Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aversiv associativ læring og hukommelsesdannelse ved parring af to kemikalier i Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64137
Automatic Translation
1, 1, 1
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Vi har tidligere udviklet protokoller for Caenorhabditis elegans til at danne kort- og langsigtede associative minder ved henholdsvis masse- og distanceret træning. Her beskrives detaljerede protokoller til konditionering af C. elegans ved parring af 1-propanol og saltsyre som henholdsvis konditionerede og ubetingede stimuli for at danne aversiv associativ hukommelse.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er en attraktiv modelorganisme til at studere læring og hukommelse på molekylære og cellulære niveauer på grund af enkelheden i nervesystemet, hvis kemiske og elektriske ledningsdiagrammer blev fuldstændig rekonstrueret fra serielle elektronmikrografer af tynde sektioner. Her beskriver vi detaljerede protokoller for konditionering af C. elegans ved masse- og afstandstræning til dannelse af henholdsvis korttidshukommelse (STM) og langtidshukommelse (LTM). Ved at parre 1-propanol og saltsyre som henholdsvis konditionerede og ubetingede stimuli blev C. elegans med succes uddannet til at danne aversiv associativ STM og LTM. Mens naive dyr blev tiltrukket af 1-propanol, var de trænede dyr ikke længere eller meget svagt tiltrukket af 1-propanol. Ligesom i andre organismer som Aplysia og Drosophila spiller "lærings- og hukommelsesgener" væsentlige roller i hukommelsesdannelse. Især er NMDA-type glutamatreceptorer, udtrykt i kun seks par interneuroner i C. elegans, nødvendige til dannelse af både STM og LTM, muligvis som en tilfældighedsfaktor. Derfor kan hukommelsessporet opholde sig blandt interneuronerne.

Introduction

Læring og hukommelse er afgørende for, at dyr kan overleve og reproducere sig ved effektivt at navigere i skiftende miljøer. C. elegans er en attraktiv modelorganisme til at studere læring og hukommelse på molekylært og cellulært niveau på grund af enkelheden i dets nervesystem, hvis kemiske og elektriske ledningsdiagrammer blev fuldstændig rekonstrueret fra serielle elektronmikrografer af tynde sektioner 1,2,3.

C. elegans lærer at forbinde dyrkningstemperatur med sult og migrerer væk fra sin væksttemperatur med en aversiv hukommelse, der varer i flere timer 4,5. Konditionering af C. elegans med natriumchlorid (NaCl) i fravær af mad fører til en reduktion i kemotaxis mod NaCl 6,7,8. Når parret med mad, butanon attraktion er forbedret som følge af appetitlig læring 9,10,11. Selvom disse fænomener fortolkes som associativ læring og hukommelse 10,12, er sondringen mellem associativ læring og ikke-associativ sensibilisering, tilvænning og tilpasning ikke klar i C. elegans lærings- og hukommelsesparadigme13,14. Faktisk viste dyr betinget af butanon og fødemangel (aversiv konditionering) deprimeret kobling af butanon sensorisk neuron AWC ON for at målrette neuroner ved hjælp af insulinsignaler fra andre neuroner, herunder AIA-interneuroner, mens dyr betinget med butanon og mad (appetitiv konditionering) viste forbedret kobling af AWCON til målneuroner15 . Insulinsignaleringen forårsager genekspressionsændringer induceret af nuklear EGL-4 og andre transkriptionelle regulatorer16,17. Således har denne aversive og appetitive læring og hukommelse analogier med henholdsvis ikke-associativ tilvænning og sensibilisering af præsynaptiske sensoriske neuroner i gill-tilbagetrækningsrefleksen i Aplysia18,19.

Ved at parre to kemikalier som den konditionerede stimulus (CS) og den ubetingede stimulus (US) har vi og andre udviklet protokoller til konditionering af C. elegans til dannelse af associativ læring og hukommelse uden at bruge mad eller sult som US20,21,22,23. I denne undersøgelse er protokollerne modificeret til at konditionere dyr med 1-propanol og saltsyre (HCI, pH 4.0) som henholdsvis CS og US for aversiv læring og korttidshukommelse (STM) og langtidshukommelse (LTM). Naive C. elegans tiltrækkes af 1-propanol24 og frastødes af syre25. Når de var betinget af en blanding af 1-propanol og HCI (pH 4,0), var C. elegans ikke længere eller meget svagt tiltrukket af 1-propanol.

