion, die Signalwege aktiviert, die für die Initiierung und Orchestrierung der Regeneration verantwortlich sind42. Eine strahleninduzierte Dünndarmerkrankung kann durch eine Strahlentherapie des Beckens oder des Abdomens mit anderen Organen (wie Gebärmutterhals, Prostata, Bauchspeicheldrüse, Rektum) verursacht werden41,43,44,45,46. Darmbestrahlungsschäden sind daher ein bedeutendes klinisches Problem, und ein besseres Verständnis der daraus resultierenden Pathophysiologie wird wahrscheinlich die Entwicklung von Interventionen zur Linderung der mit der Strahlentherapie verbundenen gastrointestinalen Komplikationen vorantreiben. Neben der Bestrahlung gibt es noch andere Techniken, die es ermöglichen, den regenerativen Zweck des Darmepithels zu untersuchen. Es wurden transgene und chemische Mausmodelle entwickelt, um Entzündungen und die anschließende Regeneration zu untersuchen47. Dextran-Natriumsulfat (DSS) induziert Entzündungen im Darm und führt zur Entwicklung von Merkmalen, die denen einer entzündlichen Darmerkrankung ähneln48. Eine Kombination der DSS-Behandlung mit dem prokarzinogenen Wirkstoff Azoxymethan (AOM) kann zur Entwicklung von Kolitis-assoziiertem Krebs führen48,49. Die Ischämie-Reperfusions-induzierte Schädigung ist eine weitere Methode, um das regenerative Potenzial des Darmepithels zu untersuchen. Diese Technik erfordert Erfahrung und chirurgische Kenntnisse50. Darüber hinaus verursachen die oben genannten Techniken andere Arten von Verletzungen als Strahlung und können dazu führen, dass andere Regenerationsmechanismen beteiligt sind. Darüber hinaus sind diese Modelle zeitaufwändig, während die Bestrahlungstechnik relativ kurz ist. In jüngster Zeit wurden In-vitro-Methoden unter Verwendung von Enteroiden und Kolonoiden, die aus dem Darm und dem Dickdarm erzeugt wurden, in Kombination mit Strahlenschäden eingesetzt, um die Mechanismen der Darmregeneration zu untersuchen51,52. Diese Techniken rekapitulieren jedoch nicht vollständig das Organ, das sie modellieren53,54.
Das vorgestellte Protokoll beinhaltet die Beschreibung eines murinen Modells der Gammastrahlenschädigung in Kombination mit einem genetischen Modell, das nach einer Tamoxifenbehandlung die Rückverfolgung von Abstammungslinien aus der Reservestammzellpopulation ermöglicht (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dieses Modell verwendet eine 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung, die eine ausreichend signifikante Darmschädigung induziert, um Reservestammzellen zu aktivieren, während gleichzeitig die anschließende Untersuchung der intestinalen Regenerationsfähigkeit innerhalb von 7 Tagen nach der Verletzung ermöglichtwird 55.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Wiederverwendbare Nadeln für die Fütterung von Kleintieren: Gerade</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2" Nadel</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Monoject 1 mL Insulinspritze</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1188128012-5-Ethynyl-2&prime;-Desoxyuridin (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/mL in sterilem DMSO:Wasser (1:4 v/v), aliquot und lagern in -20°; C</td></tr><tr><td>Azer Wissenschaftlich&nbsp; 10% neutrales gepuffertes Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-GT</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>Der Jackson Laboratory</td><td>Stamm #:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:010531</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminfraktion V, Hitzeschock</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Maisöl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Enttarnungskammer</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimethylsulfoxid</td><td></td></tr> <tr><td>(DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>lichtempfindliche</td></tr><tr><td>DNase-freie Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td><td>25x verdünnt in DPBS</td></tr><tr><td>Esel Anti-Huhn AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse 90i Helles und fluoreszierendes Licht, mit Objektiven: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Wässriges Eindeckmedium</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0,759 Gy min-1</sup</td></tr><tr><td>>Ziege Anti-Kaninchen AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Lösung, Kieme Nr. 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Rotationsmikrotom von Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrat (Bis-Benzimid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxidlösung, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-In</td><td></td></tr> <tr><td>Situ Kit zur Erkennung des Zelltods, Fluorescein (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumcarbonat (Pulver/ACS-zertifiziert), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0,5g/1L dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok Spritze steril, Einmalgebrauch, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218-Methanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Produkte&nbsp; Ethylalkohol, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Essigsäure ACS Grade</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Kaninchen</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Industries Inkubator-Genie zum Backen von Objektträgern bei 65 Grad</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat-Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Präparierset</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikro-Objektträger [Größe: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/ml in sterilem Maisöl, vorzugsweise frisch oder kurzfristig gelagert in -20°; C, lichtempfindliche</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Objektträgerhalter mit abnehmbarem Griff</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Akku-Kante&nbsp; Klingen mit niedrigem Profil</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Manuelles Objektträger-Färbeset</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Färbeschale, grün mit Deckel</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Färbeschale, weiß mit Deckel</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Unisette Verarbeitungskassetten</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Micro Cover Gläser</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

