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Summary

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Abstract

Eine Dysfunktion der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, was häufig zu Netzhautödemen und anschließendem Sehverlust führt. Die innere Blut-Netzhaut-Barriere (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalem vaskulärem Endothel mit geringer Permeabilität unter physiologischen Bedingungen. Dieses Merkmal der geringen Permeabilität wird durch niedrige parazelluläre Transportraten zwischen benachbarten retinalen mikrovaskulären Endothelzellen sowie durch den transzellulären Transport (Transzytose) durch sie streng reguliert und aufrechterhalten. Die Bewertung der retinalen transzellulären Barrierepermeabilität kann grundlegende Einblicke in die Integrität von iBRB in Gesundheit und Krankheit liefern. In dieser Studie beschreiben wir einen Endothelzell (EC) Transzytose-Assay als in vitro Modell zur Bewertung der iBRB-Permeabilität unter Verwendung von humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs). Dieser Assay bewertet die Fähigkeit von HRMECs, Transferrin und Meerrettichperoxidase (HRP) in rezeptor- bzw. caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren. Vollständig konfluente HRMECs, die auf poröser Membran kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzmarkiertem Transferrin (Clathrin-abhängige Transzytose) oder HRP (Caveolae-vermittelte Transzytose) inkubiert, um die Transferrin- oder HRP-Spiegel zu messen, die in die Bodenkammer übertragen wurden, was auf Transzytosespiegel in der gesamten EC-Monoschicht hinweist. Der Wnt-Signalweg, ein bekannter Signalweg, der iBRB reguliert, wurde moduliert, um die Caveolae-vermittelte HRP-basierte Transzytose-Assay-Methode zu demonstrieren. Der hier beschriebene EC-Transzytose-Assay kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Regulatoren der EC-Permeabilität und iBRB-Integrität in vaskulären Pathologien und für das Screening von Arzneimittelabgabesystemen sein.

Introduction

Die menschliche Netzhaut ist eines der am höchsten energieintensiven Gewebe im Körper. Das reibungslose Funktionieren der neuronalen Netzhaut erfordert eine effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie einen begrenzten Fluss anderer potenziell schädlicher Moleküle zum Schutz der Netzhautumgebung, die über die Blut-Netzhaut-Schranke (BRB^{) vermittelt} wird1. Ähnlich wie die Blut-Hirn-Schranke (BBB) im zentralen Nervensystem wirkt die BRB als selektive Barriere im Auge und reguliert die Bewegung von Ionen, Wasser, Aminosäuren und Zucker in und aus der Netzhaut. BRB erhält auch die Netzhauthomöostase und ihr Immunprivileg aufrecht, indem sie die Exposition gegenüber Kreislauffaktoren wie Immunzellen, Antikörpern und schädlichen Krankheitserregern verhindert². BRB-Dysfunktion trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, wie diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss und Uveitis, was zu vasogenen Ödemen und anschließendem Sehverlust führt ^3,4,5.

Die BRB besteht aus zwei separaten Barrieren für zwei unterschiedliche okuläre vaskuläre Netzwerke: das retinale Gefäßsystem und die fenestrierte Choriokapillare unter der Netzhaut. Die innere BRB (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (RMECs), die die retinale Mikrovaskulatur auskleiden, die die inneren retinalen neuronalen Schichten nährt. Zum anderen bildet das retinale Pigmentepithel den Hauptbestandteil des äußeren BRB, das zwischen neurosensorischer Netzhaut und Choriokapillaris² liegt. Für den iBRB findet der molekulare Transport zwischen RMECs sowohl über parazelluläre als auch über transzelluläre Wege statt (Abbildung 1). Der hohe Grad an Substanzselektivität über den iBRB beruht auf (i) dem Vorhandensein von junctionalen Proteinkomplexen, die den parazellulären Transport zwischen benachbarten Endothelzellen (ECs) einschränken, und (ii) niedrigen Expressionsniveaus von Caveolae-Mediatoren, Transportern und Rezeptoren innerhalb der Endothelzellen, die niedrige transzelluläre Transportraten aufrechterhalten 1,6,7,8 . Junctionale Komplexe, die den parazellulären Fluss regulieren, bestehen aus Tight Junctions (Claudine, Occludine), Adherens-Junctions (VE-Cadherine) und Gap Junctions (Connexine), die den Durchgang von Wasser und kleinen wasserlöslichen Verbindungen ermöglichen. Während kleine lipophile Moleküle passiv über das Innere von RMECs diffundieren, wird die Bewegung größerer lipophiler und hydrophiler Moleküle durch ATP-getriebene transendotheliale Signalwege einschließlich vesikulärer Transport- und Membrantransporter reguliert ^5,9.

