Method Article

Isolierung und Verarbeitung von murinen weißen Adipozyten für Transkriptom- und Epigenomanalysen

DOI:

10.3791/64128

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June 16th, 2022

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1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll fasst eine universelle Methode zur Isolierung, Reinigung und vorgelagerten Verarbeitung von murinen weißen Adipozyten zusammen, die für die nachgeschaltete Gesamt-RNA-Sequenzierung, die Zellkernextraktion durch SONication (NEXSON) und ChIP-seq optimiert ist.

Abstract

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Fettleibigkeit ist eine komplexe Krankheit, die von Genetik, Epigenetik, der Umwelt und ihren Wechselwirkungen beeinflusst wird. Reife Adipozyten stellen den Hauptzelltyp im weißen Fettgewebe dar. Das Verständnis, wie Adipozyten funktionieren und auf (epi)genetische und Umweltsignale reagieren, ist für die Identifizierung der Ursache(n) von Fettleibigkeit unerlässlich. RNA und Chromatin wurden zuvor durch enzymatischen Verdau aus Aimpozyten isoliert. Darüber hinaus wurden Protokolle für die nukleare Isolierung entwickelt, bei der die Aufreinigung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von Adipozyten-spezifischen transgenen Reportern erreicht wird. Eine der größten Herausforderungen bei der Erzielung einer hohen Ausbeute und Qualität bei solchen Protokollen ist die erhebliche Menge an Lipiden, die im Fettgewebe enthalten sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes Verfahren zur Isolierung reifer Adipozyten, bei dem Heptan genutzt wird, um Lipide von den gewünschten Zielen (RNA/Chromatin) zu trennen. Die resultierende RNA hat eine hohe Integrität und erzeugt qualitativ hochwertige RNA-seq-Ergebnisse. Ebenso verbessert das Verfahren die Kernausbeute und erzeugt reproduzierbare ChIP-seq-Ergebnisse über Proben hinweg. Daher bietet die aktuelle Studie ein zuverlässiges und universelles Protokoll zur Isolierung von Mausadipozyten, das für Transkriptom- und Epigenomstudien des gesamten Genoms geeignet ist.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Adipositas versteht man in der Regel eine Erkrankung der übermäßigen Fettansammlung, die zu einem erhöhten Risiko für Typ-2-Diabetes, kardiometabolische Erkrankungen und verschiedene Formen von Krebs beiträgt 1,2,3. Während das derzeitige Verständnis von Fettleibigkeit stark in der Genetik verwurzelt ist (sowohl aus Human- als auch aus Nagetierstudien), sind etwa 30 % bis 70 % der Veranlagung für Stoffwechselerkrankungen nicht-genetischen Ursprungs 4,5,6,7,8 und nach wie vor unklar.

Fettgewebe spielt eine entscheidende Rolle bei Fettleibigkeit und anderen Stoffwechselerkrankungen 9,10. Fettgewebe umfasst reife Adipozyten und die stromale Gefäßfraktion, einschließlich Präadipozyten, Endothelzellen und Immunzellen. Es ist noch unklar, wie jeder Zelltyp zu Fettleibigkeit beiträgt und wie die Dysregulation der Adipozyten zur Fettleibigkeit beiträgt. Reproduzierbare und effektive Isolierungs- und Aufreinigungsprotokolle für reife Adipozyten-Epigenomstudien sind für das Feld von Interesse.

