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Schonende Isolierung von Kernen aus dem Hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein natürlich kurzlebiges Modell für die Alternsforschung

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DOI:

10.3791/64165

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9. August 2022

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1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular and Computational Biology Department, USC Dornsife College of Letters, Arts and Sciences, 3Biochemistry and Molecular Medicine Department, USC Keck School of Medicine, 4Epigenetics and Gene Regulation, USC Norris Comprehensive Cancer Center, 5USC Stem Cell Initiative

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus den Gehirnen des kurzlebigen Wirbeltiermodells Nothobranchius furzeri für nachgeschaltete Anwendungen wie Einzelkern-RNA-Sequenzierung oder Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (ATAC-seq).

Zusammenfassung

Die Untersuchung der Gehirnalterung mit Einzelzellauflösung in Wirbeltiersystemen bleibt aufgrund von Kosten, Zeit und technischen Einschränkungen eine Herausforderung. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Generierung von Einzelkern-RNA-Sequenzierungsbibliotheken (snRNA-seq) aus den Gehirnen des natürlich kurzlebigen afrikanischen Türkis-Killifischen Nothobranchius furzeri. Der afrikanische türkisfarbene Killifisch hat eine Lebensdauer von 4-6 Monaten und kann kostengünstig untergebracht werden, wodurch Kosten- und Zeitbarrieren für die Untersuchung der Gehirnalterung von Wirbeltieren reduziert werden. Es sind jedoch maßgeschneiderte Protokolle erforderlich, um Kerne von ausreichender Qualität für nachgeschaltete Einzelzellexperimente aus dem Gehirn junger und alter Fische zu isolieren. Hier demonstrieren wir ein empirisch optimiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus dem Gehirn erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein kritischer Schritt bei der Erzeugung hochwertiger Einzelkern-Omik-Bibliotheken. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Schritte zur Reduzierung der kontaminierenden Hintergrund-RNA wichtig sind, um Zelltypen klar zu unterscheiden. Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll die Machbarkeit der Untersuchung der Gehirnalterung in nicht-traditionellen Wirbeltiermodellorganismen.

Einleitung

Das Verständnis der Mechanismen der Alterung des Gehirns von Wirbeltieren ist entscheidend für die Behandlung altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer und Demenz1. Der Afrikanische Türkis-Killifisch (Nothobranchus furzeri) ist das kurzlebigste Wirbeltier, das in Gefangenschaft gezüchtet werden kann, und aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung ist es ein ausgezeichnetes Gehirnalterungsmodell 2,3,4,5. In jüngster Zeit hat das Aufkommen von Einzelzell-"Omics" -Technologien, wie Single Nuclei RNA-seq (snRNA-seq) und Single Nuclei Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (snATAC-seq), es Forschern ermöglicht, das alternde Gehirn mit einer beispiellosen Auflösung zu befragen 6,7,8. Diese Methoden beruhen auf der Isolierung von Kernen, da die Wiederherstellung von Gehirnzellen wie Neuronen oft zu schwierig ist, um 6,7,8,9,10 zu isolieren. Die meisten veröffentlichten Kernisolierungsprotokolle sind jedoch für Säugetiermodellorganismen 11,12,13,14,15 optimiert. Da also derzeit ein ungedeckter Bedarf besteht, Hirnkerne im Killifisch als aufstrebenden neuen Modellorganismus im Bereich der Alternsforschung2 zu isolieren, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenem Hirnkillifischgewebe zu etablieren.

Hier wird ein optimierter und robuster Workflow etabliert, der allgemein verfügbare Materialien verwendet, um hochwertige Kerne aus Killifischhirnen zu isolieren. Dieses Protokoll wurde von einem 10-fachen Genomik-Protokoll für Mausgehirne modifiziert, um den Gehirnen mit niedrigerem Myelingehalt von afrikanischen türkisfarbenen Killifischen Rechnung zu tragen, der Zerbrechlichkeit von gefrorenem Gewebe und der Notwendigkeit, den Gehalt an Umgebungsschmutz für sequenzierungsbezogene Anwendungen zu reduzieren16. Tatsächlich führen zuvor optimierte Protokolle für Säugetierhirngewebe17,18 zu schlechter Kernqualität (d.h. Überlyse) und/oder hohem Trümmergehalt, wenn sie auf gefrorenen Killifischen verwendet werden, was sie für die Verwendung mit snRNA-seq gemäß den Empfehlungen für Einzelkern-RNA-seq unter Verwendung von Mikrofluidik ungeeignet macht (ergänzende Abbildung 1).

Neben der Kernisolierung zeigen wir, wie die Qualität und Ausbeute der Kerne durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Dieser Artikel enthält Beispiele für optimale und suboptimale Ergebnisse und erläutert die Problembehandlung. Dieses Protokoll wurde für gefrorene Killifischhirne entwickelt und optimiert, kann aber auch ohne größere Modifikationen an frisch sezierten Killifischproben verwendet werden. Killifish Hirnkerne, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden für die Verwendung in Single Nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als Downstream-Anwendung optimiert, sollten aber auch für den Einsatz in snATAC-seq und Bulk ATAC-seq geeignet sein.

Protokoll

Tierpflege und Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der University of Southern California IACUC unter genehmigten Protokollen #21215 durchgeführt. Für alle Arbeiten, die dieses Protokoll verwenden, ist es notwendig, die Genehmigung der IACUC der Institution einzuholen, bevor mit Forschungsarbeiten an Wirbeltieren begonnen wird.

HINWEIS: Ein vollständiger Durchlauf des Protokolls ausgehend von schockgefrorenem Hirngewebe (ab Schritt 3) sollte ~2,5 h für sechs Proben dauern (Abbildung 1).