Vesikuläre Transzytose kann als Caveolin-vermittelte katolare Transzytose, Clathrin-abhängige (und rezeptorvermittelte) Transzytose und Clathrin-unabhängige Makropinozytose kategorisiert werden (Abbildung 2). Diese vesikulären Transportprozesse umfassen unterschiedlich große Vesikel, wobei Makropinosomen die größten (im Bereich von 200-500 nm) und Caveolae die kleinsten (durchschnittlich 50-100 nm) sind, während Clathrin-beschichtete Vesikel von 70-150 nm¹⁰ reichen. Caveolae sind kolbenförmige lipidreiche Plasmamembraninvaginationen mit einer Proteinhülle, die hauptsächlich aus Caveolin-1 besteht, das Lipidmembrancholesterin und andere Struktur- und Signalproteine über ihre Caveolin-Gerüstdomäne¹¹ bindet. Caveoline arbeiten mit peripher angeschlossenem Cavin zusammen, um die Stabilisierung der Caveolae an der Plasmamembran¹² zu fördern. Katolarmembranen können auch Rezeptoren für andere Moleküle wie Insulin, Albumin und zirkulierende Lipoproteine einschließlich High-Density-Lipoprotein (HDL) und Low-Density-Lipoprotein (LDL) tragen, um ihre Bewegung durch Endothelzellen zu unterstützen¹³. Während der Entwicklung hängt die Bildung von funktionellem BRB von der Unterdrückung der EC-Transzytose^{ab 8}. Reifes retinales Endothel weist daher relativ niedrige Konzentrationen von Caveolae-, Caveolin-1- und Albuminrezeptoren im Vergleich zu anderen Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen auf, was zu seinen Barriereeigenschaften beiträgt ^4,9.

Da der iBRB-Abbau ein wesentliches Kennzeichen vieler pathologischer Augenerkrankungen ist, ist es wichtig, Methoden zur Beurteilung der retinalen vaskulären Permeabilität in vivo und in vitro zu entwickeln. Diese Methoden helfen, wahrscheinliche Einblicke in die Mechanismen der kompromittierten BRB-Integrität zu liefern und die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Ziele zu bewerten. Aktuelle In-vivo-Bildgebungs– oder quantitative vaskuläre Leckage-Assays verwenden typischerweise fluoreszierende (Natriumfluorescein und Dextran), kolorimetrische (Evans-Blue-Farbstoff und Meerrettichperoxidase [HRP]-Substrat) oder radioaktive Tracer¹⁴, um eine Extravasation aus dem Gefäßsystem in das umgebende Netzhautgewebe mit mikroskopischer Bildgebung oder in isoliertem Gewebelysat nachzuweisen. Ein idealer Tracer zur Quantifizierung der vaskulären Integrität sollte inert und groß genug sein, um kompromittierte Gefäße frei zu durchdringen, während sie in gesunden und intakten Kapillaren eingeschlossen sind. Methoden, die Natriumfluorescein oder Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertes Dextran (FITC-Dextran) in lebender Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA) oder isolierten Netzhaut-Flachmounts verwenden, werden häufig zur Quantifizierung der Netzhautextravasation in vivo oder ex vivo verwendet. FITC-Dextran hat den Vorteil, dass es in verschiedenen Molekulargewichten von 4-70 kDa für größenselektive Studien^15,16,17 verfügbar ist. FITC-Albumin (~68 kDa) ist ein alternativer großformatiger Proteintracer von biologischer Relevanz für vaskuläre Leckagestudien¹⁸. Evansblau-Farbstoff, intrakardial^{injiziert 19}, retroorbital oder durch die Schwanzvene 20, beruht auch auf seiner Bindung mit endogenem Albumin, um ein großes Molekül zu bilden, das durch meist spektrophotometrische Detektion oder, seltener, Fluoreszenzmikroskopie in flachen Halterungen quantifiziert werden kann^20,21. Diese quantitativen oder lichtbildgebenden Methoden unterscheiden jedoch oft nicht zwischen parazellulärem Transport und transendothelialem Transport. Für die spezifische Analyse der Transzytose mit ultrastruktureller Visualisierung transzytosierter Vesikel werden typischerweise Tracermoleküle wie HRP verwendet, um transzytosierte Vesikel innerhalb von Endothelzellen zu lokalisieren, die unter einem Elektronenmikroskop 22,23,24 beobachtet werden können (Abbildung 3A-C).