regeneration des darmepithels als reaktion auf ionisierende bestrahlung

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Das Darmepithel besteht aus einer einzigen Zellschicht, enthält jedoch mehrere Arten von terminal differenzierten Zellen, die durch die aktive Proliferation von Darmstammzellen am Boden von Darmkrypten erzeugt werden. Bei einer akuten Darmschädigung kommt es jedoch zu einem Zelltod dieser aktiven Darmstammzellen. Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs, die zwar therapeutisch wirksam ist, aber den Nebeneffekt hat, dass der aktive Stammzellpool erschöpft ist. In der Tat kommt es häufig zu einem gastrointestinalen Strahlensyndrom, während sie sich einer Strahlentherapie unterziehen, was zum Teil auf einen aktiven Stammzellabbau zurückzuführen ist. Der Verlust aktiver intestinaler Stammzellen in intestinalen Krypten aktiviert einen Pool von typischerweise ruhenden intestinalen Reservestammzellen und induziert eine Dedifferenzierung von sekretorischen und enterozytenartigen Vorläuferzellen. Ohne diese Zellen wäre das Darmepithel nicht in der Lage, sich von einer Strahlentherapie und anderen schweren Gewebeverletzungen zu erholen. Neue Fortschritte in der Abstammungsverfolgung ermöglichen es, die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration zu verfolgen und wurden erfolgreich eingesetzt, um dies im Darm zu untersuchen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zur Analyse von Zellen im Darmepithel der Maus nach Strahlenschädigung darzustellen.

Die Verwendung der 12-Gy-Ganzkörperbestrahlung (SHT) in Kombination mit der genetischen Abstammungsverfolgung von Mäusen ermöglicht eine gründliche Analyse der Folgen von Strahlenschäden im Darm. Um zu beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-Mäuse erhielten eine einzige Tamoxifen-Injektion, die eine verstärkte Expression des gelb fluoreszierenden Proteins (EYFP) innerhalb einer Bmi1+ -Reservestammzellpopulation induziert. Zwei Tage nach der Tamoxifen-Injektion wurden die Mäuse einer Bes...

Der Magen-Darm-Trakt ist eines der empfindlichsten Organe für Verletzungen bei strahlentherapeutischen Krebsbehandlungen. Es ist gleichzeitig ein Organsystem mit einer der höchsten Regenerationskapazitäten nach solchen Beleidigungen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Untersuchung der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels.