1. Killifische Gehirne sezieren

  1. Humane Euthanasierung von Killifischen mit einer Lösung von 1,5 g / L Methanosulfonat / Tricain (MS-222) im Systemwasser.
    1. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um Killifische schnell zu enthaupten, nachdem alle Körper- und Kiemenbewegungen aufgehört haben.
  2. Sezieren Sie den enthaupteten Kopf auf einer sauberen Petrischale, wie zuvor beschrieben19.
    1. Stellen Sie die Schale unter ein Seziermikroskop (mit einem 8-35-fachen Vergrößerungsbereich). Drehen Sie den Kopf so, dass die Branchiostegal-Strahlen scharf sind
    2. Schneiden Sie mit einer Schere das Zahn so durch, dass die Branchiostegal-Strahlen und der Schädel sichtbar werden.
    3. Halten Sie mit einer Pinzette die Branchiostegal-Strahlen auf beiden Seiten des Schädels fest. Verwenden Sie eine weitere Pinzette, um alle verbleibenden Gewebefragmente aus dem Schädel zu entfernen. Das V-förmige optische Chiasma, das das Gehirn und die Augen verbindet, sollte sichtbar werden.
    4. Schneiden Sie das optische Chiasma mit einer Schere, um beide Augen vom Gehirn zu lösen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel vorsichtig zu befreien.
    5. Drehen Sie den Schädel um und verwenden Sie eine Pinzette, um den Muskel von der dorsalen Seite des Schädels zu kratzen.
    6. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel an Ort und Stelle zu halten, und eine weitere Pinzette, um die Knochen des Schädels vorsichtig zu entfernen und das Gehirn freizulegen.
    7. Das Gehirn erscheint weiß und weich. Einmal sichtbar, ist es nicht erforderlich, alle Schädelknochen zu entfernen. Entfernen Sie das Gehirn mit einer sauberen Pinzette, indem Sie es vorsichtig anheben und kratzen.
  3. Flash frieren Sie das Gehirn ein, indem Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen legen, das auf Trockeneis gelagert wird.
    HINWEIS: Das gefrorene Hirngewebe kann bei -80 °C gelagert werden, bis alle zu verarbeitenden Proben gesammelt wurden, um Batch-Effekte bei der Verarbeitung für die Bibliotheksgenerierung zu begrenzen. Während Proben, die bei -80 °C gelagert werden, nicht unbegrenzt gelagert werden können, wurde dieses Protokoll erfolgreich an Killifischen durchgeführt, die bis zu 12 Monate lang ohne nennenswerten Qualitätsabfall gelagert wurden.

2. Frische Puffer vorbereiten

  1. Kernwaschpuffer (2% Rinderserumalbumin [BSA] in 1x PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4 und 0,2 U/μL RNase-Hemmer) vorbereiten und auf Eis lagern. Bereiten Sie 250 ml Kernwaschpuffer für bis zu acht Proben vor. Verwenden Sie für 250 ml 50 ml 10% BSA-Stammlösung, 25 ml einer 10x PBS-Stammlösung, 1,25 ml des 40 U/μL RNase-Inhibitors und bringen Sie dann das Volumen auf 250 ml mit RNAse-freiemddH2O.
  2. Kernlysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 0,01875% v/v NP-40 und 0,2 U/μL RNase-Inhibitor) vorbereiten und auf Eis lagern. Bereiten Sie 10 ml Kernlysepuffer für bis zu acht Proben vor. Verwenden Sie für 10 ml 100 μL 1 M Tris-HCl pH 7,4-Stammlösung, 20 μL 5 M NaCl-Stammlösung, 30 μL 1 M MgCl2-Stammlösung , 18,75 μL einer 10%igen NP-40-Stammlösung, 50 μL des 40 U/μL RNase-Inhibitors und bringen Sie dann das Volumen mit RNAse-freiemddH2Oauf 10 ml.

