Verwendung einer bipolaren Elektrode zur Erstellung eines Temporallappen-Epilepsie-Mausmodells durch elektrisches Anzünden der Amygdala

Summary

Die Amygdala spielt eine Schlüsselrolle bei der Temporallappenepilepsie, die in dieser Struktur entsteht und sich von ihr ausbreitet. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von Tiefenhirnelektroden mit Aufzeichnungs- und Stimulationsfunktionen. Es stellt ein Modell der medialen Temporallappenepilepsie vor, das von der Amygdala ausgeht.

Abstract

Die Amygdala ist einer der häufigsten Ursachen von Anfällen, und das Amygdala-Mausmodell ist für die Darstellung von Epilepsie unerlässlich. Allerdings haben nur wenige Studien das experimentelle Protokoll im Detail beschrieben. Dieser Artikel veranschaulicht den gesamten Prozess der Herstellung von Amygdala-Epilepsiemodellen mit der Einführung einer Methode zur Herstellung bipolarer Elektroden. Diese Elektrode kann sowohl stimulieren als auch aufzeichnen und so Hirnverletzungen reduzieren, die durch die Implantation separater Elektroden zur Stimulation und Aufzeichnung verursacht werden. Für die Langzeitaufzeichnung des Elektroenzephalogramms (EEG) wurden Schleifringe verwendet, um die durch Kabelsalat und Abfall verursachte Unterbrechung der Aufzeichnung zu beseitigen.

Nach periodischer Stimulation (60 Hz, 1 s alle 15 Minuten) der basolateralen Amygdala (AP: 1,67 mm, L: 2,7 mm, V: 4,9 mm) für 19,83 ± 5,742 Mal wurde bei sechs Mäusen ein vollständiges Anzünden beobachtet (definiert als Induktion von drei kontinuierlichen Episoden des Grades V, klassifiziert nach der Racine-Skala). Ein intrakranielles EEG wurde während des gesamten Anzündprozesses aufgezeichnet, und nach dem Anzünden wurde ein epileptischer Ausfluss in der Amygdala beobachtet, der 20-70 s dauerte. Daher ist dies ein robustes Protokoll zur Modellierung von Epilepsie, die von der Amygdala ausgeht, und die Methode ist geeignet, die Rolle der Amygdala bei der Temporallappenepilepsie aufzudecken. Diese Forschung trägt zu zukünftigen Studien über die Mechanismen der mesialen Temporallappenepilepsie und neuartiger Antiepileptogene Medikamente bei.

Introduction

Die Temporallappenepilepsie (TLE) ist die häufigste Form der Epilepsie und birgt ein hohes Risiko für die Umwandlung in arzneimittelresistente Epilepsie. Operationen, wie die selektive Amygdalohippocampektomie, sind eine wirksame Behandlung für TLE, und die Epileptogenese und Iktogenese der Krankheit werden noch untersucht ^1,2. Es wurde gezeigt, dass die Pathogenese der TLE nicht nur im Hippocampus, sondern auch in großem Umfang in der Amygdala auftritt ^3,4. Zum Beispiel wurden sowohl Amygdalasklerose als auch Amygdala-Vergrößerung häufig als Ursprünge von TLE-Anfällen berichtet ^5,6. Die Bedeutung der Amygdala darf nicht unterschätzt werden; Ein Amygdala-Modell ist für die Untersuchung der Epileptogenese unerlässlich, und eine klare Darstellung dieses Modells ist dringend erforderlich.

Es wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, um Anfälle in Tiermodellen zu induzieren. In der Vergangenheit wurden Krampfmedikamente in einem frühen Stadium intraperitoneal injiziert⁷. Obwohl diese Methode praktisch war, war die Lage der epileptischen Herde ungewiss. Mit der Entwicklung der stereotaktischen Technologie und eines detaillierten Tierhirnatlas wurde die intrakranielle Arzneimittelinjektion angewendet, um das Problem der Lokalisierung zu lösen⁸. Ein Mangel an Intervention bei schweren Anfällen im akuten Stadium führte jedoch zu einer hohen Sterblichkeitsrate, und chronische spontane Anfälle gingen mit dem Problem der instabilen interiktalen und Anfallshäufigkeit einher ^9,10. Schließlich wurde das elektrische Anzündverfahren entwickelt; Bei dieser Methode werden bestimmte Hirnregionen in regelmäßigen Abständen mehrmals stimuliert, so dass Anfälle mit einer bestimmten Kontrolle sowohl des Ortes als auch des Beginns induziert werden^{können 11}.

