Großangelegter Gravitaxis-Assay von Caenorhabditis dauer-Larven

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung eines groß angelegten Gravitaxis-Assays mit Caenorhabditis dauerlarven. Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Detektion des Gravitaxisverhaltens im Vergleich zu einem plattenbasierten Assay.

Zusammenfassung

Die Schwerkraftempfindung ist ein wichtiger und relativ wenig untersuchter Prozess. Die Erfassung der Schwerkraft ermöglicht es den Tieren, in ihrer Umgebung zu navigieren und erleichtert die Bewegung. Darüber hinaus ist die Schwerkraftempfindung, die im Innenohr von Säugetieren auftritt, eng mit dem Hören verbunden - daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die auditive und vestibuläre Forschung. Gravitaxis Assays existieren für einige Modellorganismen, einschließlich Drosophila. Einzelne Würmer wurden zuvor auf ihre Orientierungspräferenz untersucht, wenn sie sich in Lösung niederlassen. Ein zuverlässiger und robuster Assay für Caenorhabditis gravitaxis wurde jedoch nicht beschrieben. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Gravitaxis-Assays, mit dem Hunderte von Caenorhabditis-Stadien gleichzeitig getestet werden können. Dieser groß angelegte Langstrecken-Assay ermöglicht eine detaillierte Datenerfassung und zeigt Phänotypen auf, die bei einem Standard-Plattentest möglicherweise übersehen werden. Die Dauerbewegung entlang der vertikalen Achse wird mit horizontalen Steuerungen verglichen, um sicherzustellen, dass die Richtungsvorspannung auf die Schwerkraft zurückzuführen ist. Die gravitaktische Präferenz kann dann zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen verglichen werden. Diese Methode kann molekulare, zelluläre und Umweltanforderungen für die Gravitaxie in Würmern bestimmen.

Einleitung

Die Anziehungskraft der Erde zu spüren, ist entscheidend für die Orientierung, Bewegung, Koordination und das Gleichgewicht vieler Organismen. Die molekularen Mechanismen und Neuroschaltkreise der Schwerkraftempfindung sind jedoch im Vergleich zu anderen Sinnen kaum verstanden. Bei Tieren interagiert die Schwerkraftempfindung mit anderen Reizen und kann von ihnen übertroffen werden, um das Verhalten zu beeinflussen. Visuelle Hinweise, propriozeptives Feedback und vestibuläre Informationen können integriert werden, um ein Gefühl des Körperbewusstseins in Bezug auf die Umgebung eines Tieres zu erzeugen ^1,2. Umge....

Protokoll

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Stämme sind C. elegans (N2) und C. briggsae (AF16) (siehe Materialtabelle). Für jeden Assay wurde eine gemischtgeschlechtliche Population von Dauers verwendet.

1. Vorbereitung der Kammer

1. Arbeiten Sie in einem Abzug. Richten Sie den Arbeitsbereich mit einem Bunsenbrenner, 1-2 Rasierklingen, einer Zange, einer Pinzette und einer Kunststoffschneidefläche ein (siehe Materialtabelle).
2. Sammeln Sie für jede Kammer zwei 5-ml-serologische Pipetten. Entfernen Sie den Baumwollpfropfen von einer Pipette mit einer Pinzette.....

Ergebnisse

Vergleich der Gravitaxie zwischen Arten
Nach dem oben beschriebenen Verfahren kann C. briggsae dauer gravitaxis mit C. elegans gravitaxis und horizontalen Kontrollen verglichen werden. Die vertikale Verteilung (kastanienbraun) von C. briggsae dauers ist zu den Oberseiten der Kammern hin verzerrt, wobei ein großer Prozentsatz von Würmern +7 erreicht (Abbildung 2A). Im Gegensatz zu horizontalen Kontrollen (Aqua), bei denen die Dauern in einer annä.......

Diskussion

Vergleich mit bisherigen Methoden
Im Gegensatz zur Chemotaxis kann die Gravitaxie bei Caenorhabditis nicht zuverlässig mit einem traditionellen Agarplatten-Versuchsdesign beobachtet werden. Eine Standard-Petrischale hat einen Durchmesser von 150 mm, so dass nur 75 mm in beide Richtungen für Dauers zur Verfügung stehen, um die Gravitaxispräferenz zu demonstrieren. Obwohl die Orientierungspräferenz von C. elegans in Lösung¹² untersucht werden kann, hat diese Met.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1% Natriumdodecylsulfatlösung			Ab Lager 10% (w/v) SDS in DI-Wasser
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	14-959-53A
3 mm Sechskantschlüssel			Andere Metallwerkzeuge ähnlicher Größe können verwendet werden
4% Agar in normalem Wachstumsmedium (NGM) - 1 l			Vor dem Autoklavieren: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2,5 g Pepton, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μ L Cholesterin (10 mg/ml), 1 mL CaCl2, 962 mL DI Wasser; Nach dem Autoklavieren: 24,5 mL Phosphatpuffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serologische Pipetten	Fisherbrand	S68228C	Polystyrol, kein Borosilikatglas
60% Kalte Saccharoselösung			60% Saccharose (w/v) in DI-Wasser; Sterilisierung durch Filtration (0,45 μ m Filter). Halten Sie bei 4 Grad; C
AF16 C. briggsae oder anderer experimenteller Stamm			Erhältlich beim CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsenbrenner
Frischhaltefolie	Fisherbrand	22-305654
Klinische Zentrifuge
Einweg-Rasierklingen	Fisherbrand	12-640
Faradayscher Käfig			Kann aus Pappe und Aluminiumfolie konstruiert werden; 30" L x 6" B x 26" H oder größer
Tintenmarker			Sharpie oder andere Marke zum Markieren auf Kunststoff
Beschriftungsband	Carolina	215620
M9 Puffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans Stamm			Erhältlich beim CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM-Platten mit OP50			1,7% (w/v) Agar in NGM (siehe Beschreibung: 4% Agar in NGM). Saatgut mit OP50
Paraffinfilm	Bemis	13-374-10
Kunststoff-Schneidebrett
Zange
Rotierender Vertikalmischer	BTLab SYSTEMS	BT913	Mit 22 x 15 mL Röhrchenstange
Serologische Pipette	Corning	357469
Stereomikroskop	Laxco	S2103LS100
Zählzähler	ULINE	H-7350
Dickes NGM/Agar-Plattenmedium - 1 L			Siehe 4% Agar im NGM-Rezept; ersetzen Sie 40 g Agar durch eine 20 g

Agar-Pinzette