3. Zellkerne isolieren

  1. Wenn Sie gefrorene Proben verwenden, tauen Sie diese 10 Minuten auf Eis auf. Wenn Sie frisch sezierte Gehirne verwenden, fahren Sie direkt mit Schritt 3.2 fort.
    HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll an einzelnen Gehirnen funktionieren kann, haben kleinere Proben von jungen Fischen (5-6 Wochen alt) einen schlechteren Ertrag. Ausreichende Erträge können immer erzielt werden, wenn zwei Gehirne als eine Probe verarbeitet werden, unabhängig von Alter und Geschlecht der Fische (Tabelle 1). Dieses Protokoll hat erfolgreich hochwertige Kerne von Fischen im Alter von 5 bis 26 Wochen isoliert, darunter Tiere aus GRZ- und ZMZ1001-Stämmen. Es sind keine Probleme bei der Anwendung dieses Protokolls auf andere Stämme zu erwarten.
  2. Geben Sie das Gehirn in 1 ml eiskalten Kern-Lysepuffer in einem 2 ml Dounce-Homogenisator. Halten Sie den Homogenisator auf Eis und vermeiden Sie die Bildung von Blasen während der Lyse der Probe. Abprallen mit einer ungefähren Rate von 0,5 s/Abwärtshub und 0,5 s/Aufwärtshub mit einer Drehung von 180° pro Zyklus. Mit dem losen Stößel für 15 Schläge oder bis die Gewebe/Lyse-Puffermischung homogen erscheint, wenn zusätzliche Schläge erforderlich sind.
    HINWEIS: Dounce-Homogenisatoren sollten zwischen den Anwendungen gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und mit Standard-Trockenautoklaven-Sterilisationszyklen sterilisiert werden.
    1. Mit dem engen Stößel für 30 Schläge mit kleinen Pausen, 30 s bis 1 min, alle 10 Schläge hüpfen. Abprallen mit einer ungefähren Rate von 0,5 s/Abwärtshub und 0,5 s/Aufwärtshub mit einer Drehung von 180° pro Zyklus. Lassen Sie die Probe 2 min auf Eis im Dounce-Homogenisator ruhen.
      HINWEIS: Diese Inkubationszeit gewährleistet eine ausreichende Lyse, sollte jedoch verkürzt werden, wenn eine nukleare Überlyse beobachtet wird.
  3. Die Probe wird durch einen 70-μm-Zellfilter in ein 15-ml-konisches Röhrchen gesieht, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist.
  4. Geben Sie 4 ml Kernwaschpuffer in die Probe, indem Sie den Waschpuffer über den 70-μm-Zellfilter aus Schritt 3.3 pipettieren und fünfmal vorsichtig durch Inversion mischen.
    HINWEIS: Dies ermöglicht die Rückgewinnung von Kernen, die auf dem Filter eingeschlossen sein können, und verbessert die Ausbeute.
  5. Zentrifugieren mit einem Schaufelrotor bei 500 x g, 4 °C, für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig in einen flüssigen Abfallbehälter gießen. Bringen Sie die Probe wieder in eine aufrechte Position und entfernen Sie den verbleibenden Waschpuffer mit einer P1000-Pipette.
    HINWEIS: Das Kernpellet ist wahrscheinlich sichtbar, wenn man von zwei Gehirnen in einer Probe ausgeht. Bei der Verarbeitung einzelner Gehirne von Jungtieren (5-6 Wochen alt) wird jedoch ein geringerer Ertrag erwartet, und Pellets sind möglicherweise nicht immer sichtbar. In diesem Fall sollte der Überstand vorsichtig entfernt werden, während die Position des Pellets am Boden des Röhrchens eingenommen wird.
  6. Resuspendieren Sie die Kerne sofort in 1 ml Kernwaschpuffer mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung.
  7. Die Probe wird durch Zugabe von 4 ml Kernwaschpuffer auf 5 ml gebracht und fünfmal vorsichtig durch Inversion gemischt. Mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 x g, 4 °C, 10 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
  8. Resuspendieren Sie die Kerne in 1 ml Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze und geben Sie sie in ein Durchflusszytometrieröhrchen (FACS).
  9. Fügen Sie 300 μL Ablagerungslösung hinzu (Table of Materials) und mischen Sie gründlich durch Pipettieren mit einer breiten Bohrungsspitze, bis die Mischung homogen ist.
  10. Legen Sie vorsichtig 1 ml Kernwaschpuffer auf die in Schritt 3.9 mit einer P1000-Pipette hergestellte Kernlösung und halten Sie das Röhrchen in einem leichten Winkel (ergänzende Abbildung 2). Die Schmutzlösungsfraktion und die Kernwaschpufferfraktion sollten bei korrekter Schichtung eine klare Schnittstelle bilden.
  11. Zentrifugieren in einem Schaufelrotor bei 3000 x g, 4 °C, für 10 min. Entsorgen Sie die oberen beiden Phasen vollständig mit einer P1000-Pipette.
    HINWEIS: Die durchsichtige FACS-Röhre ermöglicht die Visualisierung der drei verschiedenen Phasen nach der Zentrifugation (oben, interphasig, unten). Um eine maximale Entfernung von Schmutz zu erleichtern, wird empfohlen, beim Entfernen der oberen beiden Phasen aggressiver als konservativ zu sein (d. H. Das Entfernen einer kleinen Menge der unteren Phase ist dem Übertragen einer der oberen Phasen vorzuziehen; Ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus kann die Interphasenschicht zu dünn sein, um sie zu visualisieren. Entfernen Sie in diesem Fall die oberste (scheinbare) Schicht, die die Interphasenschicht enthält. Die unterste Schicht, die beibehalten wird, sollte ~ 1 ml Gesamtvolumen enthalten.
  12. Übertragen Sie die untere Schicht in ein 15 ml konisches Rohr, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist.
  13. In der konischen Röhre das Volumen mit Kernwaschpuffer auf 15 ml bringen und dreimal umkehren, um zu mischen.
  14. Zentrifugieren in einem Schaufelrotor bei 1000 x g, 4 °C, für 10 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
  15. Sofort in 150 μL Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze resuspendieren.
  16. Wechseln Sie zu einer Standard-Bohrungspipettenspitze, die auf ~300 μL eingestellt ist. Nehmen Sie die gesamte Probe auf und befestigen Sie dann einen 40-μm-Filter am Ende der Pipettenspitze, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht auszustoßen.
    HINWEIS: On-Tip-Filter sind notwendig, um kleinere Volumina zu erhalten, die benötigt werden, um eine ausreichende Kernkonzentration für nachgeschaltete Anwendungen aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel wird für snRNA-seq mit Mikrofluidik eine Mindestkonzentration von >300 Kernen/μL empfohlen, obwohl der optimale Bereich 700-1200 Kerne/μL18 beträgt. Höhere Konzentrationen von Kernen können bei Bedarf auch leicht verdünnt werden.
  17. Filtern Sie die Probe, indem Sie die Probe gewaltsam durch den Filter in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger DNA-Bindung ausstoßen. Das endgültige Elutionsvolumen sollte 120-150 μL betragen.
    HINWEIS: Durch die Filtration kann etwas Schaum entstehen. Dies scheint die Qualität der Kerne nicht zu beeinträchtigen.

