Methodenartikel

Erstellung eines reproduzierbaren Modells der mütterlichen Immunaktivierung in der Mitte der Schwangerschaft unter Verwendung von Poly(I:C) zur Untersuchung der Suszeptibilität und Resilienz bei Nachkommen

DOI:

10.3791/64095

⸱

17. August 2022

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Infektion der Mutter ist ein Risikofaktor für neurologische Entwicklungsstörungen. Mausmodelle der mütterlichen Immunaktivierung (MIA) können die Auswirkungen der Infektion auf die Entwicklung und Funktion des Gehirns aufklären. Hier werden allgemeine Richtlinien und ein Verfahren bereitgestellt, um zuverlässig belastbare und anfällige Nachkommen zu erzeugen, die MIA ausgesetzt sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die mütterliche Immunaktivierung (MIA) während der Schwangerschaft ist durchweg mit einem erhöhten Risiko für neurologische Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrische Störungen bei den Nachkommen verbunden. Tiermodelle der MIA werden verwendet, um die Kausalität zu testen, Mechanismen zu untersuchen und Diagnosen und Behandlungen für diese Erkrankungen zu entwickeln. Trotz ihrer weit verbreiteten Verwendung leiden viele MIA-Modelle unter mangelnder Reproduzierbarkeit und ignorieren fast alle zwei wichtige Aspekte dieses Risikofaktors: (i) viele Nachkommen sind resistent gegen MIA, und (ii) anfällige Nachkommen können unterschiedliche Kombinationen von Phänotypen aufweisen. Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen und sowohl die Anfälligkeit als auch die Resilienz gegenüber MIA zu modellieren, wird die Baseline-Immunreaktivität (BIR) weiblicher Mäuse vor der Schwangerschaft verwendet, um vorherzusagen, welche Schwangerschaften entweder zu resistenten Nachkommen oder Nachkommen mit definierten Verhaltens- und molekularen Anomalien nach Exposition gegenüber MIA führen werden. Hier wird eine detaillierte Methode zur Induktion von MIA durch intraperitoneale (i.p.) Injektion der doppelsträngigen RNA (dsRNA) viralen Mimik Poly(I:C) nach 12,5 Tagen der Schwangerschaft bereitgestellt. Diese Methode induziert eine akute Entzündungsreaktion im Muttertier, die bei Mäusen zu Störungen der Gehirnentwicklung führt, die sich auf ähnlich betroffene Domänen bei menschlichen psychiatrischen und neurologischen Entwicklungsstörungen (NDDs) abbilden.

Einleitung

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Epidemiologische Beweise verbinden eine Infektion der Mutter mit einem erhöhten Risiko für psychiatrische und NDDs, einschließlich Schizophrenie (SZ) und Autismus-Spektrum-Störung (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Das MIA-Mausmodell wurde entwickelt, um die Kausalität und die mechanistische Rolle von MIA in der Ätiologie dieser Erkrankungen zu testen, molekulare Biomarker zu identifizieren und sowohl diagnostische als auch therapeutische Werkzeuge zu entwickeln 4,6. Trotz der Nützlichkeit dieses Modells und seiner zunehmenden Popularität gibt es eine beträchtliche Variabilität der MIA-Induktionsprotokolle innerhalb des Feldes, was es schwierig macht, die Ergebnisse zwischen Studien zu vergleichen und die Ergebnisse zu replizieren 8,9. Darüber hinaus untersuchen die meisten Iterationen des Modells zwei wichtige translationale Aspekte von MIA nicht: (i) viele Nachkommen sind resistent gegen MIA, und (ii) anfällige Nachkommen können unterschiedliche Kombinationen von Phänotypen aufweisen8.

