Methodenartikel

Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

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DOI:

10.3791/64178

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24. August 2022

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1Yunnan Eye Institute & Key Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center, Affiliated Hospital of Yunnan University, Yunnan University, 2Institute for Ophthalmic Research, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Zusammenfassung

Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 - oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.

Einleitung

Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht1. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.

Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist4. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt 5. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.

Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist 2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.

Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht13. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP14 retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.

Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.

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Protokoll

Die Tierstudie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IACUC-PE-2022-06-002) und der Tierethikprüfung und dem Tierprotokoll der Universität Yunnan (YNU20220149) geprüft und genehmigt.

1. Herstellung von Netzhautexplantaten

  1. Die Augäpfel von Primaten werden von Wildtyp-Makaken im Alter von 1 bis 3 Jahren gewonnen, in einer Gewebeaufbewahrungslösung gelagert und innerhalb von 3 Stunden nach der Enukleation nach der Tötung der Affen oder nach dem natürlichen Tod auf Eis transportiert.
  2. Für die Herstellung der Proteinase-K-Lösung werden 25 mg Proteinase K in 250 μl destilliertem Wasser gelöst und dann 225 μl der Lösung zu 18,5 ml Basalmedium (R16) gegeben.
  3. Waschen Sie die Augäpfel 30 s lang in 10 ml 5%igem Povidon-Jod (Povidon-Jod: Wasser = 1:19) und tauchen Sie sie 1 Minute lang in 5%iges Penicillin/Streptomycin (PEN/STREPTOK):p Hosphat-gepufferte Kochsalzlösung = 1:19, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie dann die Augäpfel 5 Minuten lang in 10 ml R16-Medium.
  4. Die Proteinase-K-Lösung in einem 37 °C heißen Inkubator vorwärmen. Tauchen Sie dann die Augäpfel in 10 ml Proteinase-K-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang. Tauchen Sie die Augäpfel in 10 ml R16 + fötales Kälberserum (1:1) Lösung, inkubieren Sie sie 5 Minuten lang und übertragen Sie dann die Augäpfel für eine letzte Wäsche in 10 ml frisches R16.
  5. Trennen Sie die Lederhaut, die Hornhaut, die Iris, die Linse und den Glaskörper ab und schneiden Sie die Netzhaut von 4 Seiten mit einer Pinzette und einer Schere ab (Abbildung 1A-L).
  6. Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen in fünf Abschnitte - eine 4-mm-Trepanklinge für die nasale/temporale/obere/untere Seite und eine 6-mm-Trepanklinge für die zentrale Seite (enthält Papille und Makula; Abbildung 1M-O). Schnitt in folgendem Abstand vom Sehnervenkopf: 1,5 mm für die Nasalseite, 4 mm für die Schläfenseite und 2 mm für die obere und untere Seite.
  7. Übertragen Sie die Netzhautexplantaten (die Netzhaut und Aderhaut enthalten) mit einem Augenlidspatel und legen Sie sie mit der Photorezeptorseite nach oben in die Mitte des Einsatzes (Abbildung 1P). Geben Sie ca. 1 ml des vollständigen Mediums (R16 ergänzt mit BSA, Transferrin, Progesteron, Insulin, T3, Corticosteron, Vitamin B1, Vitamin B12, Retinol, Retinylacetat, DL-Tocopherol, Tocopherylacetat, Linolsäure, L-Cystein HCl, Glutathion, Glutamin, Vitamin C) unter die Membran auf der Platte, um die Netzhaut vollständig zu bedecken.

2. Retinale Explantatkultur von Primaten

  1. Kultivieren Sie Netzhautexplanta in vollständigem Medium und stellen Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator, der mit befeuchteten 5 % CO2 belüftet ist.
  2. Wenden Sie die medikamentöse Behandlung in geeigneter Konzentration auf das Netzhautkulturmedium an (z. B. Zapinast in Konzentrationen von 100 μM, 200 μM oder 400 μM). Verwenden Sie mindestens drei Explantaten pro Behandlungsbedingung und verwenden Sie Explantate ohne Medikament als Kontrolle. Behandeln Sie mit dem Medikament für 4 Tage.