Protocol

1. Opskrifter

  1. NGM agar plader (trin 2.1.)
    1. For at forberede 6 cm NGM-plader opløses 2,5 g peptone, 3 g NaCl og 17 g agar i 850 ml dobbelt deioniseret H2O (ddH2O). Bring det samlede volumen til 972 ml med ddH2O.
    2. Efter autoklavering afkøles til ~ 65 ° C og tilsættes 1 ml 5 mg / ml kolesterol opløst i ethanol, 1 ml hver af 1 M CaCl2 og 1 M MgSO4 og 25 ml 1 M kaliumphosphat (pH 6,0). Efter blanding godt, dispenser 8 ml hver til 6 cm (i diameter) petriskåle.
    3. Opbevar pladerne med låg på en bænk ved stuetemperatur (RT) i 1 dag, og opbevar dem derefter i plastikvarer i et koldt rum indtil brug.
  2. Forbered Luria-Bertani (LB) medium (trin 2.1.) ved at opløse 10 g tryptone, 5 g gærekstrakt og 10 g NaCl i 1 liter ddH2O. Juster pH til 7,0 med 5 N NaOH (flere dråber) og steriliser ved autoklavering.
    1. Forbered LB-plader ved at tilføje 15 g agar til LB-medium. Efter autoklavering afkøles til ~ 60 ° C og dispenseres 12 ml hver til 9 cm (i diameter) petriskåle. Opbevar plader i plastikvarer i et koldt rum indtil brug.
  3. For at fremstille en dyreopsamler (trin 2.4.) skal du fastgøre nylonnet (30 μm maskestørrelse) til bunden af et klart cylindrisk rør af akryl (3,5 cm i længden, 3 cm i udvendig diameter, 2 mm i vægtykkelse) med lim.
  4. For at fremstille 0,25% vandig gelatineopløsning (trin 2,4.) opløses 0,25 g gelatine i 100 ml ddH2O. Steriliser ved autoklavering.
  5. Kemotaxis assay plader (trin 5.1.)
    1. For at fremstille agarplader til kemotaxissay opløses 15 g agar i 993 ml ddH2O ved autoklavering og afkøles opløsningen til ~ 65 ° C.
    2. Derefter tilsættes 5 ml autoklaveret 1 M kaliumphosphat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2 og 1 ml 1 M MgSO4 til agaropløsningen. Alle disse opløsninger steriliseres separat ved autoklavering.
    3. Dispenser 10 ml af den blandede opløsning til en 6 cm petriskål. Placer disse tallerkener med låg på en bænk hos RT i to dage, og læg dem derefter på våde papirhåndklæder i plast ved RT indtil brug. Disse plader kan bruges i op til 10 dage.
  6. For at fremstille kemotaxissaybuffer (trin 5.4.) blandes 5 ml 1 M kaliumphosphat (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO4 og 993 ml ddH2O. Steriliser separat alle disse opløsninger ved autoklavering.
  7. For at fremstille en 40 ml CS/US-blandingsopløsning (1 % vandig 1-propanol og HCl [pH 4,0]) (trin 3.1. og trin 4.1.) tilsættes 0,4 ml absolut 1-propanol og 4 μL 5 M HCl (0,1 mM ved slutkoncentration) til 39,6 ml ddH2O. Opløsningen opbevares ved RT.
  8. For at fremstille ddH2O skal du behandle ledningsvand 2x med vandrensningssystemer (se Materialetabel).
  9. Forbered en flydende kultur (OD600 = ~ 0,7) af Escherichia coli OP50 ved at pode en frisk koloni med et tandstikker i 10 ml LB-medium og inkubere ved 37 ° C i 7-8 timer. Bakterier dyrket i længere tid kan påvirke resultatet af konditionering, måske på grund af sekundære metabolitter.

