Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.
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Methodenartikel
Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Cytosinmethylierung ist bei Wirbeltierarten hoch konserviert und spielt als Schlüsselfaktor für epigenetische Programmierung und Chromatinzustand eine entscheidende Rolle in der frühen Embryonalentwicklung. Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin voran. Epigenetische Reprogrammierung ist eine kritische Phase während der utero-Entwicklung , und die mütterliche Exposition gegenüber Chemikalien hat das Potenzial, das Epigenom innerhalb der Nachkommen neu zu programmieren. Dies kann möglicherweise zu nachteiligen Ergebnissen wie unmittelbaren phänotypischen Folgen, langfristigen Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationalen Auswirkungen vererbter epigenetischer Markierungen führen. Obwohl die Bisulfit-basierte Sequenzierung es Forschern ermöglicht, die Cytosinmethylierung mit Basenpaarauflösung abzufragen, sind sequenzierungsbasierte Ansätze unerschwinglich und schließen daher die Fähigkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Aufgrund der Leichtigkeit der automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin als physiologisch intaktes Modell zur Aufdeckung von xenobiotisch vermittelten Signalwegen verwendet, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen embryonalen Entwicklung beitragen. Daher beschreiben wir unter Verwendung kommerziell verfügbarer 5-mC-spezifischer Antikörper eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie, automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse. Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die erfolgreich 5-mC-Spiegel in situ in Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung nachweist und quantifiziert. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.
Einleitung
Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin 1,2 voran. Tris(1,3-dichlor-2-propyl) phosphat (TDCIPP) ist ein in den Vereinigten Staaten weit verbreitetes Flammschutzmittel, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf der Cytosinmethylierung nach früher embryonaler Exposition von 0,75 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis zur frühen Gastrulation (6 hpf) verändert3,4,5,6,7,8
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Protokoll
Erwachsene Züchter wurden in Übereinstimmung mit einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierverwendungsprotokoll (#20180063) an der University of California, Riverside, behandelt und behandelt.
1. Embryonenentnahme durch Zebrafische und chemische Exposition
- Fügen Sie Becken mit geschlechtsreifen und reproduktiv lebensfähigen erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafischen Zuchtfallen hinzu. Fügen Sie mindestens drei Fallen pro 6-L-Tank mindestens 12 Stunden vor der Entnahme um ~9:00 Uhr hinzu, was der ungefähren Zeit der Befruchtung und des Laichens von Eiern in Tanks entspric....
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Ergebnisse
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Behandlung die relative Häufigkeit von 5-mC beeinflusst, indem die Gesamtfläche und relative Intensität der Fluoreszenz in fixierten und markierten Zebrafischembryonen bewertet wird. Nach Abschluss des Protokolls kann zunächst mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop festgestellt werden, ob der IHC für die gesamte Montage erfolgreich war. Wenn markierte Embryonen unter einem FITC- oder GFP-Filter beobachtet werden, wird ein positives Ergebnis durch ein .......
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Diskussion
Während dieses Protokolls gibt es einige Schritte, die kritisch sind. Erstens ist es bei der Dechorionierung von Embryonen wichtig, die Nadel vom Gewebe des Embryos / Dottersacks / der Zellmasse wegzuzeigen, da diese Teile des sich entwickelnden Embryos sehr zerbrechlich und leicht zu durchstechen sind. Zweitens, wenn Sie markierte Embryonen in einzelne Vertiefungen übertragen, verwenden Sie eine Glaspipette, um Embryonen zu übertragen, da sie an einer Kunststoffpipette haften. Drittens ist bei der Durchführung von IHC f.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Papier berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.
Danksagungen
Die Forschungsunterstützung wurde durch ein UCR Graduate Division Fellowship für SAB, ein NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) für SAB und ein National Institutes of Health Stipendium (R01ES027576) und USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) für DCV bereitgestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-& micro; L Mikrokapillarpipette aus Glas | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm-Petrischale aus Kunststoff | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-ml-Pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-ml-Erlenmeyerkolben | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-ml-Pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm-Petrischalen aus Glas mit Deckel | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-Well-Platte | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG Antikörper | Fisher Scientific | A21121 | |
| Rinderserumalbumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Heizplatte | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-Tank-Zuchtfallen | Aquatische Lebensräume | N/A | Dieses Produkt ist nach der Übernahme von Aquatic Habitats durch Pentair nicht mehr verfügbar. Die Untersucher können standardmäßige systemunabhängige Zuchttanks verwenden, die von mehreren Anbietern erhältlich sind. |
| ImageXpress Micro XLS Weitfeld-High-Content-Screening-System | Molecular Devices | N/A | Jedes High-Content-Screening-System, das mit Durchlicht und FITC-Filter ausgestattet ist, ist geeignet. |
| Korb für Immunchemie (IHC) | N/A | N/A | Hergestellt im eigenen Haus unter Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen, bei denen der konische Teil entfernt und der Boden mit einem Netz versehen ist, dimensioniert für 24- oder 48-Well-Platten. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molekulare Bauelemente | N/A | Jede Software, die in der Lage ist, die Gesamtfläche und die integrierte Intensität der Fluoreszenz zu quantifizieren, ist geeignet. |
| Mikrospatel | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoklonaler Maus-Anti-5-mC-Antikörper | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbitalschüttler | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher | Scientific 1337412 | |
| Paraformaldehyd | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Transferpipette aus Kunststoff | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio ist eine Open-Source-Software und kann unter https://www.rstudio.com heruntergeladen werden. |
| Serum für Schafe | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomikroskop | Leica | 10450103 | |
| Inkubator mit Temperatursteuerung | Fisher | Scientific PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
Referenzen
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