Um ein reproduzierbares MIA-Modell zu erstellen, sollten die Forscher mindestens ein quantitatives Maß für das Ausmaß der in Staudämmen induzierten MIA angeben. Um MIA während der Schwangerschaft zu induzieren, führt unser Labor intraperitoneale (i.p.) Injektionen der doppelsträngigen RNA durch, die polyinositisch nachahmt: Polycytidilsäure [Poly(I:C)]. Poly(I:C) induziert eine Immunkaskade ähnlich wie Influenzaviren, wie sie vom Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3)10 erkannt wird. Infolgedessen aktiviert Poly(I:C) die Akute-Phase-Reaktion, die zu einer schnellen Erhöhung der proinflammatorischen Zytokine 8,11,12 führt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Erhöhung von proinflammatorischen Zytokinen, einschließlich Interleukin-6 (IL-6), notwendig ist, um Verhaltensanomalien und Neuropathologie bei Nachkommen als Folge von MIA11,12,13 hervorzurufen. Daher ist der IL-6-Spiegel im mütterlichen Serum, der während seines Höhepunkts 2,5 h nach der Poly(I:C)-Injektion gesammelt wurde, ein überzeugendes quantitatives Maß für MIA, das verwendet werden kann, um die Ergebnisse zwischen Laboratorien innerhalb des Feldes zu vergleichen.

Um ein MIA-Modell zu generieren, das die translational wesentlichen Elemente der Resilienz und Suszeptibilität mit einem einzigen Induktionsprotokoll 8,14 adressiert, können Forscher typische Induktionsansätze mit der Charakterisierung der Basis-Immunreaktivität (BIR) der Mutter vor der Schwangerschaft kombinieren 8. Kürzlich wurde entdeckt, dass jungfräuliche weibliche C57BL/6-Mäuse eine breite Palette von IL-6-Reaktionen auf eine niedrig dosierte Exposition gegenüber Poly(I:C) vor der Schwangerschaft zeigen8. Es ist nur eine Untergruppe dieser Weibchen, die anfällige Nachkommen hervorbringt, und nur in bestimmten Größenordnungen der Immunaktivierung, wie sie durch die Kombination von BIR und Poly(I:C)-Dosis8 vorgegeben wird. MIA induziert Phänotypen in einem umgekehrten U-Muster; Nachkommen zeigen die größten Verhaltens- und molekularen Aberrationen, wenn Muttertiere mäßig immunreaktiv sind und das Ausmaß der mütterlichen Entzündung einen kritischen Bereich erreicht, aber nicht überschreitet8. Hier wird eine detaillierte Methode vorgestellt, wie sowohl belastbare als auch anfällige Nachkommen mit divergierenden Verhaltensphänotypen als Folge der Injektion von Poly(I:C) in der Mitte der Schwangerschaft zuverlässig erzeugt werden können.

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Protokoll

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Alle Protokolle werden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California-Davis durchgeführt.

1. Tierische Vorbereitung

  1. Halten Sie beim Erwerb von Tieren die folgenden Parameter konsistent, um eine maximale Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
    1. Anbieter und Standort des Anbieters: Wie bereits berichtet, zeigen Wildtyp-C57BL/6J-Mäuse je nach Anbieter unterschiedliche Reaktionen auf die gleiche Dosis von Poly(I:C)8. Wählen Sie einen Anbieter und eine Maussorte, die eine konsistente Reaktion zeigen. Für die Experimente hier zeigten C57BL/6-Mäuse, die aus Charles River gewonnen wurden, konsistente Verhaltensänderungen nach Exposition gegenüber MIA in der Mitte der Schwangerschaft, während diejenigen, die von Taconic gekauft wurden, eine größere Reaktion zeigten, mit einigen Unterschieden zwischen den Behandlungsgruppen im Vergleich zu Charles River-Mäusen8.
    2. Stamm: C57BL/6J-Mäuse werden am häufigsten verwendet, aber BTBR-Mäuse und andere Stämme zeigen unterschiedliche Reaktionen auf MIA9 in der Mitte der Schwangerschaft. Beachten Sie diese unterschiedlichen Reaktionen, da diese die Reproduzierbarkeit der Methode verbessern und eine potenzielle Variable sein können, die zu unterschiedlichen Ergebnissen bei Nachkommen beiträgt.
    3. Um eine minimale Variabilität zu gewährleisten, verwenden Sie für MIA-Studien8 nur jungfräuliche Weibchen und notieren Sie die Details in den Methoden deutlich.
    4. Alter bei Versand und Akklimatisierungszeitraum: Mäuse, die vor 7 Wochen ausgeliefert wurden, zeigen ein fehlreguliertes endokrines System15. Lassen Sie die Tiere mindestens 48 h16,17 akklimatisieren. Bestellen Sie Mäuse, die nach 7 Wochen (± 2 Tagen) versandt werden, und injizieren Sie sie nach 8 Wochen (± 2 Tagen).
    5. Alter bei der Paarung: Das Immunsystem der Tiere ist während ihrer gesamten Lebensdauer dynamisch. Achten Sie darauf, die Variabilität zu minimieren, indem Sie das Alter bei der Paarung/Injektion so konstant wie möglich halten18,19,20. Paaren Sie weibliche Mäuse nach 9 Wochen (± 2 Tagen). Verwenden Sie keine Männchen über 6 Monate zur Paarung.