Die Entwicklung und Verwendung von In-vitro-iBRB-Modellen zur Bewertung der Permeabilität von Endothelzellen könnte eine robuste Bewertung mit hohem Durchsatz ermöglichen, um In-vivo-Experimente zu ergänzen und die Untersuchung molekularer Regulatoren der vaskulären Leckage zu unterstützen. Häufig verwendete Assays zur Beurteilung des parazellulären Transports und der Integrität von Tight Junctions umfassen den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER), ein Maß für die Ionenleitfähigkeit (Abbildung 4)^2,25, und den In-vitro-Gefäßleckage-Assay unter Verwendung von fluoreszierenden Tracern mit kleinem Molekulargewicht ²⁶. Darüber hinaus wurden Transferrin-basierte Transzytose-Assays zur Modellierung von BBB verwendet, um die Clathrin-abhängige Transzytose^{zu untersuchen 27}. Trotzdem sind die Assays zur Bewertung der BRB und insbesondere der retinalen EC-Katolartranszytose in vitro begrenzt.

In dieser Studie beschreiben wir einen EC-Transzytose-Assay unter Verwendung humaner retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HRMECs) als in vitro-Modell zur Bestimmung der iBRB-Permeabilität und der EC-Transzytose. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit von HRMECs, Transferrin oder HRP über die rezeptorvermittelten bzw. caveolae-abhängigen Transzytosewege zu transportieren (Abbildung 2). HRMECs, die bis zur vollständigen Konfluenz in der apikalen Kammer (d. h. Filtereinsatz) kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzkonjugiertem Transferrin (Cy3-Tf) oder HRP inkubiert, um die Fluoreszenzintensität zu messen, die den Transferrin- oder HRP-Spiegeln entspricht, die ausschließlich durch EC-Transzytose in die untere Kammer übertragen werden. Die Konfluenz der Zellmonoschicht kann durch Messung von TEER bestätigt werden, was die Tight-Junction-Integrität^{anzeigt 25}. Um die TEER- und Transzytose-Assay-Technik zu demonstrieren, wurden bekannte molekulare Modulatoren der vaskulären Permeabilität und EC-Transzytose verwendet, einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)²⁸ und derjenigen im Wnt-Signalweg (Wnt-Liganden: Wnt3a und Norrin)²⁹.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Boston Children’s Hospital zur Erzeugung von lichtmikroskopischen und EM-Bildern genehmigt (Abbildung 3). Protokolle für die In-vivo-Studien können von Wang et ^al.24 bezogen werden. Alle Experimente mit humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) am Boston Children’s Hospital genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Lösung zur Beschichtung von Gewebekulturschalen: Bereiten Sie 0,1% ige Gelatinelösung vor, indem Sie 1 ml Gelatine-Stammlösung (40%-50%) in 500 ml steriler Gewebekultur 1x PBS (pH = 7,4) auflösen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter. 0,1%ige Gelatinelösung bei 2-8°C lagern. Es kann auf unbestimmte Zeit in sterilem Zustand bei der genannten Temperatur gelagert werden.
2. Wachstumsmedium: Bereiten Sie 500 ml Endothelzellwachstums-Komplettmedium (EGM) vor, indem Sie EGM-Ergänzungen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Table of Materials) in das Endothelzellwachstums-Basalmedium (EBM) auflösen. Aliquotes Wachstumsmedium in 50-ml-Röhrchen geben und die Röhrchen bei 4 °C lagern. Die Haltbarkeit des Wachstumsmediums beträgt 12 Monate bei 4 °C.
3. Trypsinlösung: Für 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung aliquot aus der Durchstechflasche in 50 ml Röhrchen geben und bei 4 °C (bis zu 2 Wochen) oder −20 °C (bis zu 24 Monaten) lagern.

