Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

Qiwei Fan; Xiaotan Zhang; Yuan Wang; Xiaoyu Wang

doi:10.3791/64187

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Methodenartikel

Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

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DOI:

10.3791/64187

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6. Juli 2022

Qiwei Fan^*¹ , Xiaotan Zhang^*² , Yuan Wang³ , Xiaoyu Wang¹

¹Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, ²Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, ³Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.

Zusammenfassung

Fragile X mental retardation protein (FMRP) ist ein mRNA-bindendes Protein, das die lokale Proteintranslation reguliert. FMRP-Verlust oder -Dysfunktion führt zu aberranten neuronalen und synaptischen Aktivitäten beim fragilen X-Syndrom (FXS), das durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und soziale Kommunikationsprobleme gekennzeichnet ist. Studien zur FMRP-Funktion und FXS-Pathogenese wurden hauptsächlich mit Fmr1-Knockout (das Gen, das FMRP kodiert) bei transgenen Tieren durchgeführt. Hier berichten wir über eine in vivo Methode zur Bestimmung der zellautonomen Funktion von FMRP während der Zeit des Schaltkreisaufbaus und der synaptischen Bildung mit Hühnerembryonen. Diese Methode verwendet die phasen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-kleine Haarnadel-RNA (shRNA) und einen EGFP-Reporter enthält. Mit dieser Methode erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown im auditorischen Ganglion (AG) und in einem seiner Hirnstammziele, dem Nucleus magnocellularis (NM), wodurch eine komponentenspezifische Manipulation innerhalb des AG-NM-Schaltkreises ermöglicht wurde. Darüber hinaus ermöglicht das Mosaikmuster der Transfektion Kontrollen innerhalb des Tieres und benachbarte Neuron/Faser-Vergleiche für eine erhöhte Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit bei der Datenanalyse. Das induzierbare Vektorsystem bietet eine zeitliche Kontrolle des Beginns der Genbearbeitung, um akkumulierende Entwicklungseffekte zu minimieren. Die Kombination dieser Strategien bietet ein innovatives Werkzeug, um die zellautonome Funktion von FMRP in der synaptischen und Schaltungsentwicklung zu analysieren.

Einleitung

Das Fragile-X-Syndrom (FXS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung, die durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und autistisches Verhalten gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen wird FXS durch einen globalen Verlust des fragilen X-Mentalretardierungsproteins (FMRP; kodiert durch das Fmr1-Gen) ab frühen embryonalen Stadien¹ verursacht. FMRP ist ein RNA-bindendes Protein, das normalerweise in den meisten Neuronen und Gliazellen im Gehirn sowie in Sinnesorganen^{exprimiert wird} ^2,3,4. In Säugetiergehirnen ist FMRP wahrscheinlich mi....