2. Poly(I:C)-Chargenprüfung und -vorbereitung

  1. Bereiten Sie Poly(I:C) mit hohem Molekulargewicht wie unten beschrieben vor.
    1. Autoklav 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Lagerung. Resuspendiertes Poly(I:C) kann bei -20 °C gelagert werden, aber wiederholtes Auftauen kann die Wirksamkeit beeinträchtigen. Wasserbad auf 70 °C erhitzen.
    2. Unter Verwendung der sterilen Technik werden 10 ml sterile physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) mit einer Spritze zu lyophilisiertem Poly (I: C) gegeben. Im 70 °C heißen Wasserbad 15 min erhitzen, damit das vollständige Glühen möglich ist. Herausnehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    3. Geben Sie in einer sterilen Haube zusätzlich 40 ml physiologische Kochsalzlösung in die Flasche und drehen Sie sie mehrmals um, um sie zu mischen. Entfernen Sie den Deckel der Poly(I:C)-Flasche oder verwenden Sie eine Spritze, um sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu aliquotieren. Bei -20 °C lagern.
  2. Poly(I:C) mit gemischtem Molekulargewicht wird wie unten beschrieben hergestellt.
    1. Autoklav 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Lagerung. Resuspendiertes Poly(I:C) kann bei -20 °C gelagert werden, aber wiederholtes Auftauen kann die Wirksamkeit beeinträchtigen. Wasserbad auf 50 °C einstellen.
    2. Fügen Sie mit steriler Technik 10 ml steriles 0,9% NaCl zu lyophilisiertem Poly(I:C) hinzu und befestigen Sie den Deckel. Im 50 °C heißen Wasserbad 25 min erhitzen, damit das vollständige Glühen möglich ist. Herausnehmen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    3. Mit steriler Technik in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
  3. Verabreichen Sie Poly(I:C) durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen wie unten beschrieben.
    1. Wiegen Sie die Maus, um die genaue Dosierung zu bestimmen. Ziehen Sie mit einer 0,5-cm³-Insulinnadel resuspendiertes Poly (I: C) auf. Schrubben Sie die Maus und drehen Sie sie um, so dass der Bauch freigelegt wird.
    2. Führen Sie die Nadel mit der anderen Hand bis zu einer Tiefe von ca. 0,5 cm zwischen den vorderen beiden Brustwarzen in einem Winkel von ca. 45° ein.
    3. Ziehen Sie vor der Injektion fest, dass kein Blut oder Urin in die Spritze gelangt. Wenn eines der beiden Fälle auftritt, positionieren Sie die Nadel neu und versuchen Sie es erneut. Langsam injizieren. Wenn das Poly(I:C) heraussprudelt, war die Injektion wahrscheinlich subkutan. Eine erfolgreiche Injektion führt dazu, dass nach dem Einführen der Nadel nichts mehr gezogen wird und nach dem Entfernen keine Leckagen mehr vorhanden sind.
  4. Testen Sie die Potenz von MMW-Poly(I:C)-Chargen wie unten beschrieben8.
    1. Erhalten Sie die gewünschte Form von Poly (I: C). Einige Hersteller erlauben es Forschern, eine vollständige oder teilweise Charge zu halten, während die Wirksamkeit getestet wird, so dass später mehrere Flaschen gleichzeitig erhalten werden können. Typischerweise können diese lyophilisiert bei -20 °C über mehrere Jahre gelagert werden, wenn ein Gefriertauen vermieden wird.
    2. Besorgen oder züchten Sie 30 trächtige Muttertiere zum Testen. Führen Sie bei E12.5 i.p. Injektionen von 20, 30 und 40 mg/kg bei mindestens 10 Mäusen pro Dosis durch.
    3. Sammeln Sie 2,5 Stunden nach der Injektion Blut über die Schwanzblutung. Beachten Sie, dass sich peripheres Blut und Rumpfblut in den Zytokinspiegeln unterscheiden können, also halten Sie die Entnahmemethode innerhalb einer Studie konsistent.
    4. Lassen Sie das Blut über Nacht bei Raumtemperatur gerinnen. Nach 12-24 h werden die Blutproben bei 3.768 x g bei 4 °C für 8 min heruntergeschleudert. Sammeln Sie das Serum und lagern Sie es bei -80 °C, bis es analysiert ist.
    5. Isolieren Sie das Serum und messen Sie den IL-6-Spiegel über ELISA oder Luminex. Halten Sie die Messinstrumente konsistent, da die bei verschiedenen Modalitäten und Herstellern gemessene Gesamtkonzentration erheblich variabel ist. Bestimmen Sie das Ausmaß der IL-6-Reaktion, die erforderlich ist, um Phänotypen unter Verwendung einer Pilotkohorte zu induzieren.