2. Kultivierung von HRMECs

1. Erste Zellkultur
   1. Zellkultur Petrischalen (100 mm Durchmesser x 20 mm Höhe) mit 5 ml 0,1% Gelatinelösung unter einer Laminar-Flow-Haube beschichten und 30 min bei Raumtemperatur (RT) ungestört in der Haube aufbewahren, um eine gleichmäßige Beschichtung zu erhalten.
      HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung von Schalen verbessert die Zellanhaftung. Alternativ können auch mit Gelatine überzogene T75-Kulturkolben verwendet werden.
   2. Bevor Sie die Zellen säen, saugen Sie die Gelatinelösung mit einer Vakuumpumpe ab. Der Vakuumdruck des verwendeten Absaugers betrug bis zu 724 mmHg.
      HINWEIS: Die Aspiration muss unmittelbar vor der Aussaat der Zellen erfolgen, um ein Austrocknen der Beschichtungslösung zu verhindern.
   3. Eine gefrorene Durchstechflasche mit HRMECs (aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff) entweder in einem Wasserbad bei 37 °C oder durch Zugabe eines warmen Wachstumsmediums in die Durchstechflasche auftauen. Nach dem Auftauen die Zellsuspension in 9 ml Wachstumsmedium überführen (unter der Annahme, dass die aufgetaute Durchstechflasche mit HRMECs 1 ml beträgt).
      HINWEIS: Die HRMECs wurden kommerziell erworben (Table of Materials). Das den Zellen zugesetzte Wachstumsmedium sollte vor Gebrauch immer auf 37 °C vorgewärmt werden.
   4. Drehen Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, um zu vermeiden, dass das Zellpellet entfernt wird.
   5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml Wachstumsmedium und geben Sie die resultierende Suspension auf eine mit Gelatine überzogene Petrischale. Halten Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂. Typischerweise sind HRMECs nach 72 h zu 70% -80% konfluent.
      HINWEIS: Das Wachstumsmedium wird jeden zweiten Tag gewechselt.
2. Subkultur von HRMECs auf durchlässigen Membraneinsätzen
   1. Bereiten Sie Zellkulturfiltereinsätze (6,5-mm-Einsätze mit 0,4 μm porengroßer Polycarbonatmembran, platziert in einer 24-Well-Platte) für die Aussaat von HRMECs vor, indem Sie jeden Einsatz (apikale Kammer) mit 200 μL 0,1% Gelatinelösung für 30 Minuten unter einer Laminar-Flow-Haube beschichten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Unterseite des Filtereinsatzes bedeckt.
      HINWEIS: Jede Vertiefung hat eine apikale und basolaterale Kammer, die durch eine poröse Membran getrennt ist.
   2. Nehmen Sie die Petrischale mit kultivierten HRMECs (Schritt 2.1.5.) aus dem Inkubator und saugen Sie die Wachstumsmedien ab. Spülen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit 10 ml 1x PBS unter einer Laminar-Flow-Haube, um potenzielle schwimmende/tote Zellen loszuwerden.
   3. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,5-1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und legen Sie die Petrischale für 5 min in den Inkubator (37 °C und 5%_CO2).
   4. Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 4,5-9 ml Wachstumsmedien und überführen Sie die Zellsuspension mit einer 10-ml-Pipette in ein 15-ml-Röhrchen.
   5. Drehen Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Wachstumsmedien.
   6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und säen Sie mit einer Dichte von 4 x 10⁴ Zellen pro Filtereinsatz (d.h. 1,25 x 10⁵ Zellen/cm²). Das Volumen der Zellsuspension für jeden Einsatz beträgt 250 μL.
   7. Die Beschichtungslösung wird aus den Vertiefungen mit durchlässigen Einsätzen abgesaugt und 250 μL der Zellsuspension pro Einsatz (apikale Kammer) überführt. Fügen Sie nur Medium (d.h. ohne Zellen) zu einem der Einsätze hinzu, das als “Blindkontrolle” für die TEER-Messung verwendet wird. Gleichzeitig fügen Sie auch 750 μL Medium pro Vertiefung in den basolateralen Kammern hinzu.
   8. Die 24-Well-Platte mit durchlässigen Einsätzen im Inkubator (37 °C und 5% CO2) 7-12 Tage aufbewahren, bis die kultivierten Zellen vollständig konfluent sind und der gewünschte TEER-Wert von ~20 Ω·_cm2 erreicht ist.
   9. Wechseln Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag. Während des Medienwechsels saugen Sie das Medium vorsichtig ab, um die Störung der Zellmonoschicht zu minimieren, und fügen Sie 250 μL bzw. 750 μL frisches Medium pro Vertiefung in die apikalen bzw. basolateralen Kammern hinzu.
      HINWEIS: Das Wachstumsmedium wird sowohl für die apikalen als auch für die basolateralen Kammern der Vertiefungen gewechselt.

