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Früherkennung pathologischer und magnetischer Resonanztomographie von Hirnschäden anhand eines Rattenmodells der neonatalen hypoxischen ischämischen Enzephalopathie

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DOI:

10.3791/64183

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28. Oktober 2022

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1Department of Pediatrics, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Chemistry, University of Prince Edward Island, 3Center for Neuroscience, University of Oklahoma Health Sciences Center, 4Oklahoma Medical Research Foundation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Nagetiermodell der hypoxisch-ischämischen Schädigung von Neugeborenen zur Identifizierung früher Veränderungen im Hirngewebe durch grobe Morphologie und Magnetresonanztomographie. Dies hat Vorteile gegenüber bestehenden Modellen, die zur Untersuchung von Spätverletzungen verwendet werden können, aber keine Bewertung reproduzierbarer früher Veränderungen ermöglichen.

Zusammenfassung

Die perinatale hypoxisch-ischämische Enzephalopathie (HIE) ist eine akute Erkrankung, die Neugeborene betreffen kann und zu unterschiedlichen lang- und kurzfristigen Ergebnissen der neurologischen Entwicklung führt. Eine frühzeitige Diagnose ist entscheidend, um Säuglinge zu identifizieren, die von einer Intervention profitieren könnten. Die Früherkennung hängt jedoch stark von klinischen Kriterien ab. Keine molekularen oder radiologischen Tests haben sich als vielversprechend erwiesen, um frühe Hirnschäden zu erkennen. Studien haben gezeigt, dass die Magnetresonanztomographie (MRT) Veränderungen sowohl des Blutflusses/der Ischämie als auch der Stoffwechselstörung zeigen kann. Sie wurden jedoch alle verwendet, um die sekundäre Phase der Erkrankung (>12 h) nach Beginn der Verletzung zu bewerten. Eine frühzeitige Diagnose ist entscheidend für einen raschen Beginn der therapeutischen Hypothermie bei geeigneten Säuglingen, die derzeit innerhalb von 6 Stunden nach der Geburt eingeleitet werden sollte. Das Rattenmodell der hypoxisch-ischämischen Schädigung wurde 1981 entwickelt und validiert und ausgiebig verwendet, um Veränderungen der Hirnperfusion, der Marker für zerebrale Verletzungen und der Morphologie zu untersuchen. Es wurde jedoch in erster Linie als "spätes Modell" verwendet, um die Verletzung einige Tage nach der ersten ischämischen Beleidigung zu bewerten. Es ist bekannt, dass das Modell eine geringe Sensitivität bei der Bewertung zuverlässiger und reproduzierbarer früher zerebraler Veränderungen aufweist. Das Ziel dieser Studie war es, ein zuverlässiges Modell zu entwickeln, um frühe grobmorphologische und radiologische Marker der HIE mittels pathologischer Färbung und zerebraler Magnetresonanztomographie/Magnetresonanzspektroskopie zu untersuchen.

Einleitung

Die hypoxische ischämische Enzephalopathie (HIE) ist eine verheerende Erkrankung, die auf verschiedene Faktoren bei Neugeborenen zurückzuführenist 1. Perinatale Asphyxie und/oder die Störung des zerebralen Blutflusses können zu fokalen oder globalen ischämischen Veränderungen im Gehirn führen2. Die Inzidenzrate liegt bei etwa 1,6 von 1.000 Lebendgeburten, kann aber in Entwicklungsländern bis zu 12,1 von 1.000 Lebendgeburten betragen3. Diese Erkrankung führt zu einer hohen Sterblichkeit (20 %-50 %), während 25 % der Überlebenden wahrscheinlich an einer langfristigen neuronalen Behinderung wie geistiger Behinderung, Epilepsie oder Zerebralparese leiden4. Die einzige therapeutische Intervention, die sich bei leichten bis mittelschweren Verletzungen als wirksam erwiesen hat, ist die therapeutische Hypothermie, die innerhalb von 6 h nach der Geburt eingeleitet werden muss 5,6,7,8,9. Dies kann zwar dazu beitragen, metabolische Veränderungen zu verhindern, die zu sekundären Verletzungen führen, aber es kann auch zu Nebenwirkungen wie Hypotonie, Thrombozytopenie, verlängerter Gerinnungszeit, intrakraniellen Blutungen, Herzrhythmusstörungen, Fettnekrosen und einem Elektrolytungleichgewicht im Serumkommen 4,5. Die frühzeitige Diagnose von HIE bei Babys ist oft schwierig, da die Kriterien subjektiv sind und stark von den Befunden der körperlichen Untersuchung abhängen, die sich im Laufe der Zeit weiterentwickeln. Die Magnetresonanztomographie kann mehrere Tage bis Wochen nach der Verletzung Veränderungen zeigen, die eine Verletzung widerspiegeln. Morphologische Veränderungen in der T1/T2-MRT können jedoch bei bis zu zwei Dritteln der mittelschweren Enzephalopathie normal sein, der Kategorie von Säuglingen, die am ehesten von einer therapeutischen Hypothermie profitieren10. Jüngsten Berichten zufolge kann die Magnetresonanzspektroskopie (MRS) frühe Veränderungen zeigen, die mit der HIE11 bei Neugeborenen korrelieren. Bisher wurde jedoch keine Standardisierung oder Validierung durchgeführt.