Regeneration des Darmepithels als Reaktion auf ionisierende Bestrahlung

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Die Gammabestrahlung ist eine weit verbreitete Behandlung von Darmkrebs. Und obwohl es therapeutisch wirksam ist, hat es negative Auswirkungen auf den Magen-Darm-Trakt. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die Aktivierung, Differenzierung und Migration von Zellen während der Regeneration nach Strahlenschädigung zu untersuchen.Dieses Protokoll beschreibt ein robustes und reproduzierbares Strahlenverletzungsmodell. Wichtig ist, dass dieses Modell es ermöglicht, das Schicksal von Darmzellen nach einer Verletzung zu verfolgen und somit ein besseres Verständnis der Regenerationsfähigkeit bestimmter Zellsubpopulationen zu ermöglichen. Diese Technik kann verschiedene Tiermodelle zur Verfolgung der Abstammungslinie verwenden, um das Echtzeitverhalten und die Interaktion verschiedener Subpopulationen von Zellen nach einer Verletzung zu untersuchen.Geringfügige Änderungen an diesem Protokoll sollten es ermöglichen, die Beziehungen zwischen Mikrobiota und verschiedenen Epithel-, Stroma- und Immunzellpopulationen nach Strahlenschäden zu untersuchen. Resuspendieren Sie zunächst Tamoxifenpulver in sterilem Maisöl in einer Konzentration von 30 Mikrogramm pro Mikroliter. Beschallen Sie drei Minuten lang in 30-sekündigen Ein-Aus-Zyklen mit einer Amplitude von 60 %.Eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln abwechselnd mischen. Bereiten Sie dann EdU vor, indem Sie dem EdU-Pulver steriles DMSO hinzufügen. Fügen Sie 1/5 des Gesamtvolumens hinzu und fügen Sie langsam das restliche Volumen des sterilen Reinstwassers hinzu.Nach vollständiger Auflösung aliquotieren und bei 20 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie Reagenzien für die Gewebeentnahme und -fixierung vor, z. B. 70 % Ethanol in Wasser, DPBS gekühlt auf vier Grad Celsius, Bouins Fixierpuffer und 10 % gepuffertes Formalin. Als nächstes bereiten Sie die notwendigen Geräte vor, wie z. B. ein Mäusepräparationsset, Petrischale, eine 16-Gauge-Sondennadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, und histologische Kassetten.Bereiten Sie die Versuchstiere zwei Tage vor der Gammabestrahlung auf die Tamoxifen-Injektion vor. Wiegen Sie jedes Tier und berechnen Sie die erforderliche Dosierung. Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70%Ethanol.Verabreichen Sie dann eine Einzeldosis Tamoxifen intraperitoneal mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, um eine Cre-vermittelte Rekombination zu induzieren. Beobachten Sie die Tiere in den nächsten 48 Stunden, um eine mögliche Tamoxifen-Toxizität auszuschließen. Nach 48 Stunden werden die Tiere in den Bestrahlungsraum gebracht.Desinfizieren Sie die Probenkammer im Gammastrahler mit 70%iger Ethanollösung. Legen Sie die saugfähige Matte und die Tiere in die Probenkammer. Setzen Sie den Deckel auf und schließen Sie die Kammer.Programmieren Sie den Gammastrahler so, dass die Tiere einer 12-grauen Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt werden. Drehen Sie dann den Schlüssel in die Startposition und drücken Sie Start, um die Belichtung zu starten. Verlassen Sie den Raum für die aktive Belichtungszeit.Nach Ablauf der voreingestellten Zeit stoppt das Gerät automatisch und beginnt zu piepen. Schalten Sie die Maschine aus, indem Sie den Schlüssel in die Stoppposition drehen. Öffnen Sie die Probenkammer und nehmen Sie den Deckel ab.Setzen Sie die Tiere in den Käfig und desinfizieren Sie die Probenkammer mit 70%igem Ethanol. Bringen Sie die Tiere zurück in den konventionellen Stallraum und beobachten Sie ihren Zustand nach der Behandlung. Überwachen Sie täglich das Gewicht der Tiere.Desinfizieren Sie drei Stunden vor der geplanten Euthanasie den Bauchbereich und injizieren Sie den Mäusen intraperitoneal 100 Mikroliter EdU-Stammlösung mit einer 28-Gauge-Insulinspritze. Nach dem Einschläfern des Tieres wird der proximale Darm zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung entnommen. Präparieren Sie den proximalen Teil des Dünndarms und entfernen Sie anhaftendes Gewebe.Spülen Sie das Gewebe mit kaltem DPBS mit einer 16-Gauge-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, und fixieren Sie das Gewebe mit Bouins Fixierpuffer. Schneiden Sie den Darm in Längsrichtung auf und rollen Sie den proximalen Darm mit der Swiss-Roll-Technik. Legen Sie das Gewebe in eine histologische Kassette in einen Behälter mit 10 % gepuffertem Formalin und inkubieren Sie es 24 bis 48 Stunden lang bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation werden die histologischen Kassetten auf 70%iges Ethanol übertragen und das Gewebe in Paraffin eingebettet. Legen Sie die histologischen Kassetten nach dem Einbetten für mindestens eine Stunde auf Eis. Schneiden Sie dann mit einem Mikrotom fünf Mikrometer dicke horizontale Abschnitte.Übertragen Sie die Gewebeschnitte in ein auf 45 Grad Celsius erwärmtes Wasserbad und legen Sie die Schnitte auf geladene Objektträger. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Gestell trocknen. Hämatoxylin- und Eosinaufnahmen von Dünndarmproben zeigten ein homöostatisches Darmepithel zur Stunde Null, gefolgt vom Verlust von Zellen in Kryptenkompartimenten während der apoptotischen Phase.Es folgte die regenerative Phase, in der hochproliferative Zellen die Krypten besiedelten, was zur Normalisierungsphase am siebten Tag führte. Die Linienverfolgung mittels EYFP zeigte, dass während der Homöostase die Zellen, die von Bmi1-positiven Reservestammzellen abstammten, auf die plus vier bis plus sechs Positionen innerhalb der Krypten beschränkt waren. Die EdU- und Ki-67-Färbung zeigte eine normale intestinale Homöostase in scheinbestrahlten Mäusen, die sich von aktiven Stammzellen bis in die transitamplifizierende Zone erstreckte.Während der apoptotischen Phase nahm die Anzahl der EYFP-positiven Zellen ab, was mit einem Verlust proliferativer Zellen durch Strahlenschäden einherging. In der regenerativen Phase wurde eine Aktivierung von Reservestammzellen und eine schnelle Proliferation von Bmi1-positiven Zellen beobachtet. Weitere Proliferation und Migration stellten die Integrität des Darmepithels wieder her.TUNEL-Färbungen zeigten, dass apoptotische Zellen während der Homöostase fehlen. Eine Zunahme der TUNEL-Färbung wurde spät in der apoptotischen Phase beobachtet. Während der Regenerationsphase nahm die TUNEL-Färbung in den regenerierenden Krypten stetig ab und war bei der Normalisierung der Krypten fast nicht mehr vorhanden.Diese Technik kann mit RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder Proteomanalyse kombiniert werden, um tiefere Erkenntnisse über die Rolle bestimmter Zelllinien bei der Darmregeneration nach Verletzungen zu gewinnen. Die Forschenden können die Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota und Epithel-, Stroma- und Immunzellpopulationen bei der Darmregeneration untersuchen, um das Verständnis der Regenerationsfähigkeit des Darmepithels zu erweitern.

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Forschung

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Biology

Biologie

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