3. TEER-Messungen (Abbildung 4)

1. Messen Sie am Tag 14 nach der Zellaussaat (Schritt 2.2.9) den TEER für HRMECs mit einem epithelialen Volt-Ohm-Meter (EVOM) elektrischen Widerstand (ER) System (Table of Materials) wie folgt.
2. Laden Sie das ER-System vor und überprüfen Sie die Zählerfunktionalität mit der STX04-Testelektrode. Bei Bedarf kalibrieren.
3. Verbinden Sie die Elektrode mit dem Messgerät und gleichen Sie die Elektrode aus, indem Sie sie zuerst für 15-20 Minuten in 70% Ethanol einweichen und dann kurz in das EGM-Wachstumsmedium der Zellkultur eintauchen.
4. In der Zwischenzeit halten Sie die zellhaltige 24-Well-Platte in der Laminar-Flow-Haube für 15-20 min bei RT, um den Temperaturausgleich zu erreichen.
   HINWEIS: TEER-Messungen werden von der Temperatur beeinflusst, daher ist der Gleichgewichtsschritt unerlässlich.
5. Für die TEER-Messung fügen Sie frisches Wachstumsmedium sowohl in die apikalen (250 μL) als auch in die basolateralen (750 μL) Kammern der Vertiefungen hinzu.
6. Führen Sie die TEER-Messung durch, indem Sie die Elektrode vorsichtig so eintauchen, dass sich die kürzere Spitze im Einsatz befindet und die längere Spitze den Boden der Vertiefung berührt. Messen Sie zuerst den Widerstand über die Leerzeichensteuerung. Messen Sie für jede Einlage TEER in dreifacher Ausfertigung.
   HINWEIS: Zum Spülen der Elektrode zwischen den Messungen werden Nährmedien verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in einem 90°-Winkel zur Unterseite des Einsatzes gehalten wird, um stabile Messwerte zu erhalten.
7. Berechnung des elektrischen Widerstands (in Ω·cm 2) über die Monoschicht nach der Formel TEER = Nettowiderstand (Ω) x Oberfläche des Filtereinsatzes (cm²); Hier ist der Nettowiderstand die Differenz zwischen dem Widerstand jeder Vertiefung (Wachstumsmedium mit Zellen) und der Leervertiefung (nur Wachstumsmedium).
8. Führen Sie eine weitere Behandlung der Zellen erst durch, wenn der TEER-Wert ~20 Ω·^cm2 erreicht. Wenn der gewünschte TEER-Wert nicht erreicht wird, bewahren Sie die Platte im Inkubator auf und messen Sie den TEER am nächsten Tag.
   HINWEIS: Die HRMEC-Konfluenz kann auch durch morphologische Untersuchung der Zellform (unter einem Mikroskop) mit typischer Kopfsteinpflastermorphologie und/oder durch das Vorhandensein von Zellverbindungsproteinen mit immunhistochemischer Färbung separat validiert werden.