2. Forberedelse af synkroniseret C.  Elegans

  1. Ved hjælp af standardmetoder26 dyrkes dyr på 6 cm NGM-plader (trin 1.1.). NGM-plader fremstilles ved at sprede 0,2 ml af en E. coli OP50 væskekultur i LB-medium (se trin 1.9 .) og inkubere ved RT i højst 24 timer (gamle bakterier kan påvirke resultatet af konditionering).
    BEMÆRK: C. elegans læring og hukommelse er ekstremt følsomme over for mekaniske, kemiske og temperaturspændinger. Derfor anbefales det stærkt at dyrke dyr, vedligeholde alle reagenser inklusive vand og udføre alle assays ved RT mellem 17 ° C og 20 ° C. Fysisk og mekanisk stimulering såsom hvirveldannelse, ru pipettering og centrifugering skal undgås. Frisk 1-propanol bør bruges hver 3. måned længst af en ukendt årsag. Det er vigtigt, at dyr dyrkes med masser af mad, da sult kan påvirke resultatet af konditionering alvorligt.
  2. På dag 1 skal du plukke og placere fem velnærede gravide dyr (læg flere mutante dyr, der lægger æg langsomt) på hver af de fire 6 cm NGM-plader med en platin ormplukker, og lad dem lægge ~ 50 æg i 3 timer på RT for at opnå en synkroniseret population af voksne dyr. Stop æglægningen ved at fjerne forældredyr fra pladerne med en platin ormplukker.
    BEMÆRK: Frøplader skal opbevares på RT for at minimere stress for dyrene.
  3. Dyrk dyrene på RT i ca. 5 dage, hvilket er den tid, det tager for dyr at nå deres modne voksenstadium, ikke ungdomsstadiet.
    BEMÆRK: Dyrkningsperioden mellem 4,5 dage og 5,5 dage bør justeres afhængigt af forholdene, da yngre voksne dyr er mere følsomme over for de kemikalier, der anvendes til konditionering, end modne voksne dyr (supplerende figur 1). Efter konditionering kan yngre voksne dyr vise lavere kemotaxisindeksværdier (C.I.).
  4. Saml ~200 voksne dyr i en dyreopsamler (se trin 1.4.) ved at vaske hver plade med 1 ml 0,25% vandig gelatine (trin 1.4.) Denne vandige gelatine forhindrer dyrenes vedhæftning til overfladen af plast, såsom pipettespidser.
  5. Vask dyrene i opsamleren med ddH 2 O (trin 1.8.) ved meget forsigtigt at flytte opsamleren op og ned 2x i ~10 ml ddH 2 O. Gentag denne proces 2x mere (3x i alt) med ~10 ml ddH2O hver for at forhindre bakteriel kontaminering.
    BEMÆRK: Bakteriel forurening påvirker dyrs kemotaxis alvorligt.

3. Massetræning til kortvarig associativ læring og hukommelse

BEMÆRK: Se figur 1 for den samlede træningsarbejdsgang.

  1. Nedsænk forsigtigt dyresamleren indeholdende ~ 200 dyr i 40 ml af en blanding af 1% 1-propanol og HCI (pH 4,0 efter blanding med 1-propanol; se trin 1.7.) i en krystalliserende skål i ~ 1 s.
    BEMÆRK: For kontroldyrene skal du gøre det samme, men kun dyppe i 1% vandig 1-propanol. Det ville være bedre at behandle dyr med HCI (pH 4,0) kun som en anden kontrol.
  2. Vask dyrene i opsamleren ved meget forsigtigt at nedsænke opsamleren 1x i 10 ml ddH2O i en brønd af en 6-brønds vævskulturplade.
    BEMÆRK: Dette vasketrin skal være meget skånsomt og kun udføres 1 gange, da omfattende vask kan forhindre læring.
  3. Gentag trin 3.1. og 3.2. 10x uden afbrydelse (inter-trial interval [ITI], 0 min).
    BEMÆRK: Brug frisk ddH2O hver gang på RT.
  4. Placer opsamleren på en E. coli OP50 græsplæne på en 6 cm NGM plade i 10 min ved RT for at dyrene kan hvile.
  5. Vask dyrene i opsamleren med ddH 2 O vedmeget forsigtigt at flytte opsamleren op og ned 2x i ~ 10 ml ddH 2 O. Gentag denne proces 2x mere (3x i alt) med ~ 10 ml ddH2O hver for at forhindre bakteriel forurening.
  6. Fortsæt til kemotaxis-analyse som beskrevet nedenfor (trin 5).