Reife Adipozyten werden seit langem für Genexpressionsanalysen11 und Epigenomstudien 12,13 isoliert. Es gibt zwei Hauptstrategien zur Isolierung von Adipozyten. Die erste besteht darin, die reifen Adipozyten durch enzymatische Verdauung von den übrigen Zelltypen in der stromalen Gefäßfraktion zu trennen11,14. Die zweite besteht darin, das Fettgewebe so zu düngen, dass intakte Zellkerne freigesetzt werden, und dann die Kerne auf der Grundlage eines fluoreszierenden Reporters durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)12,13 zu gewinnen, was spezielle transgene Reportermodelle erfordert. Die technische Herausforderung besteht jeweils darin, dass reife Adipozyten hohe Konzentrationen an Lipiden enthalten (Abbildung 1), was die Qualität und/oder Ausbeute der Gesamt-RNA15,16 und der Zellkerne17 verringert. Hierbei wird ein optimiertes enzymatisches Verdauungsverfahren zur Isolierung reifer Adipozyten beschrieben, bei dem der Vorteil des Heptans darin besteht, Lipide18 vor der RNA-Extraktion schnell und effizient aufzulösen und zu entfernen, bzw. die Zellkernisolierungsschritte durch Nuclei Extraction by SONication (NEXSON)19. Das Protokoll gewährleistet eine hervorragende Rückgewinnung und Qualität der Gesamt-RNA für genomweite Studien und verbessert die Ausbeute an intakten Zellkernen für reproduzierbare ChIP-seq erheblich.

Protocol

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Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, Protokollnummer: 18-10-028. 12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden mit CO2 euthanasiert und präpariert, um die Fettpolster aus dem nebenhoden weißen Fettgewebe (eWAT) zu sammeln.

1. Isolierung von Adipozyten

  1. Bereiten Sie den Aufschlusspuffer vor (Tabelle 1) und erwärmen Sie ihn im Wasserbad auf 37 °C.
  2. Legen Sie das Fettpolster aus dem nebenhomeinen weißen Fettgewebe (eWAT) in eine Petrischale. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Pinzette und einem Skalpell in 5 mL DMEM in kleine Stücke (5 mm x 5 mm).
    HINWEIS: Eine Petrischale, die keine Zelladhäsionsbeschichtung enthält, wird bevorzugt. Es ist auch wichtig, das Fettpolster sanft zu halten, um die Zellen nicht zu beschädigen. Je mehr das Fettgewebe bearbeitet wird, desto mehr wird die Ausbeute beeinträchtigt. Eine Skalpell-/Zangenmethode ist dem Schneiden der Fettpolster mit einer Schere oder Pinzette allein vorzuziehen, da sie die Adipozyten schädigen können.
  3. Lassen Sie das überschüssige DMEM ab, ohne die Gewebeablagerungen zu stören.
    HINWEIS: Heben Sie die Gewebereste nicht von der Oberfläche der Petrischale auf.
  4. Geben Sie 5 ml Verdauungspuffer in die Petrischale, schwenken Sie, um Gewebefragmente aus der Schale freizusetzen, und gießen Sie den gesamten Inhalt in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Gewebefragmente in das Zentrifugenröhrchen überführt sind.
  5. Geben Sie den restlichen Aufschlusspuffer in das Zentrifugenröhrchen, so dass das endgültige Volumen ~20 mL beträgt.
  6. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in einem 37 °C heißen Schüttelwasserbad bei 100 U/min für 20-30 min oder bis die Gewebefragmente kleiner als 1 mm x 1 mm sind.
  7. Geben Sie 0,4 mL 0,5 M EDTA und 0,2 mL 0,5 M EGTA in das Zentrifugenröhrchen und schütteln Sie es 10 Minuten lang bei 37 °C.
  8. Die Zellsuspension wird mit einer 10-ml-Pipette durch einen Feinmatrixfilter (420 μm, siehe Materialtabelle) auf ein weiteres 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen, um das unverdaute Gewebe zu entfernen.
  9. Zentrifugieren Sie das 50-ml-Zentrifugenröhrchen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um reine Adipozyten (oben schwimmend) von der stromalen Gefäßfraktion (Pellet unten) zu trennen (Abbildung 2A).
  10. Gießen Sie die schwimmende Adipozytenschicht in ein neues 50-ml-Röhrchen und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu beschädigen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Pipettenspitzen zum Übertragen von schwimmenden Adipozyten, da diese an der Wand der Pipettenspitze haften bleiben können (was die Ausbeute verringert). Ein Teil des Verdauungspuffers wird in das neue Röhrchen übertragen; Verwenden Sie eine Spritze und eine Nadel, um den verbleibenden Verdauungspuffer unter der Adipozytenschicht zu entfernen.
  11. Verwenden Sie die gereinigten Adipozyten sofort für die Gesamt-RNA-Extraktion (Schritt 2.) und/oder ChIP-seq (Schritt 3 und Schritt 4).
    HINWEIS: Der Benutzer kann entscheiden, ob er den gesamten Adipozytenextrakt für Schritt 2 verwenden möchte. oder Schritt 3., je nach Forschungszweck. Der Benutzer kann auch den gesamten Adipozytenextrakt in zwei Teile aufteilen und mit Schritt 2 fortfahren. und Schritt 3. parallel, um Analyseergebnisse aus den biologisch identischen Proben zu erhalten.