4. Transzytose-Assay

1. Clathrin-vermittelter In-vitro-Transzytose-Assay mit Cy3-markiertem Transferrin (Abbildung 5)
   1. Bei Erreichen der Konfluenz mit TEER-Werten um 20 Ω·cm2 entzieht das Serum die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5%^CO2 unter Verwendung von 0,5% FBS in EBM (serumreduziertes Medium) in beiden Kammern (apikale Kammer: 250 μL und basolaterale Kammer: 750 μL) vor der Behandlung mit dem Liganden. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet.
   2. Die Zellen (unter Verwendung des serumreduzierten Mediums in Schritt 4.1.1.) werden in der apikalen Kammer mit fluoreszierendem (Cyanin 3)-markiertem Transferrinliganden (Cy3-Tf) (Endkonzentration von 40 μg/ml) für 60 min bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Platten, die Cy3-Tf enthalten, sollten vor Licht geschützt werden, um ein Photobleichen von Cy3-Tf zu vermeiden, indem Sie Aluminiumfolie einwickeln und das Experiment in einer Zellkulturhaube mit ausgeschaltetem Licht durchführen.
   3. Nach 1 h die Platte auf Eis legen und die Monoschicht apikal und basolateral 4x (3-5 min pro Waschgang) mit dem serumreduzierten Medium bei RT waschen, um das freie ungebundene Cy3-Tf zu entfernen.
      HINWEIS: Das Waschen ist unerlässlich, um freie Tracermoleküle zu entfernen und eine genaue Ablesung der Transzytose ohne mögliche Leckagen aus dem parazellulären Weg zu ermöglichen.
   4. Frisches, serumreduziertes Medium (wie in Schritt 4.1.1.) in die gründlich gewaschenen Filtereinsätze geben, die Zellen enthalten, und die Einsätze in frische Vertiefungen der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem serumreduziertem Medium überführen.
   5. Die Zellen für weitere 90 Minuten im Inkubator (37 °C und 5% CO₂) inkubieren und dann das Medium aus der basolateralen Kammer sammeln.
   6. Die Fluoreszenzintensität der Lösung aus der basolateralen Kammer wird mit einem Fluoreszenzdetektor aufgezeichnet. Die Fluoreszenzintensität, gemessen als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU), gibt die Menge an Cy3-Tf-Komplex an, die über die HRMEC-Monoschicht über Clathrin-abhängige Transzytose transzytiert wird.
2. Caveolae-vermittelter In-vitro-Transzytose-Assay mit HRP (Abbildung 6)
   1. Bei Erreichen der vollständigen Konfluenz mit TEER-Werten um 20 Ω·^cm2 entziehen Serum die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5% CO₂ unter Verwendung von 0,5% FBS-haltigem EBM-Medium (serumreduziertes Medium) vor der Behandlung (wie in Schritt 4.1.1.). Während des gesamten Assays wurde serumreduziertes EBM-Medium verwendet.
   2. Behandeln Sie die Zellen in der apikalen Kammer mit den gewünschten Behandlungen und Vehikelkontrollen.
      HINWEIS: Hier haben wir Wnt-Modulatoren als Beispiel verwendet, um die Regulation der Caveolae-vermittelten Transzytose durch den Wnt-Signalweg in HRMECs zu demonstrieren: humanes rekombinantes Norrin und Wnt-Inhibitor XAV939. In einem typischen Experiment wurden die Zellen für 24 h in einem Inkubator (37 °C und 5%_CO2) mit den folgenden Konzentrationen behandelt: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) und Vehikelsteuerungslösung. Darüber hinaus wurde auch Wnt3a-konditioniertes Medium (hergestellt aus L Wnt-3A-Zellen) verwendet.
   3. Die Zellen in der apikalen Kammer mit HRP (5 mg/ml) für 15 min bei 37 °C inkubieren.
   4. Anschließend die 24-Well-Platte auf Eis legen und die apikalen und basolateralen Kammern intensiv 6x mit P-Puffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM Glucose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) waschen_{, um} das freie extrazelluläre HRP zu entfernen.
      HINWEIS: Das Waschen ist unerlässlich, um freie Tracermoleküle zu entfernen und eine genaue Ablesung der Transzytose ohne mögliche Leckagen aus dem parazellulären Weg zu ermöglichen.
   5. Frisches, serumreduziertes Medium (wie in Schritt 4.1.1.) in die apikale Kammer geben und die Einsätze in eine frische Vertiefung mit vorgewärmtem Medium überführen.
   6. Die Monoschicht für weitere 90 min im Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2 inkubieren, bevor das Medium aus der basolateralen Kammer aufgefangen wird.
   7. Fügen Sie dem gesammelten Medium 100 μL HRP-fluorogenes Peroxidasesubstrat (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu und inkubieren Sie bei RT für 10 Minuten, bevor Sie die Reaktion mit 100 μL Stop-Lösung stoppen.
   8. Erfassen Sie die Konzentrationen des HRP-Substratreaktionsprodukts in den Medien mit einem Fluoreszenzplattenleser. Messung der Fluoreszenzintensität bei 420 nm Emissionswellenlänge (mit 325 nm Anregung) und als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU). Die Werte geben das Niveau der HRP an, die durch Caveolae-vermittelte Transzytose über die HRMEC-Schicht transzytiert wird.
      HINWEIS: Das hier verwendete fluoreszierende Produkt (Table of Materials) photobleichen nicht. Ein Lichtschutz gegen Photobleiche ist nicht erforderlich.

Representative Results

Discussion

BRB spielt eine wesentliche Rolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Netzhaut. In-vitro-Techniken zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität haben sich als entscheidende Werkzeuge in Studien zur Entwicklung und Funktion von Barrieren (BRB/BBB) erwiesen. Das hier beschriebene Verfahren könnte verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der EC-Transzytose zu untersuchen oder verwandte molekulare Modulatoren zu bewerten, die die BRB-Permeabilität beeinflussen. In vitro EC-Transzytose-Assays haben mehrere Vorteile gegenüber In-vivo-Assays oder Techniken zur Bewertung der vaskulären Permeabilität. Sie sind schnell mit hohem Durchsatz durchzuführen und können verwendet werden, um die Auswirkungen vieler verschiedener Variablen oder isolierter Moleküle spezifischer Signalwege mit genetischer und pharmakologischer Modulation zu analysieren. Das reine EC-Kultursystem vernichtet tierische Variationen, wie sie häufig in vivo beobachtet werden, und begrenzt auch die Auswirkungen einer möglichen Modifikation oder Endozytose der Zielmoleküle durch andere Zelltypen³². Die Handhabung von HRMEC-Zellen ist einfach und erfordert grundlegende Zellkulturgeräte, die in den meisten Laboratorien verfügbar sind, und die Zellkultur ist im Vergleich zu In-vivo-Tierversuchen oft kostengünstiger. Obwohl In-vitro-Transzytose-Assays die physiologischen In-vivo-Bedingungen³³ nicht vollständig replizieren, können sie wertvolle Werkzeuge sein, um In-vivo-Studien zu ergänzen und unser Wissen über die BRB-Kontrolle zu erweitern.