3. Baseline-Immunreaktivitätstest (BIR)

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt das Schema der Schritte. Verwenden Sie für BIR-Tests ein anderes Molekulargewicht (I: C) als für Schwangerschaftstests, um die Wahrscheinlichkeit adaptiver Immunantworten auf die Verbindung zu verringern.

  1. Bestellen Sie jungfräuliche weibliche Mäuse, die im Alter von 7 Wochen versendet werden. Bei der Ankunft gruppieren und beherbergen Sie vier bis fünf Mäuse in einem Käfig und halten Sie die Gruppe bis zur Paarung untergebracht. Verwenden Sie eine Ohrkerbe oder ein anderes Identifikationssystem.
  2. Injizieren Sie Frauen 1 Woche nach der Ankunft intraperitoneal 5 mg/kg Poly(I:C). 2,5 Stunden nach der Injektion, wenn die zirkulierende IL-6am höchsten 6 ist, wird Vollblut von injizierten Tieren per Schwanzschnitt entnommen.
  3. Lassen Sie das Blut über Nacht bei Raumtemperatur gerinnen. Nach 12-24 h werden die Blutproben bei 3.768 x g bei 4 °C für 8 min heruntergeschleudert.
  4. Sammeln Sie mindestens 32 μl Serum aus jeder Probe. Bei -80 °C einfrieren, bis der Test auf Zytokine möglich ist. Um die IL-6-Spiegel möglichst konsistent zu messen, verwenden Sie einen Multiplex-Assay wie Luminex. Halten Sie die Messinstrumente konsistent, da die bei verschiedenen Modalitäten und Herstellern gemessene Gesamtkonzentration erheblich variabel ist.
    1. Informationen zum Luminex-Assay-Protokoll finden Sie in Bruce et al.21.
  5. Unterteilen Sie die Tiere anhand der relativen IL-6-Spiegel in BIR-Gruppen mit niedrigem (unteres Quartil), mittlerem (mittlere zwei Quartile) und hohem (höchstes Quartil).

4. Schwanzblutungsmethode zur Blutentnahme

HINWEIS: Um die Verwendung von potenziell immunmodulatorischen Beruhigungsmitteln zu vermeiden, verwenden Sie die Schwanzblutungsmethode der Blutentnahme.