2. Extraktion der Gesamt-RNA

HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in einer Chemikalienhaube durch.

  1. Das RNA-Isolationsreagenz (1 ml) (siehe Materialtabelle) zu den gereinigten Adipozyten im 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben (Schritt 1.11.).
  2. Pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und ab, um die Adipozyten im RNA-Isolationsreagenz gründlich aufzulösen, und übertragen Sie sie in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Geben Sie 0,5 mL Heptan in das Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es 30 s lang bei voller Geschwindigkeit.
    HINWEIS: Die Lipide lösen sich im Heptan auf (Abbildung 2B).
  5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  6. Entnehmen Sie die untere Schicht des RNA-Isolationsreagenzes mit einer Spritze und einer 30-g-Nadel und geben Sie sie in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
  7. Fügen Sie 0,1 ml 1Brom-3-Chlorpropan (siehe Materialtabelle) zum RNA-Isolationsreagenzextrakt hinzu und wirbeln Sie 30 s lang bei voller Geschwindigkeit ein. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  8. Das Röhrchen bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwenden Sie eine Pipette, um die obere wässrige Phase zu sammeln und in ein neues Röhrchen zu übertragen.
  9. 0,5 ml Isopropanol zugeben und 10 Minuten bei 4 °C inkubieren. Das Röhrchen bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Die RNA wird als Pellet am Boden des Röhrchens ausgefällt.
  10. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, und achten Sie darauf, dass Sie das Pellet nicht berühren.
  11. 1 mL 75% EtOH zugeben und kurz bei voller Geschwindigkeit vortexen.
  12. Das Röhrchen bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipettenspitze. Stören Sie das Pellet nicht.
  13. Trocknen Sie das Pellet 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft oder bis das Pellet klar/transparent wird.
  14. Lösen Sie das Pellet in 50 μl nukleasefreiem Wasser auf.

3. Adipozytenfixierung für ChIP-seq

HINWEIS: Führen Sie Schritt 3 aus. in einer chemischen Haube.

  1. 0,3 ml 0,5 M EDTA, 0,2 ml 0,5 M EGTA, 14,8 ml DMEM und 10 ml Heptan in das 50-ml-Röhrchen mit den isolierten Adipozyten geben (Schritt 1.11.).
  2. Fügen Sie 0,7 mL 16 % Formaldehyd (endgültig 0,7 %) hinzu und drehen Sie sich auf einem Röhrchenrotator (siehe Materialtabelle) bei 10 U/min für 5 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Stellen Sie einen Timer ein und zählen Sie 5 Minuten lang. Wenn Sie mehrere Proben verarbeiten, fügen Sie Formaldehyd nacheinander in Abständen von 30 s hinzu, um ein präzises und vergleichbares Timing der Fixierung über alle Proben hinweg zu ermöglichen.
  3. Fügen Sie 1,78 ml 1,25 M Glycin (letzte 0,125 m) hinzu und mischen Sie es auf dem Rotator bei 10 U/min für nicht länger als 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Formaldehyd bleibt auch nach Zugabe von Glycin aktiv. Daher ist es wichtig, die Schichten unmittelbar nach dem 5-minütigen Inkubationsschritt durch Zentrifugation (Schritt 3.4.) zu trennen. Wenn mehr als eine Probe vorhanden ist, fügen Sie jeder Probe Glycin hinzu, um die Reaktion nacheinander in Zeitabständen von 30 s zu stoppen.
  4. Anschließend bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    HINWEIS: Es müssen drei offensichtliche und diskrete Flüssigkeitsschichten vorhanden sein (Abbildung 2C). Die mittlere weiße Schicht enthält die fixierten Adipozyten.
  5. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um die Adipozytenschicht (weiß) in ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu übertragen, wodurch die Menge an Fixiermittel und Heptan in das neue Röhrchen minimiert wird.
  6. Füllen Sie das Röhrchen mit 10 mL (Raumtemperatur) DMEM, ergänzt mit der Proteasehemmer-Cocktail-Tablette (PIC, siehe Materialtabelle). Durch Inversion gründlich mischen.
  7. Das Röhrchen bei ≤200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Halten Sie die Zentrifugationskraft bei 100 x g , um das Platzen der Zellen zu minimieren.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.-3.7. 1x, bevor Sie mit Schritt 3.9 fortfahren.
  9. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um die (weiße) Adipozytenschicht in ein 1,5-ml- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.
  10. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100-200 x g für 5 min bei Raumtemperatur und verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das Heptan (obere Schicht) und das DMEM (untere Schicht) zu entfernen.
  11. Lagern Sie die fixierten Adipozyten bis zur Verwendung bis zu 6 Monate bei -80 °C.