Mehrere wichtige technische Parameter müssen berücksichtigt werden, darunter die Porengröße des Filtereinsatzes, die Art des Substrats und die Zellaussaatdichte. Eine größere Porengröße der durchlässigen Filtereinsätze könnte zu einer unerwünschten Migration und zum Wachstum von Zellen auf der Unterseite des Einsatzes führen, was die resultierende Messung und ihre Interpretation durcheinanderbringt. Während diese Neigung mit den verschiedenen Zelltypen variieren kann, eignen sich Porendurchmesser ≤1 μm für die meisten Zelltypen, einschließlich ECs³⁴. Die Wahl eines geeigneten Substrats ist ein zweiter entscheidender Schritt, da einige Zellen eine höhere Polarität und größere Differenzierung aufweisen, wenn sie auf porösem Substrat gezüchtet und beidseitig in einem Kulturmedium gebadet werden^35,36. Behandelte mikroporöse Polycarbonatfilter sind eine bessere Alternative für ECs, da sie dünner sind und einen besseren Zugang der Reagenzien zur basolateralen Zone der Monoschicht mit minimaler Hintergrundfluoreszenz für Immunoassays^{bieten 35}. Um eine vollständig konfluente Monoschicht zu erreichen, muss schließlich die Zellaussaatdichte basierend auf dem spezifischen Zelltyp optimiert werden. Während eine zu geringe Seeding-Dichte den Differenzierungszustand beeinflussen könnte, könnte eine zu hohe Seeding-Dichte andererseits die schnelle Anheftung von Zellen begünstigen, die mehrere Zellschichten anstelle einer Monoschicht bilden, was schließlich die zelluläre Morphologie verändert und zu einer ungenauen Transzytosemessung führt³⁷.

Die Bildung und Integrität der EC-Monoschicht sind für diesen Assay entscheidend und können durch Messung von TEER-Werten validiert werden, um das Erreichen des gewünschten TEER sicherzustellen. Eine Blindkontrolle, d.h. ein Filtereinsatz ohne Zellen, sollte immer enthalten sein, um die basalen Widerstandsniveaus über die durchlässige Membran zu messen, die von denen von Zelleinsätzen subtrahiert werden sollen. Verschiedene Faktoren wie Temperatur, Zellpassagenzahl, Zusammensetzung des Kulturmediums, Kulturdauer und Änderungen der Verbindungslänge können geringfügige Abweichungen der TEER-Werte 25,38,39 verursachen. TEER-Werte werden auch durch bestimmte Behandlungen wie VEGF stark beeinflusst. Ursprünglich als potenter Induktor der Gefäßpermeabilität⁴⁰ entdeckt, beeinflusst VEGF die vaskuläre Permeabilität, indem es den parazellulären Transport reguliert, d. h. durch Phosphorylierung der Tight-Junction-Proteine ZO-1, Occludin und die Störung des Tight-Junction-Proteins Claudin-5 ^41,42 sowie den transzellulären Transport ⁴³ . Eine zusätzliche Validierung der Monoschichtbildung kann durch morphologische Untersuchung und das Vorhandensein charakteristischer Verbindungsproteine mit Färbung erfolgen. Während der gesamten Kultur wird empfohlen, die Medien sowohl in den apikalen als auch in den basolateralen Kammern in regelmäßigen Abständen zu wechseln, um die Zellen im optimalen Kulturzustand mit dem idealen pH-Bereich und der idealen Nährstoffverfügbarkeit zu halten.