3. Fixierung und Kryo-Sektion

  1. Netzhautexplanta werden 45 min lang mit 1 ml Paraformaldehyd (PFA) inkubiert, kurz mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann 10 min lang mit 10 % Saccharose, 20 min mit 20 % Saccharose und 30 min mit 30 % Saccharose inkubiert (1 ml für jedes Netzhautexplantat).
  2. Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen, um die Konsistenz der Größe der Explantate zu gewährleisten, die an verschiedenen Stellen mit den folgenden Merkmalen gewonnen werden: vier Quadranten in der Peripherie, 6 mm in der Mitte. Anschließend werden die Netzhautexplantaten in eine Blechdose (ca. 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) mit O.C.T.-Einbettmedium überführt, um das Gewebe zu bedecken. Die Gewebeschnitte sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und zur Lagerung in einen -20 °C warmen Kühlschrank stellen.
  3. Schneiden Sie den Agar mit einer scharfen Klinge in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe, schneiden Sie die Probenblöcke in 10-μm-Abschnitte und legen Sie sie mit einem weichen Pinsel auf Objektträger des Haftmikroskops. Anschließend 45 min bei 40 °C trocknen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.

4. Immunhistochemie (Abbildung 2)

  1. cGMP-Färbung
    1. Trocknen Sie die Objektträger und zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker-Stift einen hydrophoben Ring um die Netzhautabschnitte, um die Proben zu bedecken.
    2. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 200 μl 0,3 % Phosphatpuffer-Kochsalzlösung und Triton X-100 pro Objektträger (PBST) und dann 1 h lang bei Raumtemperatur in Blockierlösung (5 % normales Eselsserum, 0,3 % PBST, 1 % BSA, 200 μl pro Objektträger).
    3. Inkubieren Sie die Proben über Nacht mit dem Primärantikörper (1:250, Schaf-Anti-cGMP, 200 μL pro Objektträger), der in der Blockierungslösung bei 4 °C vorbereitet wurde, und spülen Sie sie dann 3x 10 min (200 μl pro Objektträger) mit PBS ab.
    4. Inkubieren Sie die Proben mit einem Sekundärantikörper (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL pro Objektträger) für 1 h bei Raumtemperatur und spülen Sie sie dann 3x 10 min lang mit PBS ab. Decken Sie die Proben mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium ab, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lagern Sie sie vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
  2. TUNEL-Färbung
    1. Trocknen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie mit dem Liquid Blocker Pen einen wasserabweisenden Barrierering um Netzhautgewebeproben und inkubieren Sie sie dann 15 Minuten lang in 40 ml PBS.
    2. Inkubation der Objektträger in 42 ml (pro fünf Objektträger) TBS (0,05 M Tris-Puffer) bei 37 °C. Aspirieren Sie das TBS und inkubieren Sie die Proben mit 6 μl Proteinase K für 5 Minuten. Waschen Sie dann die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
    3. Setzen Sie die Objektträger 40 ml Ethanol-Essigsäure-Lösung im Collin aus, decken Sie sie mit einer transparenten Folie ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei -20 °C. Waschen Sie die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
    4. Setzen Sie die Objektträger einer Blockierlösung (1 % BSA; 200-300 μl pro Objektträger, je nach Bedarf) aus und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer.
    5. Bereiten Sie die TUNEL-Kit-Lösung, TMR rot, im folgenden Verhältnis vor: 62,50 μl Blockierlösung (1 % BSA), 56,25 μl Markierungslösung (TMR-dUTP) und 6,25 μl des Enzyms (Anteil für jeden Objektträger). Geben Sie ca. 130 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C. Waschen Sie dann die Objektträger 5 Minuten lang (200 μl pro Objektträger) 2x mit PBS.
    6. Legen Sie Abdeckobjektträger mit 1-2 Tropfen Antifade-Einbettmedium mit DAPI über die Proben und inkubieren Sie die Objektträger vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
  3. cGMP-Färbung kombiniert mit TUNEL-Färbung
    1. Auf die cGMP-Färbung folgte die TUNEL-Färbung. Befolgen Sie die Schritte der TUNEL-Färbung von Schritt 4.2.1 bis Schritt 4.2.5 und fahren Sie dann mit den Schritten der cGMP-Färbung von Schritt 4.1.2 bis Schritt 4.1.4 fort.
  4. Führen Sie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie mit den folgenden Kameraparametern durch: Belichtungszeit = 125 ms, ROI-Größe = 2752 x 2208, Farbe = S/M. Nehmen Sie Bilder mit der Software auf. Nehmen Sie mit einer Digitalkamera vier verschiedene Felder mit 20-facher Vergrößerung aus jedem Schnitt auf und erhalten Sie repräsentative Bilder aus den zentralen Bereichen der Netzhaut mit DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), wobei Z-Stack-Scans ein Intervall = 1 μm und optional = 1,251 μm haben.

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Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Netzhautexplantatkultur von Makakenaffen mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten (Abbildung 1, ergänzende Abbildung S1). Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen.

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Diskussion

Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe Sehen ve...

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960180), der Zinke Heritage Foundation und der Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01) unterstützt. Wir danken Prof. Longbao Lv (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, China) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Affenaugäpfel.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaB2064Blockierungslösung
CorticosteronSigmaC2505Ergänzungen des vollständigen Mediums
DL-TocopherolSigmaT1539Ergänzungen des vollständigen Mediums
Esel gegen Schafe, Alxea Fluor 488Life Technologies CorporationA11015Sekundärantikörper von cGMP
Ethanol-Essigsäure-LösungShyuanyeR20492Fixierflüssigkeit
Fötales KälberserumGemini900-108Blockierungslösung
FluoreszenzmikroskopCarl ZeissAxio Imager.M2Immunfluoreszenz-Bildgebung
GlutaminSigmaG8540Ergänzungen des vollständigen
Mediums GlutathionSigmaG6013Ergänzungen des Complete
Medium In Situ Cell Death Detection Kit, TMR rotRoche12156792910TUNEL Assay
InsulinSigma16634Ergänzungen des Complete Mediums
L-Cystein HClSigmaC7477Supplements des Complete Mediums
LinolsäureSigmaL1012Supplements des Complete Mediums
MACS Tissue Storage LösungMiltenyi130-100-008Optimierte Lagerung von frischen Organ- und Gewebeproben
Normales EselserumSolarbioSL050Blockierungslösung
Paraformaldehyd (PFA)BiosharpBL539AFixiermittel
PEN. / STREP. 100 mal;MilliporeTMS-AB2-CPenicillin / Streptomycin Antibiotika
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)SolarbioP1010Pufferlösung
Povidon-JodShanghailikang310411Desinfektionsmittel
ProgesteronSigmaP8783Ergänzungen des vollständigen Mediums
Proteinase KMillpore539480Protein abbauen
R16 MediumLife Technologies Corporation074-90743ABasismedium
RetinolSigmaR7632Nahrungsergänzungsmittel aus Complete
Medium RetinylacetatSigmaR7882Supplements of Complete
Medium Schaf Anti-cGMPJan de Vente, Universität Maastricht, NiederlandePrimärer Antikörper von cGMP
SaccharoseGHTECH57-50-1Dehydratisierungsmittel
T3SigmaT6397Ergänzungen des vollständigen
Mediums Tissue-Tek Medium (O.C.T. Compound)SAKURA4583Einbettmedium
TocopherylacetatSigmaT1157Ergänzungen des vollständigen Mediums
TransferrinSigmaT1283Ergänzungen des vollständigen Mediums
TranswellCorning Incorporated3412Zell- / Gewebekultur
Tris-Puffer (TBS)SolarbioT1080Blockierungspuffer
Triton X-100Solarbio9002-93-1Oberflächenaktiver
Wirkstoff VECTASHIELD Medium mit DAPIVektorH-1200Eindeckmedium
Vitamin B1SigmaT1270Ergänzungen des Komplettmediums
Vitamin B12SigmaV6629Ergänzungen des vollständigen Mediums
Vitamin CSigmaA4034Ergänzungen des vollständigen Mediums
ZaprinastSigmaZ0878PDE6-Inhibitor
Zeiss Imager M2 Mikroskop  Zeiss, Oberkochen,Deutschlandaufrechtes Mikroskop
LSM 900 Airyscanhochauflösendes Laserscanning-Mikroskop
Zeiss Axiocam  Zeiss, Oberkochen,DeutschlandDigitalkamera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primaten-Augäpfel von Wildtyp-MakakenKUNMING INSTITUT FÜR ZOOLOGIESYXK (figure-materials-1) K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL Kit-Lösung (REF12156792910, Roche, Deutschland),

Referenzen

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