4. Extraktion von Zellkernen und Chromatinscherung

HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von Arrigoni et al.19 übernommen.

  1. Schalten Sie das Ultraschallgerät ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie die Spitzenleistung auf 75 W, den Tastfaktor auf 2 % und 200 Zyklen/Stoß ein, wobei der Wasserbadkühler auf 20 °C eingestellt ist.
  2. Fügen Sie dem Farnham-Laborpuffer und dem Scherpuffer einen Proteaseinhibitor-Cocktail (PIC) hinzu (Tabelle 1).
    HINWEIS: Bitte sehen Sie sich einige weitere vorgeschlagene Ultraschallgeräte und Parameter in Arrigoni et al.19 an.
  3. Resuspendieren Sie die fixierten Adipozyten (aus Schritt 3.) mit 750-800 μl eiskaltem Farnham-Laborpuffer in einem 1 mL Ultraschallröhrchen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Tube nicht bis zur vollen Kapazität zu füllen. Andernfalls schwimmen die Adipozyten zum obersten Teil des Röhrchens, was die Beschallungseffizienz verringert.
  4. Beschallen Sie die Probe 2,5 Minuten lang.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Kernextraktion an einem Phasenkontrastmikroskop, um festzustellen, ob eine weitere Beschallung erforderlich ist. Die Kerne müssen rund und intakt sein, wie in Abbildung 2D gezeigt.
  5. Bevor Sie fortfahren, stellen Sie die Spitzenleistung des Ultraschallgeräts auf 140 W, den Tastfaktor auf 5 % und 200 Zyklen/Stoß ein, wobei der Wasserbadkühler auf 4 °C eingestellt ist.
  6. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C.
  7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Pellet (Kerne) und bewahren Sie das Pellet auf.
  8. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml Farnham-Laborpuffer auf Eis.
  9. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und bewahren Sie das Pellet auf.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 4.8.-4.9. 1x, bevor Sie mit Schritt 4.11 fortfahren.
    HINWEIS: Die isolierten und gewaschenen Zellkerne können bis zur weiteren Verwendung 3 Monate lang bei -80 °C gelagert werden.
  11. Resuspendieren Sie die isolierten Kerne in 1 ml Scherpuffer und überführen Sie sie in ein neues 1 ml-Beschallungsröhrchen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Tube befinden.
  12. Beschallung der Kerne im Ultraschallgerät mit einer Spitzenleistung von 140 W, einem Tastverhältnis von 5 % und 200 Zyklen/Burst für 12 Minuten, um das Chromatin bei 4 °C zu scheren.
  13. Übertragen Sie das Lysat in ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen.
    HINWEIS: Das gescherte Chromatin wird aus den Zellkernen freigesetzt und ist im Puffer (Lysat) enthalten.
  14. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 x g für 5 min bei 4 °C, um unlösliche Rückstände zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand (Chromatin) in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  15. Das gescherte Chromatin kann bis zur weiteren Verwendung 10 Tage lang bei 4 °C oder 3 Monate lang bei -80 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Zusätzliche Qualitätsprüfung: Aliquotieren Sie 25 μl des gescherten Chromatins, um die RNA mit einer DNase-freien RNase zu entvernetzen und zu entfernen, gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht19. Für die vorliegende Studie wurde die resultierende DNA mit einem DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt, die DNA wurde mit einem DNA-Quantifizierungskit auf dem DNA-Quantifizierungsinstrument quantifiziert und die Fragmentgröße wurde mit dem automatisierten Elektrophorese-Instrument bewertet (siehe Materialtabelle). Die Größe des gescherten Chromatins sollte im Bereich von 100-800 bp liegen. Der Rest des Scherchromatins kann für die nachgeschaltete ChIP-Seq-Anwendung verwendet werden.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipozyten wurden aus sechs Fettpolstern isoliert, die heptanbasierte RNA-Extraktion wurde durchgeführt (Schritt 2.) und die resultierende RNA wurde auf dem automatisierten Elektrophoresegerät analysiert. Die berechnete RNA-Integritätszahl (RIN) für alle Proben betrug >8 (Abbildung 3A), was auf eine qualitativ hochwertige und reproduzierbare RNA-Präparation hinweist. Das gesamte RNA-Vorbereitungskit wurde dann zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken verwendet, und jede Probe wurde auf dem Sequenzierer der nächsten Generation sequenziert, um eine Lesetiefe von ≥40 Millionen Reads zu erreichen. Der Phred-Score für alle Proben (Abbildung 3B) und pro Sequenz (Abbildung 3C) betrug ≥30, was auf qualitativ hochwertige DNA-Sequenzenhinweist 20. Somit unterstützt die Heptanentfernung die Isolierung von ertragreicher, qualitativ hochwertiger RNA, die für die RNA-Sequenzierung geeignet ist.

Im Schritt der Formaldehyd-Fixierung wurden zusätzlich drei heptanhaltige nukleare Isolationspräparate und ein Kontrollpräparat ohne Heptan durchgeführt. Das gescherte Chromatin wurde dann auf dem automatisierten Elektrophoresegerät analysiert. In beiden Fällen wurde das Chromatin auf einen Größenbereich von 100-800 bp geschert (Abbildung 4A), ideal für nachgeschaltete ChIP-seq-Verfahren19. Wichtig ist, dass ~5-mal mehr Chromatin aus den mit Heptan behandelten Proben (11,5 ng/μL, 9,42 ng/μL und 9,6 ng/μL) im Vergleich zu den unbehandelten Proben (2,2 ng/μL) gewonnen wurde. H3K4me3 und H3K27me3 ChIP-seq wurden nach Arrigoni et al.19 durchgeführt. Wie in Abbildung 4B gezeigt, waren die Signalspuren von drei unabhängigen heptanbehandelten Proben vergleichbar mit der Spur der heptanbehandelten Probe für beide Histonmarkierungen. Die Heptanbehandlung beeinträchtigt die Qualität des ChIP-seq nicht, verbessert jedoch die Ausbeute an Zellkernen (und geschertem Chromatin) erheblich.

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Abbildung 1: Isolierte Adipozyten. Isolierte Adipozyten wurden mit DAPI (blau) gefärbt, um den Zellkern zu färben, und BODIPY (grün) für die Lipide. Die zytosolischen Lipidtröpfchen machen bis zu 95% des Volumens der Adipozyten aus und stellen eine technische Herausforderung dar, um hohe Ausbeuten bei RNA- und Chromatinextraktionen zu erzielen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematischer Ablauf der Adipozytenisolierung für die Transkriptom- und Epigenomanalyse. Es wird der gesamte Arbeitsablauf abgebildet, von der Adipozytenisolierung bis zur Transkriptom- oder Epigenomapplikation. Die wichtigsten Schritte und repräsentativen Ergebnisse werden dargestellt. (A) Die isolierten Adipozyten schwimmen auf der obersten Schicht und trennen sich von der stromalen Gefäßfraktion als Pellet am Boden des Röhrchens. (B) Die Verwendung von Heptan zur Entfernung von Lipiden vor der RNA-Extraktion mit einem RNA-Isolationsreagenz. (C) Die Verwendung von Heptan zur Entfernung von Lipiden während der Adipozytenfixierung. (D) Das repräsentative Bild der isolierten Adipozytenkerne muss intakt und rund sein. Maßstabsleiste = 20 μm. Das Schema wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentatives Elektropherogramm der RNA-Integritäts- und Qualitätswerte nach RNA-Seq. (A) Die Proben 1-6 repräsentieren sechs Replikate von Heptan-behandelten Adipozyten, und ihre RNA-Integritätsanalyse wurde auf dem automatisierten Elektrophoresegerät durchgeführt. Die RNA-Integritätszahl (RIN) basiert auf den ribosomalen RNA-Verhältnissen von 18S und 28S und stellt die RNA-Qualität dar. Skalieren Sie von 1 (stark verschlechtert) bis 10 (am wenigsten verschlechtert). (B,C) Der Sequenzierungs-Read-Qualitätsscore wurde durch MultiQC-Analyse (B) für den mittleren Qualitätsscore auf Basen (C) und für den Qualitätsscore pro Sequenz bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Repräsentatives Elektropherogramm von geschertem Chromatin und Anreicherungspeaks aus ChIP-seq. (A) Repräsentative Profile des automatisierten Elektrophoresegeräts, die die Chromatingrößenverteilungen der Kontrolle (Probe 1, oben links) und der heptanbehandelten Adipozyten-Chromatinpräparate (Proben 2, 5 und 8, oben rechts und unten zwei) zeigen. Die Chromatinkonzentrationen in den Endpräparationen sind oben links auf jedem Bild angegeben. (B) Screenshot des Genombrowsers, der mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) erstellt wurde. Der obere Teil des Diagramms zeigt H3K4me3 ChIP-seq-Profile für drei (rot) heptanbehandelte Proben und eine (blau) Kontrolle. Das untere Feld zeigt das Gleiche für den ChIP-seq von H3K27me3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

PufferZusammensetzung
Verdauungspuffer (für 3000 mg oder weniger Fettpolster / 20 ml)20 mL Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco
0,3 g fettsäurefreies BSA
0,1 g Kollagenase Typ 2
Farnham Labor-Puffer5 mM ROHRE (pH 8)
85 mM KCl
0,5 % IGEPAL
Scher-Puffer10 mM Tris-HCl pH 8
0,1 % SDS
1 mM EDTA

Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen Puffer, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier vorgestellte Protokoll zur Isolierung von Adipozyten basiert auf allgemein anerkannten enzymatischen Verdauungsmethoden 11,14 zur Trennung reifer Adipozyten (schwimmend) von der verbleibenden stromalen Gefäßfraktion des weißen Fettgewebes. Es bietet einen einfachen und universellen Ansatz zur Aufreinigung reifer Adipozyten in jedem Mausmodell. Wie oben gezeigt, eignet sich das Protokoll für den nachgelagerten Einsatz für Gesamttranskriptom- und ChIP-seq-Analysen. Es bietet eine ausreichende Ausbeute, um mehrere epigenomische Profile (z. B. mehrere Histonmodifikationen plus RNA-seq) aus demselben individuellen Fettpolster zu erzeugen.

Um die hohen Ausbeuten zu gewährleisten, die die Erstellung solcher übereinstimmenden Epigenomdaten ermöglichen, ist die Verwendung von Heptan zum Auflösen von Lipiden aus intakten Adipozyten und aus Adipozyten, die während des Prozesses lysieren. Unserer Erfahrung nach erhöht dieser Schritt die Reproduzierbarkeit und Ausbeute erheblich, indem verhindert wird, dass RNA und Zellkerne an die Lipidschicht verloren gehen. Eine kontinuierliche Rotation der Röhrchen mit den Adipozyten, die fixiert werden, ist ebenso wichtig, da sie die Homogenität erhöht, mit der die Lipide aus den Adipozyten entfernt werden. Anstelle des 1%igen Formaldehyd-Fixierungspuffers, der in einem Großteil der ChIP-seq-Literatur berichtet wurde21,22, wurde festgestellt, dass eine Reduzierung der Konzentration auf 0,7% Formaldehyd notwendig ist, um eine Überfixierung zu vermeiden. Die Chromatin-Scherzeit wurde ebenfalls auf 12 min optimiert, um einen optimalen Chromatingrößenbereich (100-800 bp) für ChIP-seq zu erreichen.

Das Protokoll wurde für Bulk-Transkriptom- und Epigenomstudien optimiert. Das derzeitige Protokoll hat immer noch seine eigenen Einschränkungen für Einzelzell-Transkriptom- und Epigenomanwendungen. Unter Berücksichtigung der im Adipositasbereichberichteten Zellheterogenität 23,24 könnte diese Isolationsmethode weiterentwickelt werden, um für Einzelzellassays angepasst zu werden. In solchen Kontexten könnten Adipozyten-restriktive Marker wie Bor-Dipyrromethen (BODIPY)25 und Perilipin-1 (PLIN1)26, ASC-127 oder Adipozyten-spezifische Zellkernmarker wertvoll sein, um die Quantifizierung zusätzlicher, funktioneller, relevanter zellulärer Parameterzu ermöglichen 28. Abgesehen von der Anwendung in genomischen Studien könnte dieses Protokoll auch Adipozyten-Proteomstudien verbessern, die aufgrund des hohen Lipidgehalts in Adipozyten eine zusätzliche Hürde darstellen29.

Dieses Protokoll kann auch zur erfolgreichen Extraktion menschlicher Adipozytenkerne verwendet werden (Daten nicht gezeigt), wodurch seine Anwendung auf die Forschung zur menschlichen Fettleibigkeit ausgeweitet wird.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dem MPI-IE für die optische Bildgebung, die Sequenzierung, den bioinformatischen Kern und das Personal zu Dank verpflichtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Fördermittel der MPG, des Van Andel Research Institute, der Horizon 2020-Forschung der Europäischen Union, der NIH (R01HG012444 und R21HG011964), des Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No 675610 und des Bundesministeriums für Bildung und Forschung unter der Projektnummer 01KU1216 (Deutsches Epigenom Programm, DEEP).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Formaldehyd-Lösung (w/v). MethanolfreiesThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-Brom-3-chlorpropan SIGMAB9673
5 M NaClInvitrogenAM9759
Automatisiertes Elektrophoresegerät (2100 Bioanalysator)Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
Kollagenase Typ 2Worthington Biochemical Corp.43D14184B
Vollständiger, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail (PIC)Roche4693159001EDTA-freie
DAPI ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM (+ GlutaMAX) life technologies61965-026
DNA-Aufreinigungskit (PCR-Aufreinigungskit)Qiagen28104
DNA-Quantifizierungsgerät (Qubit 4 Fluorometer)Fisher SCIENTIFICQ33238
DNA-Quantifizierungskit (DNA-Hochempfindlichkeits-Assay)Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher ChimicalE478-500
EGTAFisher chimicalO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
Fettsäurefrei BSA SERVA11932.01Rinderalbumin-Fraktion V, fettsäurefrei lyophilisiert
GlycinSIGMAG7126-100G
HeptanSIGMAH2198-1L
Hochempfindliche RNA-AnalyseAgilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
Matrixfilter (420um)Tisch ScientificME17238
Next-Generation Sequencer (HiSeq 3000 Sequencer) Illumina
Nukleasefreies Wasser Invitrogen4387936
PIPESACROS organische Stoffe5625-37-6
Proteinase K ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
Reagenz zur RNA-Isolierung (Trizol)ThermoFisher SCIENTIFIC 15596026
RNase A, DNase-frei ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)ThermoFisher SCIENTIFIC88881001
SDS, NatriumdodecylsulfatSIGMA8170341000
Beschallungsröhrchen (1 mL milliTUBE mit AFA-Faser)Covaris520135
Sonicator (Evolution Focused-Ultraschallgerät (S220 oder E220))Covaris500217 oder 500239
Total RNA Prep Kit (Illumina Stranded Total RNA Prep Kit)Illumina20040525
Tris-HCl Fisher BioreagenzienBP153-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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