DiI-Farbstofffüllung als einfaches und kostengünstiges Werkzeug zur Visualisierung von Flimmerneuronen in C. elegans

Zusammenfassung

Die DiI-Farbstofffüllung ist eine Methode, die häufig bei C. elegans verwendet wird, um eine Untergruppe der flimmernden sensorischen Neuronen sichtbar zu machen, was die Identifizierung genetischer Mutationen ermöglicht, die die Struktur oder Funktion der sensorischen Neuronen verändern.

Zusammenfassung

C. elegans wird seit langem als einfaches und zugängliches Modell verwendet, um die neuronale Struktur und die vielen Funktionen des Nervensystems zu untersuchen. Von den 302 Neuronen im adulten hermaphroditischen Nervensystem werden 60 als ciliatisierte sensorische Neuronen klassifiziert. Diese Neuronen sind von zentraler Bedeutung für eine Reihe von Verhaltensweisen von C. elegans , einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chemo-, Mechano- und Osmosensing, männliche Paarung und Dauerbildung. Seit mehreren Jahrzehnten verwenden Mitglieder der C. elegans-Gemeinschaft den rot fluoreszierenden lipophilen Farbstoff DiI, um eine Untergruppe der flimmernden sensorischen Neuronen sichtbar zu machen, die direkt der äußeren Umgebung ausgesetzt sind. Dieser Farbstoff dringt in die Flimmerenden der Neuronen ein und verteilt sich in einem relativ gleichmäßigen Muster über die Dendriten, Zellkörper und Axone. Diese einfache und leistungsstarke Methode ist ein hervorragendes Werkzeug für den ersten Durchgang, um genetische Mutanten zu identifizieren, die strukturelle oder funktionelle Defekte in flimmernden sensorischen Neuronen verursachen. Hier präsentieren wir eine abgespeckte Version dieser Färbemethode, um die acht Paare von amphidischen und zwei Paare von phasmidischen Neuronen zu visualisieren, die in C. elegans umweltexponiert sind. Wir besprechen Tipps für die Verwendung dieser kostengünstigen Methode zur Abbildung zellulärer Farbstofffüllungsmuster bei anästhesierten Tieren.

Einleitung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) sind leicht zu manipulieren, haben schnelle Generationszeiten und sind kostengünstig in der Wartung. Aufgrund dieser und vieler anderer Vorteile dienten C. elegans als bevorzugter Modellorganismus für die Untersuchung vieler biologischer Prozesse, insbesondere der Entwicklung und Funktion des Nervensystems. Eine ganze Ausgabe im Journal of Neurogenetics widmete sich kürzlich den historischen Auswirkungen der Forschung zu diesem speziellen Thema¹. Sie sind besonders nützlich für die Untersuchung der Funktion von primären Zilien, die an der Erfassung ....

Protokoll

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereite die Bleichlösung vor. Kombinieren Sie 2 mL Bleichmittel, 500 μl 10 M NaOH und 7,5 mL dH₂O in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Bleichlösung bleibt bis zu 1 Woche stabil, wenn sie bei Raumtemperatur (RT) gelagert wird.
2. Bereiten Sie den M9-Puffer vor. 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ und 5 g NaCl in 1 l sterilem Wasser mischen und zum Sterilisieren im Autoklaven vermengen. Nach dem vollständigen Abkühlen auf RT 1 ml steriles 1 M MgSO₄ hinzufügen.
3. Bereiten Sie die DiI-Stammlösung vor....

Ergebnisse

Adulte N2-Würmer, die 24 Stunden nach der Farbstofffüllung abgebildet wurden, zeigen ein klares Fluoreszenzsignal, das relativ gleichmäßig über die amphidischen Neuronen (Abbildung 1A,A') und die Phasmid-Neuronen (Abbildung 1D,D') verteilt ist. Bei diesen Tieren lassen sich die dendritischen Fortsätze und Zellkörper der amphidischen Neuronen gut unterscheiden. Es gibt keine Farbstoffklumpen in d.......

Diskussion

xEine erfolgreiche Farbstofffüllung beruht auf einer sorgfältigen Berücksichtigung des Entwicklungsstadiums und des genetischen Hintergrunds der Tiere sowie der verstrichenen Zeit bis zur Bildgebung. Einige genetische Mutationen stören die Struktur und/oder Funktion der extern exponierten sensorischen Flimmerneuronen, was dazu führt, dass Tiere nicht in der Lage sind, die Füllung richtig zu färben. Daher kann die Farbstofffüllung von neuen C. elegans-Mutanten als einfacher First.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DiI	Biotium	60010	Nicht wasserlöslich, 2 mg/ml Lösung in DMF herstellen. Lösung ist lichtempfindlich, mit Folie abdecken. Bei -20 °C lagern. Lösung viele Jahre haltbar.
Levamisolhydrochlorid	Fisher	AC187870100	10 mM Lösung in M9 Puffer. Bei -20 °C lagern. Lösung viele Jahre haltbar.
M9 Buffer	IPM Scientific	11006-517	Zum Kauf erhältlich, aber auch einfach im Haus nach Rezept im Protokoll herzustellen.
N2 (C. elegans Stamm)	CGC	N2	C. elegans Wildisolat
YH2125 (C. elegans Stamm)	n/a	n/a	Stamm aus dem Yoder-Labor (Bentley-Ford et al., 2021)