4. Beurteilen Sie die Qualität der Kerne durch Mikroskopie

  1. In einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen 10 μL der filtrierten Probe mit 10 μL 0,4% Trypanblau-Lösung durch vorsichtiges Pipettieren mischen. Die Proben benötigen keine verlängerte Inkubationszeit und sind sofort nach dem Mischen mit Trypanblau-Lösung zur Visualisierung bereit.
  2. 10 μL der gefärbten Kerne werden in eine Kammer eines Zählkammerobjektträgers gegeben.
    HINWEIS: Alternativ können Sie 10 μL der gefärbten Kernprobe auf ein Hämozytometer oder einen Mikroskopieobjektträger geben und mit einem Deckglas abdecken.
  3. Beurteilung der Kernqualität durch Lichtmikroskopie.
    HINWEIS: Niedrigere Vergrößerungen sollten nur zum Vergrößern von Kernen verwendet werden, da Kerndefekte nur bei höheren Vergrößerungen (d. H. 60x oder höher) visuell sichtbar sind. Dieser Schritt kann schnell durchgeführt werden, um den Erfolg der Kernpräparation zu beurteilen, und erfordert keine sekundäre Analyse über die visuelle Inspektion hinaus. Hochwertige, intakte Kerne haben einen scharf definierten Rand20 (Abbildung 2A). Kerne schlechter Qualität weisen gestörte Kernmembranen, fleckige Trypanblau-Färbung in der Nähe der Kernmembran auf, die auf eine mögliche Nukleinsäureleckage hinweist, und/oder Anzeichen von Blasenbildung20 (Abbildung 2B). Es wird erwartet, dass gesunde Kerne einen Durchmesser von 10-15 μm haben.

5. Quantifizieren Sie Singulettkerne, Trümmer und Multiplet-Anteile durch Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die spezifische Terminologie und Schnittstelle der Durchflusszytometer-Software kann je nach Marke des Geräts unterschiedlich sein, aber diese Schritte sollten bei Bedarf leicht an andere Systeme angepasst werden können.