  1. Stellen Sie zum Einrichten einen Lötständer und einen Rückhaltebecher auf eine Oberfläche an der Seite der nicht dominanten Hand. In eine 35-mm-Petrischale 1-2 ml Speiseöl in Lebensmittelqualität geben. Entfernen Sie die Kappe vom schnellen Blutstopper und platzieren Sie sie in der Nähe des Setups.
  2. Legen Sie ein paar Lagen Papiertuch auf den Lötständer und das erste Kapillarröhrchen in einen Clip und positionieren Sie es in der Nähe der Stelle, an der die Schwanzspitze der Maus gehalten wird, und halten Sie sie parallel zur Tischoberfläche. Halten Sie eine Rasierklinge bereit.
  3. Um das Blut zu sammeln, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Nehmen Sie die Maus zum gewünschten Zeitpunkt aus dem Käfig und legen Sie sie unter die Tasse, wobei der Schwanz aus der Kerbe an der Basis herauskommt. Schneiden Sie mit einer frischen Rasierklinge das Ende (1-2 mm) des Schwanzes ab und sammeln Sie den ersten Blutstropfen in dem Kapillarrohr, das am Lötständer befestigt ist.
    2. Tauchen Sie die Finger der dominanten Hand in das Speiseöl und drücken Sie sie von der Basis des Schwanzes bis zur Spitze, wobei Sie die Schwanzspitze zum Kapillarrohr führen, um die resultierenden Blutstropfen zu sammeln. Fahren Sie fort, bis ~200 μl Blut entnommen wurden.
    3. Setzen Sie eine kleine Endkappe auf das sich verjüngende Ende des Kapillarrohrs vor der oberen Kappe. Wenn die obere Kappe zuerst aufgesetzt wird, wird die Probe aus dem sich verjüngenden Ende des Röhrchens ausgestoßen. Setzen Sie den Schlauch in die schützende Außenhülle ein.
    4. Über Nacht bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Kühlen Sie eine Mikrozentrifuge auf 4 °C ab und schleudern Sie das Blut wie in Schritt 3.3 angegeben.

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Abbildung 1. Der Zeitplan für die Prüfung der Immunreaktivität und Paarung von jungfräulichen Weibchen. Bestellen Sie Mäuse, die im Alter von 7 Wochen ankommen, und lassen Sie sie sich 1 Woche lang an die Einrichtung gewöhnen. Den Tieren werden 5 mg/kg Poly(I:C) injiziert und 2,5 h später Blut entnommen. Das Blut über Nacht gerinnen lassen, dann bei 3.768 x g, 4 °C 8 min zentrifugieren. Sammeln Sie Serum und beurteilen Sie die relativen IL-6-Spiegel über ELISA oder Multiplex. Stellen Sie im Alter von 9 Wochen Paarungspaare auf. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Gewichtsbasierte Methode zur Paarung und Schwangerschafts-E12.5-Injektion

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt das Schema der Schritte. Zwei Methoden können verwendet werden, um Paarpaare einzurichten und den E12,5-Zeitpunkt zu bestimmen. Die erste, die zeitgesteuerte Paarung, wird an anderer Stelle22 beschrieben. Gewichtsbasierte Berechnungen können auch verwendet werden, um eine E12,5-Schwangerschaft zu beurteilen23. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass das Alter der Mutter bei der Paarung zeitlich begrenzt werden kann, wodurch die Variabilität der Immunantwort verringert wird. Dieses Verfahren wird hier verwendet.