Viele Forscher verlassen sich auf Tiermodelle, um mögliche diagnostische oder therapeutische Eingriffe bei zerebrovaskulären Verletzungen zu bewerten. Die am häufigsten verwendete Methode, um einen Infarkt zu erzeugen, ist die Ligatur der mittleren Hirnarterie von Nagetieren12,13. Während dies häufig zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls bei Erwachsenen verwendet wird, ist dies bei neonatalen Nagetieren aufgrund der geringen Größe und der Zerbrechlichkeit der Jungtiere in einem Alter, das der Krankheit des menschlichen Neugeborenen entspricht, technisch schwierig. Darüber hinaus repräsentiert sie nicht die globalen zerebralen ischämischen Veränderungen, die bei HIE wahrscheinlich zu beobachten sind. Das Rice-Vanucci-Modell14 der einseitigen Karotis-Arterien-Ligatur bei Ratten wird seit den 1980er Jahren als kostengünstiges Nagetiermodell zur Untersuchung hypoxisch-ischämischer Hirnverletzungen verwendet. Es gibt jedoch eine große Variabilität bei frühen zerebrovaskulären Veränderungen und eine hohe Mortalität in früheren Experimenten. Die meisten Studien berichten über die zerebrale Schädigung in langfristigen Veränderungen (d.h. nach 24 Stunden Verletzung), die konsistenter sind. Ziel dieser Studie war es, einen Ansatz zur Bewertung früher (innerhalb von 6 Stunden) molekularer und radiologischer Veränderungen in einem Rattenmodell der HIE zu entwickeln. Das Protokoll wurde entwickelt, um eine Ischämie in einem frühen Alter (Äquivalent zum Neugeborenen) sicherzustellen und das Überleben der Welpen zu erhöhen, insbesondere während der Exposition gegenüber Hypoxie. MRT/MRS wurden verwendet, um radiologische Hinweise auf veränderten Fluss, Veränderungen des Hirngewebes und metabolische Veränderungen innerhalb von 6 Stunden nach der Verletzung zu bewerten. Eine grobmorphologische Bewertung der Infarktbereiche wurde ebenfalls durchgeführt. Eine weitere Validierung der Reproduzierbarkeit erfolgte durch Wiederholung der Experimente in mehreren Würfen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF) genehmigt (Protokoll IACUC #17-17). Für die vorliegende Studie wurden trächtige weibliche Sprague-Dawley-Rattenbabys bei E14 verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Akklimatisieren Sie die Tiere vor der Abgabe der Würfe in der Tieranlage.
  2. Halten Sie alle Ratten auf a12 h Hell-/Dunkelzyklus und füttern Sie Standard-Rattenfutter.
  3. Nach der Abgabe der Würfe behalten Sie die Welpen bei ihren jeweiligen Müttern. Verwenden Sie beide Geschlechter für die Experimente.
  4. Im postnatalen Alter von 10 Jahren (P10) werden die Welpen entweder in Schein- oder HIE-Gruppen randomisiert.
    HINWEIS: Der Zeitplan für die Experimente ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle Experimente wurden am selben Tag in P10 durchgeführt.