4. Distanceret træning til langsigtet associativ læring og hukommelse

BEMÆRK: Se figur 2 for arbejdsgangen for træning med mellemrum.

  1. Nedsænk forsigtigt en dyresamler indeholdende ~ 200 dyr i 40 ml af en blanding af 1% 1-propanol og HCI (pH 4,0 efter blanding med 1-propanol; se trin 1.7.) i en krystalliserende skål i ~ 1,0 s.
    BEMÆRK: Gør det samme med 1% vandig 1-propanol kun som kontrol. Det ville være bedre at behandle dyr med HCI (pH 4,0) kun som en anden kontrol.
  2. Vask dyrene i opsamleren ved meget kort at nedsænke opsamleren 1x i 10 ml ddH2O i en brønd af en 6-brønds vævskulturplade.
    BEMÆRK: Denne vask skal være meget kort, da omfattende vask kan forhindre læring.
  3. Placer opsamleren på en E. coli OP50 græsplæne på en NGM agarplade i en 6 cm (i diameter) petriskål i 10 minutter ved RT for at dyrene kan hvile.
    BEMÆRK: Denne hvile i 10 minutter som ITI er afgørende for, at dyrene kan konsolidere minder til dannelsen af LTM.
  4. Gentag trin 4.1.-4.3. 10x.
  5. Vask dyrene i opsamleren med ddH 2 O ved meget forsigtigt at flytte opsamleren op og ned 2x i ~10 ml ddH 2 O, som opbevares ved RT.Gentag denne proces 2x mere (3x i alt) med ~10 ml ddH2O hver for at forhindre bakteriel kontaminering.
  6. Fortsæt til kemotaxissay som beskrevet nedenfor (trin 5.).

5. Kemotaxis assay

  1. Tilbered agarplader til kemotaxissay i 6 cm petriskåle af plast (se trin 1.5.).
  2. Overfør dyr i opsamleren (trin 2.5.), som er anbragt på en plan overflade af et petriskålslåg af plast, til et 2 ml mikrocentrifugerør med 1 ml 0,25% vandig gelatine ved hjælp af en savet pipettespids med en åbning på >1 mm (indvendig diameter).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en oversavet pipettespids for at minimere forskydningsbelastning på dyr.
  3. Fjern supernatanten fra røret, når dyrene har sat sig i bunden af røret ved tyngdekraften i ~ 1 min (centrifuge ikke).
  4. Forsigtigt resuspendere dyrene i 1 ml kemotaxisassaybuffer (se trin 1.6.) og lad dem sætte sig ned ved tyngdekraften til bunden af røret i ~ 1 minut (centrifuge ikke). Fjern så meget supernatant som muligt ved pipettering.
  5. I mellemtiden ses diagonalt 4 μL hver af 5% vandig 1-propanol to steder og spot 4 μL hver af ddH2Oto andre steder på samme måde som vist i figur 3A. For kemotaxis-assay af mutanter, der har lavere følsomhed over for 1-propanol, skal du spotte højere koncentrationer af vandig 1-propanol, der resulterer i ~ 0,6 kemotaxisindeksværdier (C.I.) for naive mutanter, som vist i supplerende tabel 1.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at afslutte spottingprocedurerne så hurtigt som muligt. Spot 5% vandig 1-propanol, da 1% vandig 1-propanol er for svag til at tiltrække dyr i kemotaxis-assayet. I modsætning hertil skal du bruge 1% vandig 1-propanol til konditionering, da dyr behandlet med højere koncentrationer af vandig 1-propanol end 1% viser lavere C.I. værdier.
  6. Der ses 6 μL dele af dyresuspensionen i kemotaxisassaybuffer (trin 5.4.), der indeholder ~60 dyr i midten af tre plader til kemotaxis-assay ved hjælp af en oversavet pipettespids med en ~1,0 mm (indvendig diameter) åbning. Fjern væske så meget som muligt med en laboratorievævsvæge uden at røre dyrene og læg et låg på pladen.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at afslutte disse procedurer så hurtigt som muligt.
  7. Lad dyrene bevæge sig frit på tallerkenen i 10 minutter ved RT, og overfør derefter pladen til en glas petriskål på is i 3 minutter for at stoppe kemotaxis. Opbevar derefter pladen i køleskab, indtil du tæller antallet af dyr på pladen.
  8. Tæl antallet af dyr i fire sektioner, bortset fra dem i midtercirklen, under et stereomikroskop, og beregn kemotaxisindekset (C.I.) ved hjælp af ligningen vist i figur 3B. Ud fra C.I.-værdierne beregnes læringsindeksværdier (L.I.) som forskellen mellem referencedyrenes CI-værdi og C.I.-værdien af de konditionerede dyr (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).
    BEMÆRK: C.I.-værdien af referencedyrene (C.I.reference) er middelværdien af C.I.-værdierne for dyr, der kun er betinget af 1% vandig 1-propanol.