  1. Setzen Sie die Männchen in saubere Käfige und lassen Sie sie mindestens 2 Stunden lang akklimatisieren. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit weiblicher Aggression, da Männchen bereits einen dominanten Geruch im Käfig bilden.
  2. Stellen Sie einzelne männliche und einzelne weibliche Brutpaare auf, indem Sie das Weibchen in den Käfig des Männchens geben. Bevor Sie sie in den Käfig legen, wiegen Sie sie und notieren Sie das Gewicht. Geben Sie eine kleine Handvoll Sonnenblumenkerne in jeden Käfig, um die Paarungseffizienz zu erhöhen.
  3. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um den Bereich der Gewichtszunahme zu bestimmen.
    1. Besorgen Sie sich eine Testgruppe von Weibchen und stellen Sie Paarungspaare auf, wobei Sie das Gewicht zum Zeitpunkt der Paarung aufzeichnen.
    2. Wenn Frauen sichtbar schwanger erscheinen, wiegen Sie sie und teilen Sie sie in Teilmengen von 8,5 g, 9,5 g, 10,5 g und 11,5 g Gewichtszunahme auf. Föten bei E12.5 haben gerade erst begonnen, deutliche Finger in ihren Pfoten zu entwickeln. Verwenden Sie die fetale Morphologie, um die durchschnittliche Gewichtszunahme zu bestimmen, um E12,5 zu erreichen.
  4. Wiegen Sie 12 Tage nach der Paarung die Weibchen und bestimmen Sie die Gewichtszunahme. In einer Versuchsanlage nehmen die Weibchen ab dem Zeitpunkt der Paarung konstant 9,5-10,5 g an E12,5 g zu. Die in Schritt 2.3.2 ermittelte Dosis von gelöstem Poly(I:C) wird über i.p. injiziert, wenn die Gewichtszunahme der Frau in den vorgegebenen Bereich fällt.
  5. Beobachten Sie die Reaktion auf MIA in Dämmen anhand der folgenden Parameter.
    1. Krankheitsverhalten: Sammeln Sie subjektive Werte auf einer Skala von 1-3 dafür, wie aktiv Muttertiere als Reaktion auf den Umgang werden, wobei 1 wenig oder keine Bewegung als Reaktion auf den Umgang ist und 3 eine normale Reaktion auf das Fangen und Zurückhalten ist. Tiere mit stärkeren Immunantworten zeigen weniger Resistenz gegen den Umgang mit8.
    2. Fieberreaktion: Erfassen Sie mit einem IR-Thermometer die Temperaturen vor der Injektion und 2,5 h nach der Injektion. Tiere mit stärkeren Immunantworten zeigen häufig eine Unterkühlung als Reaktion auf eine größere Immunaktivität8.
    3. Gewichtsveränderung: Wiegen Sie die Tiere 24 Stunden nach der Injektion. Tiere mit stärkeren Immunantworten verlieren im Allgemeinen mehr Gewicht8.
    4. Messen Sie die IL-6-Spiegel während der Schwangerschaft wie folgt:8.
      1. Sammeln Sie 2,5 Stunden nach der Injektion Blut mit der bevorzugten Methode. Lassen Sie das Blut über Nacht bei Raumtemperatur gerinnen. Nach 12-24 h werden die Blutproben bei 3.768 x g bei 4 °C für 8 min heruntergeschleudert.
      2. Sammeln Sie das Serum und lagern Sie es bei -80 °C, bis es analysiert ist. Isolieren Sie das Serum und messen Sie den IL-6-Spiegel über ELISA oder Luminex. Halten Sie die Messinstrumente konsistent, da die bei verschiedenen Modalitäten und Herstellern gemessene Gesamtkonzentration erheblich variabel ist.
      3. Unterbringen Sie den Damm nach der Injektion einzeln mit entsprechender Anreicherung wie Nestlets und Anreicherungsvorrichtungen. Halten Sie alle Anreicherungen konsistent, da Änderungen in der Anreicherung erhebliche Auswirkungen auf das Verhalten von Nagetieren haben können 24,25,26,27,28,29.
  6. Die Tragzeit für C57-Mäuse liegt zwischen 18,5 und 20,5 Tagen. Führen Sie Wurfkontrollen durch, um festzustellen, ob Tiere in diesem Bereich geboren wurden, um sicherzustellen, dass die Injektion zum richtigen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Wenn Sie nach Einstreu suchen, stören Sie den Käfig so wenig wie möglich. Stress unmittelbar nach der Geburt des Wurfes kann das Risiko einer Kannibalisierung erhöhen.