  1. In einem FACS-Röhrchen werden 10 μL der filtrierten Kernprobe in 90 μL des für die Durchflusszytometrie empfohlenen Puffers für eine Verdünnung von 1:10 resuspendiert. Zu diesem Zweck wird in dieser Studie 0,22 μm gefiltertes sterilisiertes PBS, pH 7,2, mit 2 mM EDTA und 0,5% BSA verwendet.
    HINWEIS: Obwohl diese Verdünnung für die meisten Kernvorbereitungen funktioniert, kann eine niedrigere Verdünnung (z. B. 1:5) erforderlich sein, um genügend Kerne für die Qualitätsbewertung im Falle einer Probe mit geringerer Ausbeute zu entnehmen (d. h. <30 Kerne / μL in der verdünnten Probe).
  2. Färben Sie die Proben mit Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml. Es ist keine Inkubationszeit erforderlich und die Kerne können sofort analysiert werden.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die Proben mit einer Endkonzentration von 0,1 μg/ml DAPI färben. Beachten Sie, dass DAPI auf einem anderen Fluoreszenzkanal als PI gelesen werden sollte (Vioblue-A V1-A-Kanal; Anregung bei 405 nm, Emission bei 450/50 nm).
  3. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer wie folgt:
    1. Richten Sie einen Arbeitsbereich ein:
      1. Lassen Sie das Durchflusszytometer im Aufnahmemodus. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Neuer Arbeitsbereich aus dem Dropdown-Menü. Geben Sie auf der Registerkarte "Experiment " im linken Bereich den Namen des Projekts und die Beispiel-ID in die entsprechenden Felder ein.
      2. Klicken Sie in der oberen linken Symbolleiste auf die Schaltfläche Neues Analysefenster (Punktdiagrammsymbol). Klicken Sie im Popupmenü auf das Feld mit drei Diagrammen (Plot 4t). Drei Plots werden auf dem Bildschirm angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysemodus in der oberen linken Symbolleiste (A-Symbol), so dass sie grau und nicht orange ist.
    2. Einrichten von Analysediagrammen:
      1. Ändern Sie die Achsen der drei Diagramme wie folgt, geordnet als X-Achse bzw. Y-Achse:
        Diagramm 1: X-Achse: FSC-A, Y-Achse: SSC-A
        Diagramm 2: X-Achse: HDR-T, Y-Achse: SSC-A
        Diagramm 3: X-Achse: PerCP-Vio700-A B3-A, Y-Achse: SSC-A
      2. Ändern Sie die Achsen, indem Sie auf die Achsenbeschriftung klicken und den gewünschten Kanal aus dem Dropdown-Menü auswählen.
      3. Legen Sie fest, dass die Plots mit einer farbcodierten Dichte versehen sind, indem Sie auf das quadratische graue "i"-Symbol klicken, das neben der oberen rechten Ecke jedes Diagramms angezeigt wird. Ein Eigenschaftenfenster mit einem Panel von Schaltflächen auf der linken Seite wird geöffnet. Klicken Sie im Eigenschaftenfenster auf das Symbol Streudiagramm (zweiter von oben links im Bedienfeld). Klicken Sie auf OK.
        HINWEIS: Der PerCP-Vio700-A B3-A Fluoreszenzkanal entspricht einer Anregung bei 488 nm und einer Emission im Bereich von 650-730 nm.
    3. Geräteeinstellungen einrichten:
      1. Klicken Sie im linken Bereich auf die Registerkarte Kanäle . Eine Liste aller Kanäle erscheint mit drei Kästchen auf der rechten Seite. Legen Sie B3, FSC-A und SSC-A auf Hlog fest, indem Sie auf den Abwärtspfeil in den jeweiligen ersten Feldern auf der rechten Seite klicken und Hlog aus dem Dropdown-Menü auswählen. Stellen Sie die Spannung von SSC auf 640 V, FSC auf 300 V und B3 auf 480 V ein, indem Sie diese Zahlen in die entsprechenden mittleren Felder rechts eingeben und die Eingabetaste drücken. Beachten Sie, dass das dritte Feld rechts ein Schalter ist, der abwechselnd zum Tippen verwendet werden kann.
      2. Legen Sie unter der Kopfzeile Trigger den FSC-Trigger auf 4 und den SSC- und B3-Trigger auf 0 fest, indem Sie auf den Pfeil nach unten klicken, sie aus dem Dropdownmenü auf der linken Seite auswählen, die Zahl in das Feld auf der rechten Seite eingeben und dann die Eingabetaste drücken. Beachten Sie, dass sich auf der rechten Seite ein Umschaltfeld befindet, das alternativ zur Eingabe verwendet werden kann.
        HINWEIS: PMT-Spannungen müssen für jedes einzelne Durchflusszytometriegerät optimiert werden, aber der Auslöser für Kerne muss niedriger sein als das, was typischerweise für Zellen verwendet wird. Außerdem sollte die Achsenskala auf h-log gesetzt werden.
    4. Geben Sie 100 μL in das Textfeld Probenvolumen und 50 μL in das Textfeld Uptake Volume auf der linken Seite des Flow-Softwarefensters ein. Stellen Sie sicher, dass der Parameter Sample mischen auf Mix Gentle eingestellt ist, um zu vermeiden, dass bei diesem Schritt Kerne lysiert werden. Drücken Sie auf das Dreieck innerhalb eines Kreises (Wiedergabesymbol ) in der unteren rechten Ecke, um den Fluss zu starten.
    5. Überprüfen Sie die Durchflussqualität:
      1. Verwenden Sie die Seitenstreufläche (SSC-A) im Vergleich zu HDR-T, um nach Luftblasen oder Klumpen in der Probe zu suchen. Stellen Sie sicher, dass dieses Diagramm ein glattes Kontinuum von Punkten ist. Luftblasen oder -klumpen führen zu leeren Bereichen im SSC-A- im Vergleich zu HDR-T-Diagramm.
      2. Überprüfen Sie das Diagramm der Seitenstreuung (SSC-A) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC-A), um sicherzustellen, dass die verwendeten Spannungen für die Probe korrekt sind.
        HINWEIS: Im Gegensatz zu Zellen lösen sich Kerne in einem Seitenstreu- vs. Vorwärtsstreudiagramm nicht vollständig aus Trümmern auf. Es sollte jedoch ein Cluster von Ereignissen mit hoher Dichte in der Mitte des Diagramms vorhanden sein, das den Kernen (wärmer gefärbt) entspricht, mit einer geringeren Ereignisdichte (kühler gefärbt) im Hintergrund, die Trümmern entspricht.
    6. Analysieren Sie die Anzahl und Qualität der Kerne:
      1. Doppelklicken Sie auf das Diagramm SSC-A vs. PerCp-Vio-700A, um eine vergrößerte Ansicht anzuzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche in der oberen linken Symbolleiste mit senkrechten Linien (Quadrant), um ein Quadrantentor auszuwählen. Klicken Sie dann auf eine beliebige Stelle im Diagramm SSC-A vs. PerCp-Vio-700A, und Quadranten werden innerhalb des Diagramms angezeigt.
      2. Klicken Sie auf eine beliebige Stelle der Quadrantentrennlinien, und schieben Sie den Cursor, um die Quadrantenplatzierung zu ändern. Platzieren Sie die Quadranten so, dass der obere linke Quadrant die äußerste linke Population (Trümmer) und der obere rechte Quadrant mehrere tropfenförmige Cluster (Kerne) enthält (siehe Abbildung 3 für die Gate-Einrichtung und Beispiele für Flow-Ergebnisse für typische Ergebnisse mit Vorbereitungen, die einen Schritt zur Entfernung von Trümmern enthalten oder nicht).
    7. Trümmer versus Kerne:
      1. Klicken Sie auf das quadratische graue "i"-Symbol in der oberen rechten Ecke des Diagramms, um das Eigenschaftenfenster zu öffnen. Klicken Sie auf die Registerkarte Regionsfunktionen . Listen von Plotbereichen und Funktionen werden angezeigt.
      2. Stellen Sie unter der Liste Regionen ein grünes Häkchen neben dem obersten Element sicher, um anzuzeigen, dass das gesamte Diagramm ausgewählt ist. Klicken Sie in der Liste Funktionen auf Count/μL , um ein grünes Häkchen zu erzeugen. Klicken Sie auf OK, und in jedem Quadranten wird eine Zählungs-/μL-Metrik angezeigt.
      3. Um unformatierte Zählungen und Prozentsätze anzuzeigen, wählen Sie bei Bedarf auf der Registerkarte Bereichsfunktionen die Option Anzahl und %-T aus. Die Anzahl/μL im oberen linken und rechten Quadranten entspricht der Trümmer- bzw. Kernausbeute.
    8. Singulett zählt:
      1. Der tropfenförmige Cluster ganz links im unteren Teil des oberen rechten Quadranten stellt Singuletts dar. Zeichnen Sie ein polygonales Tor um diese Population, indem Sie auf die Polygonschaltfläche (Polygon) in der oberen linken Symbolleiste klicken.
      2. Klicken Sie ein einzelnes Mal, schieben Sie die Maus, um mit dem Zeichnen zu beginnen, und klicken Sie erneut, um ein lineares Segment des Tors zu beenden und das nächste zu beginnen. Doppelklicken Sie, um das Tor zu beenden. Klicken Sie auf den Rand des Tors und schieben Sie die Maus, um das Tor neu zu positionieren.
      3. Klicken Sie auf die Scheitelpunkte des Tors, um die Form zu ändern. Zählungen/μL der Gated Population (Singlets) werden angezeigt. Dies ist die Konzentration der Kernvorbereitung mit der anfänglichen Verdünnung.
        HINWEIS: Die lineare Beziehung zwischen Vorwärtsstreufläche und Höhe 1:1, die üblicherweise zur Bestimmung der Singulettrate beim Fließen von Zellen verwendet wird, gilt nicht für Kerne und kann ignoriert werden.
    9. Berechnen Sie anhand der Konzentration der verdünnten Kernvorbereitung und des Verdünnungsfaktors die Konzentration der ursprünglichen Vorbereitung (z. B. für eine 1:10-Verdünnung multiplizieren Sie die beobachtete Konzentration mit 10). Konzentrationen ab >300 Kernen/μL sind für snRNA-seq geeignet.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Isolationsprotokoll für Killifische Hirnkerne ist speziell für die Killifische optimiert und in Abbildung 1 zusammengefasst. Neben der Kernextraktion beschreibt das Protokoll verschiedene Methoden zur Beurteilung der Qualität und Quantität isolierter Kerne. Abbildung 2 zeigt Beispiele für gesunde (Abbildung 2A) und ungesunde (Abbildung 2B) Kerne, die lichtmikroskopisch beurteilt wurden. Gesunde Kerne, die für die nachgeschaltete Analyse geeignet sind (Abbildung 2A), liegen als Singulettkerne mit intakten Membranen vor. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist der häufigste Fehlermodus dieses Protokolls (und anderer Kernisolierungsprotokolle) die Erzeugung von überlysierten Kernen, die durch beschädigte Kernmembranen gekennzeichnet sind. Dies führt häufig zur Verklumpung von Kernen und kann aufgrund des Austritts von Nukleinsäuren aus den aufgebrochenen Kernen zu Hintergrundsignalen in nachgeschalteten Anwendungen beitragen. Wenn eine übermäßige Verklumpung beobachtet wird, empfehlen wir, bei den Dounce-Schritten schonender zu sein und/oder die Inkubationszeiten im Lysepuffer zu reduzieren.

Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie, um die Anzahl der isolierten Kerne zu quantifizieren und den relativen Anteil der multiplen Kerne in einer Probe zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um den relativen Gehalt an kontaminierenden Trümmern, oft gerissenen Kernfragmenten und anderen Zelltrümmern zu bestimmen, die nachgeschaltete Assays in der Kernprobe beeinträchtigen können. Repräsentative Durchflussdaten sind in Abbildung 3 zu sehen. Ein qualitativ hochwertiges Kernisolierungsverfahren erzeugt: 1) eine kleine Trümmerfraktion und 2) eine hohe Fraktion von Singulett- versus Multipletkernen (> 80% der Kernfraktion). Die Verwendung der PI-Färbung, die Nukleinsäuren färbt, ermöglicht es, Singulettkerne von Trümmern und multiplen Kernen zu trennen. Abbildung 3A ist ein Beispiel für eine Vorbereitung, die durch Trümmer kontaminiert ist, während Abbildung 3B ein Beispiel für ein qualitativ hochwertiges Experiment ist.

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Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Isolierung von Killifish-Hirnkernen. Experimenteller Workflow zur Kernisolierung aus gefrorenen oder frischen Killifischen Gehirnen. Einmal isoliert und bewertet, können Kerne für verschiedene nachgeschaltete "Omics"-Analysen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Beurteilung der Kernqualität durch Mikroskopie. Die Kerne wurden 1:1 in einer Lösung von 0,4% Trypanblau gemischt und auf einem Echo-Revolve-Mikroskop durch Hellfeld-Bildgebung bei 60x visualisiert. (A) Ein Beispiel für einen hochwertigen Kern. Der Kern liegt als Singulett vor und die Kernmembran ist intakt. (B) Ein Beispiel für Kerne schlechter Qualität. Die Kernmembranen sind beschädigt, und die Kerne verklumpen zu einem Dublette, wahrscheinlich aufgrund des Austretens von klebriger DNA, die von der Spitze des obersten Kerns austritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Kernquantifizierung und Reinheitsbewertung mittels Durchflusszytometrie. Die Kernproben wurden mit einer 1:100-Verdünnung von PI angefärbt und auf einem Durchflusszytometer ausgeführt. Kerne sind in Singulett- und Multipletform im oberen rechten Quadranten von (A,B) vorhanden, wobei Sinchen die unterste Ereigniswolke sind, gefolgt von Dubletten, Tripletten usw. in aufsteigender Reihenfolge. Trümmer werden durch die Ereignisse in den beiden äußersten linken Quadranten markiert. (A) Ein Beispiel für eine minderwertige Kernvorbereitung, bei der der Schritt zur Entfernung von Trümmern weggelassen wurde und Trümmer >40% der Ereignisse ausmachen. (B) Ein Beispiel für eine hochwertige Kernprobe mit dem enthaltenen Schritt zur Entfernung von Trümmern. In diesem Beispiel machen Trümmer <10% aller vom Durchflusszytometer registrierten Ereignisse aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Probentyp (2 Gehirne)Durchschnittlicher Ertrag (4 unabhängige Präparate)
5-wöchige männliche Gehirne3,59 ± 1,76 x 105
10-wöchige männliche Gehirne6,41 ± 1,33 x 105
15-wöchige männliche Gehirne14,59 ± 2,05 x 105
5-wöchige weibliche Gehirne2,54 ± 0,75 x 105
10-wöchige weibliche Gehirne4,66 ± 1,29 x 105
15-wöchige weibliche Gehirne7,95 ± 3,51 x 105

Tabelle 1: Durchschnittliche erwartete Erträge von zwei Gehirnen afrikanischer türkisfarbener Killifische über Geschlecht und Alter hinweg. Die durchschnittlichen Ausbeuten, ausgedrückt als 105 Kerne, ± Standardfehler des Mittelwerts über vier unabhängige Kernpräparate in jeder Kategorie.