Representative Results

C. elegans blev betinget af massetræning til dannelse af kortvarig aversiv associativ hukommelse ved at parre 1% vandig 1-propanol og HCI (pH 4,0) som henholdsvis CS og US. I henhold til den ovenfor beskrevne protokol blev synkroniserede dyr dyrket på en bænk ved en RT på 18 °C i 5 dage og blev meget forsigtigt vasket 2x med ddH2O ved en RT på 18 °C. Derefter blev dyrene konditioneret med en blanding af 1% vandig 1-propanol og HCI (pH 4,0) i 1 s. Vi trænede også dyr med ddH kun2O, kun 1% vandig 1-propanol og kun HCI (pH 4,0) som referencer. Efter konditioneringen blev dyrene vasket 1x med ddH2O. Vi gentog konditioneringen 10x uden afbrydelse (ingen ITI'er). Vellykket konditionering blev opnået ved at gentage proceduren mere end 7x op til 10x. Konditionering mere end 10x resulterede i mindre effektiv læring21. Efter træningen hvilede dyrene på bakteriefoder i 10 minutter ved RT (18 °C). Efter at være blevet vasket med ddH2O 3x blev dyrene overført til et mikrocentrifugerør ved at suspendere i 0,25% vandig gelatine og bundfældet til bunden ved tyngdekraften. Efter at have fjernet supernatanten så meget som muligt, blev dyrene forsigtigt resuspenderet i kemotaxis assay buffer og derefter lov til at slå sig ned til bunden af røret ved tyngdekraften.

Efter at have fjernet så meget supernatant som muligt blev dyresuspensionen set på midtercirklen af en kemotaxis-analyseplade, som blev holdt ved en RT på 18 ° C, og derefter fik dyrene lov til frit at bevæge sig på pladen i 10 minutter ved en RT på 18 ° C. C.I. værdier blev beregnet ved hjælp af ligningen vist i figur 3B. Som vist i figur 4A blev dyr, der var betinget af blandingen af 1% 1-propanol og HCI, ikke længere tiltrukket af 5% 1-propanol spottet på agarplader til kemotaxissay, mens naive dyr og referencedyr ligeledes blev tiltrukket af 5% 1-propanol. Efter massetræningen (trin 3.) blev hukommelsen ikke længere observeret inden for 3 timer20. Desuden var hukommelsen dannet af den massive træning følsom over for kuldechok20. Disse resultater viser, at C. elegans med succes dannede aversiv STM ved massetræning.

Dyrene blev også konditioneret af træning med afstand 10x med en 10 minutters ITI mellem træningstrinnene (trin 4.). Under ITI blev samleren med dyr anbragt på en bakterieplæne på en 6 cm NGM-plade ved en RT på 18 °C. Dyr, der var betinget af den adskilte træning med en blanding af 1% vandig 1-propanol og HCI (pH 4,0), blev ikke længere tiltrukket af 5% 1-propanol sammenlignet med dyr, der kun blev behandlet med 1% 1-propanol, kun HCI (pH 4,0) eller kun ddH2O (figur 4B). Efter den adskilte træning bevarede dyrene hukommelsen i mere end 12 timer20,21. Desuden dannedes hukommelsen ikke, når dyr blev behandlet med oversættelses- eller transkriptionsinhibitorer og var modstandsdygtig over for kuldechok20,21. Derfor dannede C. elegans med succes aversiv LTM ved distanceret træning.