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Abbildung 2. MIA-Induktion. Die MIA-Induktion erfordert die Beurteilung der Schwangerschaft, die i.p. Injektion von Poly(I:C) und Wurfkontrollen, um den korrekten Zeitpunkt der mütterlichen Entzündung sicherzustellen. Nach der Beurteilung des Schwangerschaftstages entweder durch zeitgesteuerte Paarung oder die Gewichtszunahmemethode eine i.p. Injektion von Poly(I:C) bei E12,5. Entnahme einer Blutprobe 2,5 Stunden nach der Injektion, um die Immunaktivierung zu bestätigen und den Grad der IL-6-Aktivierung zu bestimmen. Würfe werden bei ungefähr E18,5-E20,5 geboren. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Untersuchung von Verhaltensänderungen bei adulten MIA und Kontrollnachkommen (optional)

  1. Beginnen Sie bei P60 und vor der Durchführung von Verhaltenstests, gewöhnen Sie die Tiere an 3 aufeinanderfolgenden Tagen 1 Minute am Tag mit sanfter Handhabung an den menschlichen Kontakt. Stellen Sie sicher, dass die Käfigwechseltage nicht am selben Tag stattfinden, an dem Verhaltenstests durchgeführt werden.
  2. Lassen Sie die Mäuse immer 30-60 Minuten lang im Testraum akklimatisieren, bevor Sie mit den Verhaltenstests beginnen. Verwenden Sie schwach beleuchtete (15-20 Lux) Räume, um Ängste zu minimieren.
  3. Platzieren Sie Mäuse für wiederholte Pflege allein in sauberen, einstreufreien Käfigen mit Deckeln. Nehmen Sie die Mäuse in diesen Käfigen 20 Minuten lang mit einer Kamera auf. Die ersten 10 Minuten dienen als Akklimatisierungsphase, die letzten 10 Minuten sind die Testphase.
  4. Bewerten Sie mithilfe gespeicherter Videos und einer Stoppuhr die kumulative Pflegezeit für jede Maus während des 10-minütigen Testzeitraums. Andere Verhaltensweisen, die aus diesen Videos bewertet werden können, sind Aufbäumen (auf Hinterbeinen stehen), Einfrieren und Springen8.
  5. Verwenden Sie andere gängige Tests für das MIA-Modell, wie z. B. Präpulshemmung (PPI) 14,30,31,32, offenes Feld12,33,34, sozialer 3-Kammer-Ansatz 13,35,36, neuartige Objekterkennung 37, y-Labyrinth 30, erhöhtes Plus-Labyrinth33 und Kontext-/Cued-Angstkonditionierung 38.
  6. Postnatales Immunoblotting8 (optional)
    1. Bei P0 schnell enthaupten und fötales Hirngewebe in HBSS sezieren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
    2. Die Proben werden mit einem Sondenbeschallungsgerät mit einer Amplitude von 20% für 5 s in 2x Laemmli-Puffer zerkleinert und dann bei 85 °C für 5 min denaturiert. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 16.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand auffangen und bei -80 °C lagern.
    3. Messen Sie den Gesamtproteingehalt mit einem handelsüblichen BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie Rinderserumalbumin als Kalibrierungsstandard.
    4. Dithiothreitol als Reduktionsmittel in einer Endkonzentration von 100 mM zu den Proben geben. Vor dem Laden auf ein Gel 2 Minuten auf 85 °C erhitzen.
    5. Lassen Sie 5 μg/Spur Protein unter reduzierenden Bedingungen auf 7,5% TGS-Gelen laufen und übertragen Sie sie elektrophoretisch auf PVDF-Membranen. Blockieren Sie Membranen mit blockierendem Puffer und inkubieren Sie mit ausgewählten Antikörpern.
    6. Dreimal mit TBS + 0,05% Tween 20 waschen und die Membranen 45 Minuten lang mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern inkubieren.
    7. Waschen Sie weitere vier Mal in TBS/Tween 20 und Bildergebnissen. Standardisieren Sie die Ergebnisse mit β-Tubulin, nachgewiesen mit Anti-β-Tubulin.

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Ergebnisse

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Nicht alle Tiere, die 30 mg/kg Poly(I:C) bei E12.5 ausgesetzt waren, zeugen Nachkommen mit konsistenten Verhaltensauffälligkeiten 8,31. Obwohl sowohl 30 mg/kg als auch 40 mg/kg Poly(I:C) zuverlässig Krankheitsverhalten bei Muttertieren hervorrufen, einschließlich verminderter Aktivität, unterkühlter Reaktionen und Gewichtsverlust, und auch signifikante Erhöhungen von IL-6 verursachen, wird nur eine Untergruppe von Würfen, die MIA ausgesetzt sind, Verhaltensauffäl...