Ein Vorteil dieser Methode ist, dass die intrakranielle Implantation von Elektroden minimalinvasiv ist¹². Darüber hinaus ist die Schwere des Anfalls durch die Beendigung der Reize kontrollierbar, wodurch die durch die Anfälle verursachte Mortalität verringert wird. Diese Änderungen lösten die Unzulänglichkeiten der bisherigen Ansätze. Insbesondere kann dieses Modell menschliche Anfälle adäquat nachahmen und eignet sich besonders für die Untersuchung des Status epilepticus (SE), da es in der Lage ist, SE schnell zu induzieren¹³. Es kann auch für das Antiepileptika-Screening¹⁴ und in Studien zum Mechanismus der Epilepsie verwendet werden. Schließlich ist bekannt, dass die Amygdala eng mit der Gedächtnismodulation, der Belohnungsverarbeitung und der Emotion verbunden ist¹⁵. Störungen dieser mentalen Funktionen treten häufig bei Epilepsiepatienten auf, und daher kann das Amygdala-Epilepsiemodell eine bessere Wahl für die Untersuchung emotionaler Probleme bei Epilepsie sein¹⁶.

Protocol

Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für Versuchstiere des Xuanwu-Krankenhauses der Capital Medical University genehmigt. Alle Mäuse wurden im Tierlabor des Xuanwu-Krankenhauses der Capital Medical University gehalten. Dieses Protokoll gliedert sich in vier Teile. In den ersten beiden Teilen wird das Verfahren zum Aufbau der Elektrode und des Stromkreises unter Verwendung eines Schleifrings zum Verbinden der Elektroden und des EEG-Aufzeichnungs-/Stimulationsgeräts vorgestellt. Der dritte Teil beschreibt die Operationsmethode der Elektrodenimplantation, und der vierte Teil stellt die EEG-Aufzeichnungs- und Stimulationsparameter vor, die für das Amygdala-Epilepsiemodell verwendet werden.