Ergänzende Abbildung 1: Vergleich der Qualität der Kernisolierung unter Verwendung von Standardprotokollen und unserem optimierten Protokoll über gefrorene Killifischhirne. (A) Beurteilung der Kernqualität durch Mikroskopie. Die Kerne wurden 1:1 in einer Lösung von 0,4% Trypanblau gemischt und auf einem Mikroskop durch Hellfeldbildgebung bei 60x visualisiert. (B) Quantifizierung der Kern- und Trümmerbelastung durch Durchflusszytometrie. Die Kernproben wurden mit einer 1:100-Verdünnung von PI angefärbt und auf einem Durchflusszytometer ausgeführt. (C) Zusammenfassung der Qualitätsbewertungsmetriken durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie mit den verschiedenen Benchmark-Protokollen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Schematische Darstellung der Schritte zur Schmutzbeseitigung. (A) Schema der Schichtung vor der Zentrifugation zur Entfernung von Trümmern. (B) Schema der Überstandentfernung nach Zentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mit dem hier vorgestellten Protokoll lassen sich hochwertige Kerne aus Killifischhirnen reproduzierbar erzeugen. Dieses Protokoll musste speziell für das Killifisch-Gehirn entwickelt werden, da typische Säugetier-basierte Gehirnkern-Isolationsprotokolle, die auf Killifisch-Gehirne angewendet wurden, durchweg zu einer schlechten Kernqualität in unseren Händen führten. Wir vermuten, dass dies auf den geringeren relativen Myelingehalt des Killifisch-Gehirns im Vergleich zu ihren Säugetier-Gegenstücken zurückzuführen ist, die als Reaktion auf die rauen Bedingungen, die für die Lyse von Säugetier-Gehirnzellen erforderlich sind, lysieren und verklumpen würden. Dieses Protokoll ist ein Fortschritt in den Bereichen Alterung und Killifische, da es die Erforschung der Gehirnalterung auf Einzelzellebene in einem kostengünstigen und zeiteffektiven Modell der Gehirnalterung von Wirbeltieren erleichtert.

Dieses Protokoll ist robust gegenüber frischen oder gefrorenen Proben, obwohl man bei der Verwendung von frischem oder gefrorenem Gewebe die nachgeschalteten Anwendungen berücksichtigen muss. Gefrorenes Gewebe ist oft praktisch, da es monatelang gesammelt und gelagert werden kann, während Proben gesammelt werden. Solche Proben können sicher für Anwendungen wie snRNA-seq verwendet werden. Das Einfrieren von Proben kann jedoch die Kernstruktur und damit die Fähigkeit zur genauen Messung der Chromatinlandschaft durch ATAC-seq21 stören. Daher wird für nachgelagerte Anwendungen wie Bulk-ATAC-seq oder snATAC-seq empfohlen, frisch sezierte Gehirne anstelle von gefrorenen Gehirnen zu verwenden. Da alle Schritte nach der Gehirnhomogenisierung parallel durchgeführt werden können, ist dieses Protokoll außerdem für den Betrieb mehrerer Proben in einem angemessenen Zeitrahmen geeignet, wodurch der RNA-Abbau durch längere Inkubation auf Eis begrenzt wird.

Darüber hinaus ist es unerlässlich, Puffer frisch (innerhalb von Stunden) nach der Kernextraktion vorzubereiten. Wir haben festgestellt, dass sowohl Reinigungsmittel als auch BSA unmittelbar vor Beginn des Protokolls zu den Puffern hinzugefügt werden müssen. Puffer, die nur Salze (PBS, NaCl usw.) enthalten, können als Konzentrate hergestellt, sterilisiert (0,22 μm) und unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. BSA-Stammlösungen können innerhalb weniger Tage nach der Kernextraktion (wenn sie aus einem Pulver hergestellt werden) hergestellt, sterilisiert und bei 4 °C gelagert werden, sollten jedoch den in diesem Protokoll verwendeten Puffern immer unmittelbar vor der Durchführung des Protokolls zugesetzt werden. Wir empfehlen jedoch, BSA-Lösungen am Tag des Protokolls vorzubereiten. Wenn Sie vorgefertigte BSA-Lösungen von Drittanbietern verwenden, wird empfohlen, frische, ungeöffnete Flaschen zu verwenden. Die Verwendung von frischem BSA führt im Allgemeinen zu einem geringeren Schmutzgehalt in den Zellkernvorbereitungen.

Unabhängig davon, ob frische oder gefrorene Proben als Input verwendet werden, ist es wichtig, die Kernqualität nach der Kernisolierung zu beurteilen. Obwohl dieses Protokoll speziell entwickelt wurde, um Überlyse zu vermeiden, ist dies die häufigste Ursache für den Verlust der Kernqualität. Die Überlyse kann durch zu viel Zeit im Lysepuffer, eine zu raue Handhabung der Kerne wie übermäßiges Pipettieren mit einer Standardpipettenspitze oder eine übermäßige Zeitspanne zwischen der Kernisolierung und nachgeschalteten Anwendungen (>1 h) entstehen. Überlysierte Kerne haben oft beschädigte Kernperipherien, die DNA austreten und Verklumpungen verursachen (Abbildung 2B). Dies wird zu einer erhöhten Anzahl von Multiplets führen und Hintergrundnukleinsäuren beitragen, die nachgelagerte Anwendungen, insbesondere snRNA-seq, stören. Beide Eigenschaften können nach Kernisolierung mikroskopisch beurteilt werden. Wenn eine übermäßige Kernverklumpung beobachtet wird, empfehlen wir, die Inkubation im Lyseschritt zu verkürzen, um die Wahrscheinlichkeit einer Überlyse zu verringern. Als alternative Methode zur Erhöhung der Nuklei-Singlets kann die fluoreszenzunterstützte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um Singlets stromabwärts dieses Protokolls anzureichern. Wir stellen jedoch fest, dass bei der Arbeit mit bereits fragilen Kernen aus gefrorenem Gewebe die während der Sortierung auftretende Scherspannung zu einem erhöhten Kernbruch und damit zu einer erhöhten Umgebungs-RNA / DNA führen kann. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die Zeit, die benötigt wird, um eine FACS-Ertragssortierung für Kerne durchzuführen, wenn mehrere Proben verarbeitet werden, erfordern würde, dass alle Kernproben stundenlang auf Eis bleiben, während andere Proben sortiert werden. Daher könnten längere Wartezeiten bei der parallelen Verarbeitung mehrerer Proben mit dem FACS-Ansatz wahrscheinlich auch zu einer insgesamt reduzierten Kernqualität führen und das Risiko eines RNA-Abbaus erhöhen. Wenn also FACS für eine reduzierte Doublet-Rate gewünscht wird, empfehlen wir, den Schmutzgehalt nach der Ausbeutesortierung erneut zu überprüfen und eine mögliche reduzierte RNA-Qualität für Einzelzell-RNA-seq-Anwendungen als möglichen Vorbehalt zu berücksichtigen.