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Diskussion

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Eine Infektion der Mutter verändert den Verlauf der Gehirnentwicklung beim Menschen und sowohl bei Nagetieren als auch bei nichtmenschlichen Primaten 4,5,7. Hier wird ein Verfahren zur Induktion von MIA in Mäusen zu einem Zeitpunkt in der Mitte der Schwangerschaft unter Verwendung von Poly(I:C) skizziert. Diese Methode beinhaltet die Bewertung von BIR vor der Schwangerschaft, was die Reproduzierbarkeit erhöht und die Möglichkeit...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Myka Estes für ihre Beharrlichkeit bei der Behandlung der Variabilität im MIA-Modell der Maus und allen Mitwirkenden in Estes et al.8 für ihre Arbeit, die zur Entwicklung des hier beschriebenen Methodenprotokolls geführt hat. Die hier berichtete Forschung wurde von NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) und NIMH T32MH112507 (K.P.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % NaCl physiologische endotoxinfreie KochsalzlösungSigma-Aldrich7647-14-5Steuerung und Vehikel für Poly(I:C)
35mm PetrischaleThomas Scientific1219Z45Wird verwendet, um Öl während der Schwanzblutung zu halten
7,5 % TGX-Gele Bio-rad4561084Optional
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966Optional
Anti-& beta;-TubulinMilliporeMAB3408Optional
Bio-Plex Pro Maus Zytokin Standards Gruppe IBio-rad171I50001
Bio-Plex Pro Reagenzkit mit flacher PlatteBio-rad171304070M
RinderserumalbuminThermoFisher23209Optional
ZentrifugeEppendorf5810ROptional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulinspritze mit 28G x 1/2 Zoll. Nadelspektrum552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10GOptional
UmweltanreicherungBio-servK3327 und K3322Optional
EthovisionNoldusEthovisionOptional
Fluorsecent-markierte SeondärkörperLi-Cor925-32213 und 925-68072Optional
Speiseöl in Lebensmittelqualität (wie Oliven, Raps oder Traubenkerne)Verschiedene AnbieterZur Schmierung des Schwanzes während des Schwanzblutens
HBSSThermoFisher14060040Optional
Polyinosit:PolycytidilsäureInvivogen#tlrl-pic-5Wird verwendet, um die BIR von Weibchen
zu etablieren Humane Mouse ReshemAIMS1000Wird verwendet, um Mäuse während des Schwanzes zu fesseln bleeds
Image Studio SoftwareLicor5.2Optional
Laemmli PufferBio-rad1610737EDUOptional
Luminex200ThermoFisherAPX10031
Microvette CB300 300μ l Serum-KapillarröhrchenSarstedt16.440.100
Polyinositin:Polycytidilsäure mit gemischtem MolekulargewichtSigma-Aldrich#P0913Schwangerschaftsinduktion von monoklonalen
AbCamab76063Optional
monoklonale anti-STAT3-Zellsignalisierung12640SOptionaler
BeobachterNoldusObserverOptional
Odyssey Blocking-Puffer (TBS)Li-cor927-50003Optional
Odyssey CLx BildgebungssystemLi-cor9140Optional
Omnipure PBSMillipore65054LOptional
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23227Optional
polyklonales anti_THPel-FreezP4101-150Optional
PVDF-MembranBio-rad162-0177Optional
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282Optional
SchnellblutverschlussPetco17140
Seal-Rite 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, natur unsterilUSA Scientific1615-5500
LötständerAmazonB08Y12QC73Wird verwendet, um das Kapillarrohr während des Schwanzblutens
zu halten SonnenblumenkerneBio-servS5137-1Zur Steigerung der Zuchteffizienz
Das Bio-Plex Pro Maus IL-6 Set,Bio-rad171G5007M
Tris-BasisFisher ScientificBP152-1Optional
Tween 20Bio-rad23209Optional
MIA-Anti-MEF2A

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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