2. Karotis-Ligatur (CAL) für die experimentelle HIE-Gruppe

  1. Lege die Rattenbabys auf ein Wärmekissen.
  2. Die Anästhesie mit 4 % Isofluran in Sauerstoff (0,6 LPM) über einen Nasenkegel einleiten, bis der Einklemmreflex verschwindet. Verringern Sie den Gasfluss auf 0,5 % bis 2 %, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass die Welpen bewusstlos sind, ohne den Atemantrieb zu unterdrücken.
  3. Markieren Sie die Welpen zur Identifizierung am Schwanz und halten Sie sie vorsichtig mit Klebeband an allen vier Gliedmaßen fest.
  4. Rasieren Sie den Halsbereich und sterilisieren Sie ihn mit 70%igen Jod-Povidon-Lösungstupfern (siehe Materialtabelle).
  5. Machen Sie mit einer Klinge #11 einen 1 cm langen Schnitt in der Mitte des Halses durch die Haut. Präparieren Sie vorsichtig die linke Ohrspeicheldrüse und die Faszie, bis die linke Halsschlagader freiliegt. Mobilisieren Sie das Gefäß sanft mit Hämostaten, um es von der Faszie zu befreien.
  6. Führen Sie mit einem kleinen Hämostaten vorsichtig zwei 5-0-Nähte (siehe Materialtabelle) im Abstand von 0,5 cm um das Gefäß und binden Sie sie fest.
  7. Schneiden Sie mit einer kleinen Schere die Arterie zwischen den beiden Nähten auf, um die Unterbrechung des Blutflusses zu gewährleisten. Verschließen Sie Haut und Faszie mit 5-0 Seidenfäden (siehe Materialtabelle).
  8. Injizieren Sie Buprenorphin (10 Einheiten in 800 μl steriler normaler Kochsalzlösung) intraperitoneal und weitere 800 μl normale Kochsalzlösung subkutan in den Nacken, um eine Dehydrierung zu verhindern.
    HINWEIS: Der Vorgang muss innerhalb von 10-12 Minuten abgeschlossen sein.
  9. Setzen Sie die Jungtiere mit ihren Muttertieren in die Käfige zurück und lassen Sie die Jungtiere 1-2 Stunden lang aufwachen und sich erholen.

3. Scheinchirurgischer Eingriff für die Kontrollgruppe

  1. Lege die Rattenbabys auf ein Wärmekissen.
  2. Die Anästhesie mit 4 % Isofluran in Sauerstoff (0,6 LPM) über einen Nasenkegel einleiten, bis der Einklemmreflex verschwindet. Verringern Sie den Gasfluss auf 0,5 % bis 2 %, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass die Welpen bewusstlos sind, ohne den Atemantrieb zu unterdrücken.
  3. Markieren Sie die Welpen zur Identifizierung am Schwanz und halten Sie sie vorsichtig mit Klebeband an allen vier Gliedmaßen fest.
  4. Rasieren Sie den Halsbereich und sterilisieren Sie ihn mit 70% igen Jod-Povidon-Lösungstupfern.
  5. Machen Sie mit einer Klinge #11 einen 1 cm langen Schnitt in der Mitte des Halses durch die Haut und schließen Sie ihn dann mit 5-0 Seidennähten.
  6. Befolgen Sie die gleiche Flüssigkeitszufuhr, Analgesie und postoperative Pflege wie für die HI-Gruppe (Schritte 2.8-2.9).

4. Hypoxie-Exposition sowohl für die CAL- als auch für die Schein-Gruppe

  1. Bereiten Sie die Hypoxiekammer aus klarem Plexiglas vor (siehe Materialtabelle), indem Sie einen Schlauch am Kammerdeckel anbringen, um einen kontinuierlichen Luftstrom von 6 l/min des Hypoxiegasgemisches (8 % Sauerstoff, 92 % Stickstoff) zu gewährleisten.
  2. Legen Sie ein blaues Saugkissen in die Kammer und legen Sie sofort die Rattenbabys aus beiden Gruppen in die Kammer. Lassen Sie die Welpen 45 Minuten in der Hypoxiekammer bleiben.
  3. Tauchen Sie die Kammer in ein Wasserbad mit kontinuierlich fließendem warmem Wasser, um die Temperatur in der Kammer auf 37 °C einzustellen.
  4. Hydratisieren Sie die Welpen mit einer oralen Kochsalzlösung über eine Sonde von 600 μl, bevor sie in die Hypoxiekammer gelegt werden, und 600 μl am Ende der 45 Minuten.
  5. Bringen Sie alle Jungtiere mit ihren Muttertieren (Versuchs- und Scheintiere) in die Käfige und lassen Sie sie sich 2 Stunden lang in einem Raum neben der Kleintierbildgebungseinrichtung erholen.

5. Magnetresonanztomographie und Spektroskopie

  1. Durchführung von MRT und MRS zur Identifizierung und Bewertung der radiologischen und metabolischen Marker 4 h nach dem Ende der Karotis-Ligatur. Führen Sie den Eingriff unter Narkose mit kontinuierlicher kardiovaskulärer Überwachung in der Bildgebungseinrichtung für Kleintiere durch.
  2. Betäuben Sie jedes Tier (mit 1,5 % Isofluran und 0,7 l/min Sauerstoff) und legen Sie es in Rückenlage in die MRT-Sonde (siehe Materialtabelle) auf ein blaues Saugkissen, das ein Heizkissen bedeckt. Überwachen Sie die Atemfrequenz der Tiere kontinuierlich mit einem pneumatischen Bauchkissen (siehe Materialtabelle).
  3. Verwenden Sie eine Kopfoberflächenspule als Signalempfänger und übertragen Sie hochfrequente Impulse über eine Quadraturvolumenspule (72 mm Innendurchmesser, siehe Materialtabelle) an die Probe.
  4. Führen Sie eine MRT durch, um sowohl die Veränderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) als auch die Änderungen der Wasserdiffusionskonstanten (ADC) nach den zuvor veröffentlichten Methoden 15,16,17 zu bewerten. Führen Sie MRT-Morphologie (T1 und T2), Diffusion und Perfusion durch, um die am stärksten betroffenen und am wenigsten durchbluteten Bereiche des Gehirns zu bestimmen.
    HINWEIS: Die Mittelwerte für Perfusion und Diffusion (ADC) in jeder Gruppe werden zwischen der ligierten Seite und der Kontrollseite (intakte Seite der Halsschlagader) verglichen.
  5. Führen Sie MRS nach bereits veröffentlichten Methoden 15,17 durch und analysieren Sie mit einem hauseigenen codierten Programm unter Verwendung der Mathematica-Software (siehe Materialtabelle).
  6. Skalieren Sie die MR-Spektren in Teilen pro Million (ppm), indem Sie sie gegen den Wasserpeak (4,78 ppm) kalibrieren. Identifizieren Sie die wichtigsten metabolischen Spitzen im Gehirn als N-Acetylaspartat (NAA) bei 2,02 ppm, Cholin (Cho) bei 3,22 ppm, Kreatin (Cr) bei 3,02 ppm und Myo-Inositol bei 3,53 ppm.
    HINWEIS: Die Messungen der Peakfläche der Metaboliten werden zur Berechnung der folgenden Verhältnisse verwendet: NAA zu Cho (NAA/Cho), Cr zu Cho (Cr/Cho) und Myo-Ins zu Cho (Myo-Ins/Cho)15.

6. Analyse von Serum und Hirngewebe

  1. Führen Sie eine Blutentnahme nach 5,5 h nach der Karotis-Ligatur oder dem Scheinverfahren nach zuvor veröffentlichten Methodendurch 18.
  2. Betäuben Sie die Welpen erneut mit 4% Isofluran.
  3. Machen Sie mit einer scharfen Klinge #11 einen Bauchschnitt, gefolgt von einem Zwerchfellschnitt, um das Herz freizulegen.
  4. Führen Sie eine Blutentnahme per Herzpunktion durch, wie zuvor beschrieben18. Führen Sie kurz eine 32-g-Nadel auf einer 1-ml-Spritze in die rechte Herzkammer ein und aspirieren Sie vorsichtig 1 ml Blut.
  5. Lassen Sie das Vollblut gerinnen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das Serum wird in saubere Mikrozentrifugenröhrchen getrennt.
  6. Enthaupten Sie den gesamten Kopf des Welpen für die grobe Beurteilung der zerebralen Pathologie und tauchen Sie ihn dann 2 Minuten lang in Eis.
  7. Machen Sie einen Schnitt an der dorsalen Kopfhaut von der Schädelbasis bis zur Nasenspitze und schälen Sie die Schädelknochen um das Gehirn herum. Nehmen Sie das intakte ganze Gehirn in eine saubere Petrischale.
  8. Markieren Sie die rechte Seite des Gehirns mit einem ungiftigen Marker. Positionieren Sie das Gehirn mit der Kopfoberfläche nach oben, so dass beide Hemisphären sichtbar sind. Schneiden Sie das Gehirn mit einer eiskalten Rasierklinge in vier gleich große Abschnitte parallel zur Koronalebene.
  9. Die Hirnschnitte werden in 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) in einer mit Folie abgedeckten Petrischale getaucht, um eine Photosensibilisierung zu verhindern, und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert.
    HINWEIS: Infarzbereiche werden als weiße Bereiche ohne roten TTC-Fleck abgegrenzt.
  10. Wenn Infarkte subtil oder schwer zu erkennen sind, injizieren Sie 0,5-1 ml TTC (1%) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung direkt in das rechte Herz nach dem Bauchschnitt und der Thorakotomie und lassen Sie es 2 Minuten vor der Enthauptung des Welpen perfundieren.
  11. Lagern Sie das Hirngewebe und das Serum bei -80 °C, falls eine weitere Analyse erforderlich ist.

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Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll zur Erzeugung und Bewertung früher zerebraler Veränderungen nach HIE war einfach zu implementieren und ermöglichte eine grobe pathologische und radiologische Visualisierung der Hirnverletzung innerhalb von 6 h nach dem Insult bei Rattenwelpen bei P10. Der Versuchsplan ist in Abbildung 1 dargestellt. Beide Geschlechter wurden zusammen analysiert, und in jeder Gruppe wurden 24 Tiere aus fünf Würfen untersucht. Die Tiersterblichkeit war sehr niedrig, mit 99 % Überleben...

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Diskussion

Es wurde erfolgreich ein Forschungsprotokoll an neugeborenen Rattenbabys entwickelt, um frühe Marker für Hirnverletzungen bei HIE zu visualisieren und zu analysieren. Bisher fehlt es an objektiven Bewertungsinstrumenten, um eine frühe Hirnschädigung bei Neugeborenen zu erkennen. Nach einer HI-Verletzung gibt es eine Phase (1-6 h), in der die Beeinträchtigung des zerebralen oxidativen Stoffwechsels das Potenzial hat, sich teilweise zu erholen, bevor die mitochondriale Funktion

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Offenlegungen

Es gibt keine Interessenkonflikte für einen der Autoren.

Danksagungen

Wir danken dem tierärztlichen Personal der Oklahoma Medical Research Foundation für seine Expertise und Unterstützung bei der Änderung der Tierpflegeprotokolle.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% normale KochsalzlösungFisher ScientificZ1376
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)Millipore SigmaT8877
Pneumatisches BauchkissenSA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere, 58,4 x 91,4 cm, 680 mLFisher Scientific501060566
BD 30 g Nadel und SpritzeFisher ScientificKatalog-Nr.14-826-10
Biospec 7,0 Tesla/30 cm Magnet-Bildgebungssystem für Kleintiere mit horizontaler BohrungBruker Biospin, Ettlingen, Deutschland
BuprenorphinZur Verfügung gestellt von veterinary medicine
Kompaktes Thermometer mit SondeFisherScientific S01549
Gasgemisch 92% Stickstoff 8% SauerstoffAirgas
Kopf OberflächenschlangeBruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Deutschland
IsoflurangasBereitgestellt von der Veterinärmedizin
Isotemp Tauchzirkulator 2100Fisher ScientificAbgekündigtIn Wasserbadkammer mit kontinuierlich fließendem Wasser über Schläuche eingetaucht
Bleiringkolben GewichteVWR29700-060Wasserbadgewichte, um sicherzustellen, dass die Nagetierkammer im Wasserbad untergetaucht bleibt
Mathematica SoftwareWolfram Research, Champaign, IL, USAVersion 6.0
Pedialyte Elektrolytlösung, Trinkgetränk, 1 Liter, geschmacksneutralerPedialyteGewonnen aus CVS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1X), Dulbeccos FormelMillipore SigmaJ67670.
Durchsichtiger EimerWir haben einen alten Nagetierkäfig verwendet - dies ist eine gute Alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Modell #:182615CW135
Plexiglas Nagetier-RückhaltekammerPedialyte / CVSVetinary Medicine stellte eine kleine Kammer zur Verfügung, die zur Zurückhaltung von Nagetieren verwendet wurde. Ungefähr 6x4x4 Zoll
Trächtige Sprague Dawley Ratten bei E14Charles RiverStamm Code 400
Purdue Produkte  Betadine SwabsticksFisher Scientific19-061617
Quadratur-Volumenspule (72 mm Innendurchmesser)Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Deutschland
Stoelting Silk FaturFisher ScientificKatalog-Nr.10-000-656
Vicryl 5-0 NahtFisher Scientific 
AP aus Kunststoff NC1985424

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