Eine genaue Schätzung der Kernzahl und des Singulettanteils ist für fast alle nachgeschalteten "Omics"-Anwendungen unerlässlich und von größter Bedeutung. Aufgrund der Fähigkeit, Kerne einfach nach Größe zu toren und zu zählen, ist die Durchflusszytometrie die genaueste Methode zum Zählen von Kernen, die wir bewertet haben. Alternativ kann man Zellzähler mit Zellzählern wie Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter oder dem DeNovix CellDrop Automated Cell Counter quantifizieren. Zu beachten ist, dass Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter und in viel geringerem Maße der DeNovix dazu neigen, die Anzahl der Kerne zu überschätzen, indem sie Trümmer als Kerne zählen, was bedeutet, dass ein manuelles Größengating erforderlich sein kann. Darüber hinaus ermöglicht das Durchflusszytometer eine einfache Beurteilung der Reinheit der Kerne. Man kann das relative Verhältnis von Singulett- und Multipletkernen auf eine quantitative Weise erkennen, die durch Mikroskopie schwierig ist. Dies ist für snRNA-seq und snATAC-seq von entscheidender Bedeutung, da diese Protokolle unter einem Überschuss an Multiplet-Proben leiden, die von nachgelagerten Analysen ausgeschlossen werden müssen. Neben Multipleten kann der relative Anteil von "Trümmern" (fragmentierte Kerne, Zelltrümmer) durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden und muss relativ gering sein, da dieses Material oft kontaminierende Nukleinsäuren enthält, die ein Hintergrundsignal und korrumpierende Einzelkern-"Omics"-Daten beitragen können.

Wie bei zuvor beschriebenen Kernisolierungsprotokollen können die Anteile der Zelltypen im ursprünglichen Gewebe in der Zellkernvorbereitung19 nicht originalgetreu rekapituliert werden und sollten daher mit Vorsicht interpretiert werden. Wie alle Teleosts haben afrikanische türkisfarbene Killifische kernhaltige Erythrozyten, von denen erwartet wird, dass sie auch in der Kernvorbereitung vertreten sind. Diese Kerne können in snRNA-seq- und snATAC-seq-Datensätzen durch die höhere Expression/Zugänglichkeit von Hämoglobingenen identifiziert und rechnerisch ausgeschlossen werden, falls gewünscht.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Einige Panels wurden mit BioRender.com generiert. Diese Arbeit in unserem Labor wurde durch das NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant an B.T., ein Stipendium der Simons Foundation im Rahmen der Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, ein Pilotstipendium der Navigage Foundation und ein Hanson-Thorell Family Award an B.A.B.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4% Trypanblau-LösungGibco15250061
10x PBSBiolandPBS01-03
15 mL Konikel-ZentrifugenröhrchenVWR89039-664
2 mL Tissue GrinderKimble885300-0002Dounce Homogenisator
5 mL Polystyrol RundbodenröhrchenFalcon352054
5M Natriumchlorid, PromegaV4221
autoMACS SpüllösungMiltenyi Biotec130-091-222Dies entspricht 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (für die Durchflusszytometrie)
Lösung zur Entfernung von AblagerungenMiltenyi Biotec130-109-398
DNA LoBInd TubeEppendorf22431021
Echo Revolve Mikroskop (bestückt mit 60x Objektiv)EchoNAKeine Katalognummer; Wird zur visuellen Inspektion von Kernen verwendet.
Falcon Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, 5 mLFalcon352052FACS-Röhrchen
FLOWMI Zellsiebe, 40 μ MSP Bel-Art136800040Im Protokoll als On-Tip-Filter
SalzsäureSigma-Aldrich258146-500 mLWird verwendet, um den TRIS-pH-Wert von 8,0 auf 7,4
zu senken Leica EZ4 PräparierendoskopLeicaNAKeine Katalognummer
MACS BSA LagerlösungMiltenyi Biotec130091376
MACS SmartStrainers (70 μ M)Miltenyi Biotec130-110-916
MACSQuant Analyzer 10 DurchflusszytometerMiltenyi BiotecNAKeine Katalognummer
Magnesiumchlorid, Hexahydrat, Molekularbiologische Qualität (Pulver)Millipore442611
Megafuge 16R ZentrifugeThermoScientific75003629
Micro Cover GlasVWR48393081
Micro Slides Superfrost PlusVWR48311-703
Nonidet P-40 ErsatzRoche(Roche) 11332473001/ Katalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich)
NP-40 Surfact-Amps WaschmittellösungThermoFisher85124
Nukleasefrei HyPure Wasser HyClone in molekularbiologischer QualitätSH30538.02
NxGen RNase Inhibitor (50.000 U)Lucigen30281-2
Propidiumiodid-LösungMBLFP00010020
PureBlu DAPI Nuclear Staining DyeBiorad1351303
TipOne RPT Pipettenspitzen (extrem niedrige Retention, gefiltert) in 10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1000 µ L-GrößenUSA Scientific#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830
Tricaine-S (MS 222)SyndelTricaine10GSyndel ist ein von der FDA zugelassener Anbieter von Tricain TRIS
, 1 M, pH 8,0VWRE199-500 mL
Pipettenspitzen mit breiter BohrungAxygenT-1005-WB-C
bezeichnet

Referenzen

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