Vi undersøgte også virkningerne af mutationer i "lærings- og hukommelsesgener" på dannelsen af STM og LTM. Crh-1-genet koder for henholdsvis det allestedsnærværende transkriptionsfaktor cAMP-responselementbindende protein (CREB), glr-1 og nmr-1 koder for α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA)-type og N-methyl-D-aspartat (NMDA)-type glutamatreceptorunderenheder, og stau-1 koder for det dobbeltstrengede RNA-bindende protein Staufen isoform. Disse gener spiller væsentlige roller i klassisk konditionering i C. elegans, Drosophila, Aplysia og mus. Ved anvendelse af en blanding af 1% vandig 1-propanol og HCI (pH 4,0) var dannelsen af STM og LTM afhængig af alle generne (figur 5A, B).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel skematisk af massetræning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel skematisk af distanceret træning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kemotaxis-analyse og kemotaxis-indeks . (A) Skematisk repræsentation af en kemotaxis-analyseplade. Petriskåle (6 cm i diameter) blev opdelt i fire områder som vist, og 4 μL hver af 5% vandig 1-propanol eller ddH 2 O blev diagonalt plettet to steder hver,2cm væk fra midten. (B) Kemotaxis-indeksværdierne blev beregnet ud fra den viste ligning ved at tælle antallet af dyr i område "a" og "b" efter afslutningen af kemotaxierne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kemotaxisindeksværdier for dyr konditioneret med kemikalier. Synkroniserede vildtype N2-dyr blev konditioneret med kemikalier angivet ved (A) massetræning 10x eller (B) distanceret træning 10x. Rutediagrammer over de anvendte masse- og afstandstræningsprotokoller er vist i henholdsvis figur 1 og figur 2. Efter konditioneringen kunne dyrene frit bevæge sig i 10 minutter på en 6 cm agarplade til kemotaxissay ved en RT på 18 °C. C.I. værdier blev beregnet ved hjælp af ligningen vist i figur 3B. Data for dette tal fremgår af supplerende tabel 1. Data fra de naive dyr blev gengivet i begge figurpaneler. Barplot viser 1. kvartil, median og 3. kvartil. Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskelle bestemt ved envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Læringsindeksværdier for konditionerede mutantdyr. Synkroniserede vildtype N2 og mutante dyr blev konditioneret med en blanding af 1% vandig 1-propanol og HCI (pH 4,0) ved (A) massetræning 10x eller (B) distanceret træning 10x. Rutediagrammer over de anvendte masse- og afstandstræningsprotokoller er vist i henholdsvis figur 1 og figur 2. Efter konditioneringen kunne dyrene frit bevæge sig i 10 minutter på en 6 cm agarplade til kemotaxissay ved en RT på 18 °C. Data for dette tal fremgår af supplerende tabel 2. Barplot viser 1. kvartil, median og 3. kvartil. Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskelle bestemt ved envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Unge voksne dyr er følsomme over for kemisk behandling. Dag 4 og dag 5 vildtype N2 dyr efter udklækning blev massetrænet 10x med HCI, pH 4,0, uden afbrydelse og blev derefter analyseret for kemotaxis til 5% vandig 1-propanol. Barer er midler ± S.E.M. (n = 19). Stjerner (*P < 0,05) indikerer statistisk signifikante forskelle bestemt ved tovejs ANOVA efterfulgt af Tukey-Kramer post-hoc-testen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Data svarende til figur 4. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Data svarende til figur 5. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

I denne undersøgelse blev alle reagenser holdt ved en RT på ~ 18 ° C i gennemsnit, og dyr blev dyrket på en bænk ved RT for at undgå stress for dyrene. Desuden blev alle forsøgsprocedurer udført på RT. Dyr blev oprindeligt dyrket i en inkubator ved 20 ° C og derefter konditioneret på en bænk ved ~ 24 ° C ved hjælp af reagenser ved RT. Under disse forhold var resultaterne af konditioneringen meget varierende. Ved den lave RT vokser C. elegans langsomt og bør dyrkes længere end ved 20 °C, indtil dyrene når voksenalderen, da yngre voksne dyr er mere følsomme over for de kemikalier, der anvendes til konditionering, end modne voksne dyr og kan udvise lavere ci-værdier.