1. Herstellung von Elektroden

1. Halten Sie die folgenden zuvor vorbereiteten Materialien bereit: zwei 3 cm lange Stücke teflonbeschichteter Wolframdraht (blanker Durchmesser: 76,2 μm), ein Stück Silberdraht (blanker Durchmesser: 127 μm) gleicher Länge und ein Satz 2 x 2 gekämmte Reihenstifte.
2. Verwenden Sie ein Feuerzeug, um ein Ende jedes Wolframdrahtes zu verbrennen, um 5 mm der Isolierschicht zu entfernen.
   HINWEIS: Der Wolframdraht mit entfernter Isolierung wird schwarz; Dieser Teil des Wolframdrahtes wird als oberes Ende bezeichnet.
3. Schälen Sie ein Stück ultrafeinen mehradrigen Drahtes ab und wickeln Sie ihn von unten nach oben, wo er dunkel wird und sich nach oben fortsetzt. Kombinieren Sie diesen superfeinen Draht (hat eine weiche Textur) mit dem Wolframdraht, indem Sie ein Ende einklemmen und das andere Ende vorsichtig drehen, wodurch die beiden Materialien leicht miteinander verflochten werden können.
4. Ziehen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie fest umwickelt sind, und schneiden Sie überschüssigen superfeinen Draht ab. Versuchen Sie, den Wolframdraht während des gesamten Vorgangs gerade zu halten.
5. Befestigen Sie den Reihenstift an der Klemme am Schweißtisch, wobei die längere Seite der Stifte nach außen zeigt. Nehmen Sie mit der Spritzennadel etwas Lötpaste auf und tragen Sie sie auf die Stifte auf. Erhitzen Sie den Schweißbrenner auf 320 °C; Schmelzen und schmieren Sie etwas bleifreien Zinndraht mit der Brennerspitze.
6. Überlappen Sie das obere Ende des Wolframdrahtes mit einer Nadel der Reihenstifte und verwenden Sie das Lot am Brenner, um den Wolframdraht mit dem Stift zu verbinden.
   HINWEIS: Es wäre sehr schwierig, den Wolframdraht ohne die Hilfe des superfeinen Drahtes direkt mit den Stiften zu schweißen.
7. Schweißen Sie einen weiteren Wolframdraht und einen weiteren Silberdraht auf die gleiche Weise an den Reihenstift, so dass jeder Draht einer Nadel entspricht (siehe Abbildung 1,i).
8. Schneiden Sie zwei Schrumpfschläuche etwas länger als das obere Ende des Wolframdrahtes. Legen Sie sie auf die Lötstelle von zwei Wolframdrähten und stellen Sie sicher, dass der leitende Teil vollständig im Rohr bedeckt ist, damit der Stromkreis der beiden Wolframdrähte nicht in Reihe geschaltet wird.
   HINWEIS: Obwohl es drei Drähte gibt, sind die drei Drähte nicht in Reihe, wenn zwei von ihnen isoliert sind. Dem Silberdraht kann auch ein Rohr hinzugefügt werden.
9. Entfernen Sie die Elektrode von der Schweißtischklemme und halten Sie die Elektrode vorsichtig mit einer großen Zange fest, da Elektroden beim Erhitzen des Schrumpfschlauchs leicht ihre Form verlieren können, indem Sie eine gute Wärmeleitfähigkeitsklemme mit etwas mehr Kraft verwenden.
10. Schalten Sie den Luftkanal ein und heizen Sie, bis eine Temperatur von 320 °C erreicht ist. Blasen Sie den Schrumpfschlauch einige Sekunden lang aus, bis er festgezogen ist (siehe Abbildung 1,ii).
11. Wenn sich die Nadeln während des Schweißvorgangs vom Kunststoffkörper lösen, spleißen Sie das Schweißteil und den Kunststoffkörper mit einem Schmelzklebstoff (siehe Abbildung 1,iii). Achten Sie darauf, es nicht auf die Schnittstelle zu schmieren, da dies das Einfügen der Schnittstelle beeinträchtigen würde.
12. Halten Sie die beiden Wolframdrähte fest und verdrehen Sie sie zusammen, wobei Sie ihre Enden auseinander halten (siehe Abbildung 1, iv). Kürzen Sie die verdrillten Wolframdrähte auf eine Länge von ca. 10 mm, so dass der Abstand an den Enden 0,5 mm nicht überschreitet.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann auch vor der Elektrodenimplantation durchgeführt werden, um eine flexible Anpassung der Elektrodenlänge zu ermöglichen.
13. Erhitzen Sie die Klebepistole und tragen Sie den Kleber gleichmäßig um die Elektrode auf.
14. Überprüfen Sie die Elektroden mit einem Multimeter: Legen Sie einen Stab des Multimeters auf die ungeschweißte Seite der Reihenstifte und berühren Sie vorsichtig das Ende des Wolframdrahts oder Silberdrahts mit dem anderen Stab, um zu prüfen, ob der Stromkreis glatt ist. Stellen Sie sicher, dass die Linien nicht in Reihe geschaltet sind.

2. Schleifringverbindung und Schaltungsbeschreibung

HINWEIS: Wenn die Elektroden der Mäuse über Kabel in einem frei beweglichen Zustand an ein EEG-Gerät angeschlossen werden, können sich die Kabel verheddern, wenn sich die Mäuse bewegen und drehen. Dies führt dazu, dass die Kabel kürzer werden, was die Mäuse schließlich daran hindert, sich zu bewegen, oder dazu führt, dass die Kabel von ihren Köpfen fallen. Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird ein vierkanaliger Schleifring eingeführt, um ein Herunterfallen der Kabel zu verhindern. Die vier Kanäle sind in Abbildung 1B in vier Farben dargestellt.

1. Ziehen Sie an jedem Ende 5 mm der Isolierhaut ab, um den Metalldraht im Inneren freizulegen.
2. Fügen Sie jedem Statordraht einen Abschnitt Schrumpfschlauch hinzu.
3. Schweißen Sie jeden Draht mit dem Anschlussstecker des EEG-Geräts.
4. Schrumpfen Sie den Schrumpfschlauch mit heißer Luft.
5. Fügen Sie jedem Rotordraht ein Stück Schrumpfschlauch hinzu.
6. Schrauben Sie die leitenden Teile der roten und orangefarbenen Drähte zusammen und schweißen Sie sie an eine Verbindung in der Stiftleiste, um den Reihenstift zu montieren.
7. Schweißen Sie die anderen beiden Drähte am Header an jede Verbindung.
   HINWEIS: Der braune Kanal, der dem Silberdraht entspricht, ist zur Erdung mit dem EEG-Gerät verbunden. Die roten und orangefarbenen Kanäle empfangen Signale von demselben Wolframdraht, und der orangefarbene Kanal dient als Referenz für das EEG-Gerät. Die Signale im roten Kanal sind bedeutungslos, aber sie müssen mit dem schwarzen Kanal koexistieren, um einen Stromreiz zu bilden. Die Signale im schwarzen Kanal sind die wirklichen elektrischen Signale im Gehirn. Verschiedene Schaltungen können mit Mehrkanal-Schleifringen entworfen werden, um verschiedenen Geräten gerecht zu werden.

3. Chirurgie zur Implantation

1. Tiere
   1. Verwenden Sie 8 Wochen alte männliche C57BL/6-Wildtyp-Mäuse mit einem Gewicht von 24-26 g für Operationen.
   2. Legen Sie sie mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Lichtzeit: 8:00-20:00 Uhr) in eine temperaturkontrollierte Umgebung (22 ± 1 °C) und stellen Sie Wasser und Futter ad libitum zur Verfügung.
   3. Verwenden Sie eine zusätzliche Heizmatte, um die Tiere während der Operation warm zu halten.
   4. Nach der Operation injizieren Sie Meloxicam subkutan (10 mg/kg) als erste Verabreichung von Analgetika. Setzen Sie die Tiere dann in separate Käfige, um die Genesung zu optimieren. Fügen Sie Meloxicam in der ersten Woche nach der Operation zur Ernährung des Tieres hinzu.
   5. Infundieren Sie nach dem Experiment die linken Ventrikel der Mäuse unter Narkose mit 4% Paraformaldehyd und sammeln Sie das Hirngewebe zur histologischen Überprüfung des Elektrodenziels.
2. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie durch intraperitoneale Injektion von 1% Pentobarbitallösung. Sterilisieren Sie alle zu verwendenden chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien, einschließlich Bohrer, Elektroden, Zahnzement usw., durch Autoklavieren.
3. Wenn die Maus vollständig betäubt ist, rasieren Sie die Haare vom Auge bis zum Ohrbereich mit einem Rasiermesser.
4. Befestigen Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie die vorderen oberen Zähne in den Schneidezahn ein und führen Sie beide Ohrstangen gleich tief in die Ohren ein. Tragen Sie Erythromycin-Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit und Blindheit durch helles Licht während der Operation zu verhindern.
5. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Tupfern Jodophor und 75% Alkohol in kreisenden Bewegungen. Machen Sie dann einen sagittalen Einschnitt von der Mitte dieses Einschnitts nach vorne und schneiden Sie die Haut auf beiden Seiten des Einschnitts ab, um ein dreieckiges Fenster zu schaffen.
6. Rollen Sie ein kleines Stück Baumwolle zu einer Kugel und befeuchten Sie es mit 3% Wasserstoffperoxid. Entfernen Sie das am Schädel befestigte Weichgewebe, indem Sie den exponierten Bereich vorsichtig mit einem kleinen Wattebausch abreiben, bis die vordere und hintere Fontanelle deutlich zu sehen sind.
7. Stellen Sie die vordere und hintere Höhe so ein, dass sich die vordere und hintere Fontanelle in der horizontalen Position befindet. Betrachten Sie die Position der vorderen Fontanelle als Ursprung der Achsen.
8. Befestigen Sie eine Edelstahlschraube am linken Kleinhirnschädel und erstellen Sie mit einem Bohrer eine flache Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass die Schraube halb aus dem Schädel herausragt.
9. Stellen Sie sicher, dass die Koordinaten für das Anzünden der Amygdala -1,67 mm posterior, -2,7 mm lateral und -4,9 mm ventral vom Bregma entfernt sind. Stellen Sie das stereotaktische Gerät so ein, dass es diese Stelle lokalisiert und markiert.
10. Bohren Sie mit einem Schädelbohrer mit einem Durchmesser von 0,5 mm ein Loch in die markierte Stelle.
11. Befestigen Sie die Elektroden an der Aufnahmestange des stereotaktischen Geräts, platzieren Sie die Elektrode senkrecht über dem Loch und senken Sie die Position langsam auf -4,9 mm. Wickeln Sie den Silberdraht dreimal um die Schraube und achten Sie darauf, den Elektrodenkörper während des Betriebs nicht zu schütteln.
12. Mischen Sie den Zahnzement und tragen Sie ihn vorsichtig auf die Elektroden- und Schädeloberfläche auf. Wenn der Zahnzement aushärtet, modifizieren Sie die Außenseite, bis sich der Zement, der die feste Elektrode umschließt, in einen Kegel verwandelt.
13. Wenn der Zement ausgehärtet ist, lösen Sie die Elektrode von der stereotaktischen Vorrichtung. Verabreichen Sie Meloxicam 10 mg / kg subkutan, um Beschwerden zu lindern, die durch Schmerzen bei Tieren verursacht werden. Verabreichen Sie Meloxicam in der ersten Woche nach der Operation an Tierfutter zur analgetischen Wirkung. Entfernen Sie die Maus und legen Sie sie wieder in den Käfig, wobei Sie sie von den anderen Mäusen getrennt halten.

4. Elektrisches Anzünden

1. Lassen Sie die Mäuse nach der Operation mindestens 1 Woche ruhen, bevor Sie sie anzünden, um eine postoperative Genesung zu ermöglichen und die Entzündung abklingen zu lassen.
   HINWEIS: Im Allgemeinen reagieren Mäuse, die sich nicht ausreichend erholt haben, nicht gut auf das Anzünden.
2. Legen Sie die Maus in eine maßgeschneiderte Box mit Schleifringkabeln, die die Elektrode am Mauskopf und das EEG-Gerät verbinden. Führen Sie das Kabel durch ein Loch im Deckel der Box und passen Sie die verbleibende Länge in der Box an, damit sich die Maus frei bewegen kann.
3. Schalten Sie das EEG-Gerät ein und prüfen Sie, ob es ordnungsgemäß funktioniert. Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er 1 ms monophasische Rechteckimpulse bei 60 Hz für eine Zugdauer von 1 s liefert.
4. Beginnen Sie mit einer Stromstärke von 50 μA für die erste Stimulation; Überwachen Sie das EEG auf Nachentladung, die durch hochfrequente Spitzen gekennzeichnet ist. Wenn keine Nachentladung beobachtet wird, fügen Sie dem nächsten Stimulus 25 μA hinzu und setzen Sie diesen Vorgang alle 10 Minuten fort, bis eine Nachentladung beobachtet wird und 5 s dauert.
   HINWEIS: Wenn für das Experiment keine Entladung erforderlich ist, kann Schritt 4.4 übersprungen werden. 300 μA sind stark genug für das Anzünden.
5. Stimulieren Sie die Maus mit der in Schritt 4.3 ermittelten Stromintensität alle 15 Minuten, nicht mehr als 20 Mal am Tag.
6. Überwachen Sie die Verhaltensreaktionen auf den Reiz.
   HINWEIS: Das Auftreten von drei aufeinanderfolgenden Episoden der Klasse V gilt als vollständiges Anzünden, kombiniert mit dem Racine-Rangstandard¹⁷.

Results

Die Elektrode und der Schaltkreis ermöglichen die Aufzeichnung des EEG und fungieren als Stimulation (Abbildung 1); Dieser Aufbau vermeidet die Komplexität, Elektroden separat zu implantieren, aufzuzeichnen und zu stimulieren, und minimiert die Schädigung des Hirngewebes. Die Anwendung von Schleifringen ermöglicht die Elektrodenverbindung mit allen Arten von Geräten.

Wir führten eine Elektrodenimplantation an sechs gesunden erwachsenen männlichen C57BL/6-Mäusen du...

Discussion

Epilepsie ist eine Gruppe von Krankheiten mit multiplen Manifestationen und vielfältigen Ursachen¹⁸; Es sollte beachtet werden, dass kein einziges Modell für alle Arten von Epilepsie verwendet werden kann, und die Forscher müssen ein geeignetes Modell für ihre spezifische Studie auswählen. Die vorliegende Studie stellt eine der am leichtesten zugänglichen Methoden der Elektrodenherstellung vor. Verschiedene Teile dieser Methode können angepasst werden, um sich an unterschiedliche Versuchsbedingung...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgG-Invitrogen		A-21206
c-Fos-Antikörper		ab222699
Schädelbohrer	SANS	SA302
Zahnzement	NISSIN
EEG-Aufzeichnungs- und Stimulationsgerät	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
bleifreier Zinndraht	BAKON
Stiftleiste / Buchsenleiste	XIANMISI		Abstand von 1,27 mm
Silberdraht	A-M Systeme	786000
Schleifring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Wolframdraht	A-M Systeme	796000
ultrafeiner Mehrständerdraht	Shenzhen Chengxing Draht und	für Kabel UL10064-FEP
	BAKON	BK881