Forscher, die diesen Assay verwenden, sollten auf ein kritisches inhärentes Merkmal von Gehirn- und Netzhaut-ECs achten: die apikobasale Polarität, die ein zelluläres Kennzeichen der BBB⁴⁴ und in ähnlicher Weise der BRB ist. Die Richtung der Transzytose wird durch die relative Verteilung der interessierenden Proteinzielrezeptoren und die zugehörige Transzytosemaschinerie in den apikalen/luminalen vs. basolateralen/abluminalen Domänen der EC-Membran bestimmt. Gehirn- und Netzhaut-ECs sind in der Lage, viele Faktoren sowohl von apikalen/luminalen als auch von basolateralen/abluminalen Membranen freizusetzen⁴⁴. Die Clathrin-abhängige Transzytose von Transferrin scheint interessanterweise meist unidirektional von der Blutseite zum Gehirn oder zur Netzhaut aufzutreten, da sich Transferrinrezeptoren überwiegend auf der apikalen/luminalen Membran⁴⁵ befinden. Die caveoläre Transzytose hingegen tritt bidirektional auf und kann entweder von der apikalen / luminalen oder basolateralen / abluminalen Membran und zur anderen Seite ausgehen, abhängig von der Lokalisation der Vesikelfracht und ihrer Rezeptoren⁴⁶. MFSD2A, ein Transmembran-Lipidrezeptor (für Omega-3-Fettsäuren Docosahexaensäure) und Suppressor der katolaren Transzytose, befindet sich ebenfalls auf den apikalen/luminalen Domänen von ECs^23,47. Die Expression von MFSD2A wird transkriptionell durch Wnt-Signalisierung reguliert, um ihre Auswirkungen auf die BRB-Kontrolle zu vermitteln, wie als Beispiel in diesem Protokoll²⁴ dargestellt. Die hier beschriebene Technik beinhaltet daher den Nachweis eines Tracermoleküls, das nach Aufnahme durch die EC-Monoschicht auf die obere/apikale Kammer gelegt und in die untere/basolaterale Kammer freigesetzt wird, wobei die Transzytose in Richtung apikal/luminal/Blut in basolaterale/abluminale/gewebeförmige Richtung nachgeahmt wird. Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um Transzytose in die entgegengesetzte Richtung zu erkennen, indem Tracermoleküle in der unteren Kammer platziert und die Aufnahme und Freisetzung in die apikale Kammer überwacht werden, um den Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Darüber hinaus würde bei Bedarf ein zusätzlicher Schritt zur Bestimmung der intrazellulären Akkumulation/des Abbaus des endozytosierten Tracer-gebundenen Zielmoleküls zu einer weiteren Messung der transzytotischen Vesikel führen, die im Zytosol³² verbleiben.

Der beschriebene Assay hat viele Vorteile und dient als wesentliches Werkzeug in BRB/BBB-bezogenen Studien, aber es gibt einige Einschränkungen. Es ist ein isoliertes System ohne Wechselwirkungen von anderen Zelltypen des iBRB, wie Perizyten und Gliazellen, und könnte daher die physiologische In-vivo-Umgebung nicht genau nachahmen. TEER-Werte können zwischen den Messungen aufgrund einer Änderung der Temperatur oder der Positionierung der Elektroden ^25,38 variieren. Die Äquilibrierung der Zellen von 37 °C auf Raumtemperatur vor den Messungen, die sorgfältige Handhabung der Elektroden und die Einbeziehung von Blindkontrollen können jedoch dazu beitragen, die Fluktuation zu minimieren. Darüber hinaus kann selbst bei ausreichendem Waschen ein Austreten aus dem parazellularen Weg, wenn auch in einer Spurenmenge, nicht vollständig ausgeschlossen werden. Überlappungen des HRP-Transports zwischen verschiedenen Transzytoserouten, beispielsweise zwischen katolarem Transport und Makropinozytose, die beide Clathrin-unabhängig sind, können ebenfalls auftreten. Bei Bedarf kann die Unterscheidung mit spezifischen Modulatoren und/oder Inhibitoren der Caveolae und Mikropinozytose weiter untersucht werden.

Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen In-vitro-Transzytose-Assay, der die Quantifizierung der Caveolae- oder Träger-vermittelten Transzytose über die BRB / BBB ermöglicht. Der In-vitro-Assay könnte beim Screening verschiedener pro-/antiangiogener Moleküle³¹, Signalwegmodulatoren²⁴ oder Arzneimittelabgabesysteme ^27,48 im Zusammenhang mit der BRB/BBB-Kontrolle von großer Hilfe sein. Auch die Untersuchung der EC-Polarität und der gerichteten Transzytose kann von diesem einfach zu bedienenden System profitieren. In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit von In-vitro-Modellen für die iBRB- und Augenforschung könnte das hier beschriebene Verfahren auch als Kokultursystem zusammen mit Perizyten, Astrozyten und organotypischen 3D-Kulturen⁴⁹ oder unter Verwendung fortgeschrittener zellbasierter Modelle wie mikrophysiologischer neurovaskulärer Systeme⁵⁰ modifiziert werden, um zelluläre Interaktionen weiter zu untersuchen und physiologische Bedingungen in vivo besser nachzuahmen.

Materials

Biological Safety Cabinet 	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish 	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge 	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin 	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180