Det mest kritiske trin for vellykket konditionering er vask af dyr med ddH2O umiddelbart efter hver kemisk behandling. Derfor bør mekaniske belastninger og temperaturbelastninger minimeres ved hjælp af afsavede pipetspidser, holde reagenser ved RT og meget skånsomt vaske dyrene ved meget langsomt at bevæge dyresamleren op og ned i ddH2O. Grundig vask af dyrene hver gang efter konditionering kan påvirke indlæring og hukommelse. Betingelserne for kemotaxis-analysepladerne påvirker også resultaterne alvorligt. For tørre eller for våde plader forhindrer glat bevægelse af dyrene. Plader blev fremstillet som beskrevet i trin 1.; en god plade er en, for hvilken de 4 μL pletter af ddH2O eller 5% vandig 1-propanol absorberes fuldstændigt af agaren i ca. 5 minutter efter spotting. Som beskrevet ovenfor er dyrenes alder også afgørende for en vellykket konditionering. Unge voksne dyr er følsomme over for mekanisk og kemisk behandling, hvilket resulterer i variable resultater, selvom meget gamle dyr måske heller ikke er egnede til konditionering.

Holdbarheden af 1-propanol afhænger af mærker og partier og er mindre end 3 måneder hos RT. Når CI-værdierne for naive dyr bliver værre, anbefales det at bruge frisk 1-propanol til konditionering og kemotaxis-analyse.

Dannelsen af hukommelse ved massetræning blev ikke påvirket af behandlingen af dyr med oversættelsesinhibitorer (cycloheximid og anisomycin) og en transkriptionsinhæmmer (actinomycin D), mens dannelsen af hukommelse ved den adskilte træning blev markant hæmmet af hæmmerne20,21. Desuden forfaldt førstnævnte hukommelse ved kuldechok, mens sidstnævnte blev bevaret i længere tid end førstnævnte og var modstandsdygtig over for kuldechok. Disse resultater viser, at førstnævnte er STM og sidstnævnte er LTM, henholdsvis20,21. Imidlertid kan hukommelsen dannet af den masserede træning bestå af STM og mellemterm (mellemtid) hukommelse, da STM er svagt afhængig af CREB-transkriptionsfaktoren (figur 5A). Dette er i overensstemmelse med resultatet af, at STM blev bibeholdt i mere end 1 time20,21. Dannelsen af både STM og LTM er stærkt afhængig af nmr-1, som kun udtrykkes i seks par neuroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG og PVC) i C. elegans27,28. I disse neuroner kan NMDA-receptorer derfor fungere som en molekylær tilfældighedsdetektor af 1% vandige 1-propanol- og HCl-signaler (pH 4,0) for synaptisk plasticitet, hvor den synaptiske styrke, der kræves for både STM og LTM, kan skyldes tilfældig affyring af præ- og postsynaptiske neuroner 29,30,31,32,33. Derfor kan den aversive associative hukommelse dannes blandt interneuronerne.

De metoder, der er beskrevet i denne undersøgelse, bør kunne anvendes til appetitlig olfaktorisk læring og kortsigtet og langsigtet associativ hukommelse ved hjælp af 1-nonanol som CS og kaliumchlorid som US21. Det er interessant at sammenligne de neuronale kredsløb, der er involveret i dannelsen af appetitive og aversive minder.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang og Hitomi Ohtaki for deres tekniske bistand og kommentarer til manuskriptet. Stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som finansieres af NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbejde blev støttet af finansiering fra Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

Neurovidenskab udgave 184
Aversiv associativ læring og hukommelsesdannelse ved parring af to kemikalier i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shibutani, M., Vibulyaseck, S.,… More

Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter