In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.
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Methodenartikel
Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranabgeleitete, winzige Vesikel, die von allen Zellen mit einem Durchmesser von 50 bis mehreren hundert Nanometern produziert werden und als Mittel zur interzellulären Kommunikation verwendet werden. Sie entwickeln sich zu vielversprechenden diagnostischen und therapeutischen Instrumenten für eine Vielzahl von Krankheiten. Es gibt zwei Hauptbiogeneseprozesse, die von Zellen verwendet werden, um EVs mit Unterschieden in Größe, Zusammensetzung und Inhalt herzustellen. Aufgrund ihrer hohen Komplexität in Größe, Zusammensetzung und Zellherkunft erfordert ihre Charakterisierung eine Kombination von Analysetechniken. Dieses Projekt beinhaltet die Entwicklung einer neuen Generation von multiparametrischen Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von Subpopulationen von Elektrofahrzeugen. Um dieses Ziel zu erreichen, geht die Arbeit von der von der Gruppe etablierten nanobioanalytischen Plattform (NBA) aus, die eine originelle Untersuchung von EVs auf der Grundlage einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) von vesikulären Targets ermöglicht, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind. Ziel war es, diese EV-Untersuchung mit einer phänotypischen und molekularen Analyse mittels Raman-Spektroskopie abzuschließen. Diese Entwicklungen ermöglichen den Vorschlag einer multimodalen und einfach zu bedienenden analytischen Lösung für die Unterscheidung von EV-Untergruppen in biologischen Flüssigkeiten mit klinischem Potenzial
Einleitung
Das wachsende Interesse an der EV-Forschung in der Diagnose und in der Therapie 1,2,3,4,5, kombiniert mit den Herausforderungen, mit denen dieses Feld konfrontiert ist, hat zur Entwicklung und Implementierung einer Vielzahl von Ansätzen und Techniken zur Quantifizierung oder Charakterisierung dieser Vesikel geführt. Die am weitesten verbreiteten Methoden zur Identifizierung von EVs sind proteinspezifisches Immunblotting und Proteomik, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, Transmissionselektronenmikroskopi....
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Protokoll
1. Vorbereitung des Goldsubstrats
HINWEIS: Drei Arten von Oberflächen werden auf Goldchips hergestellt: 1) nackte Oberfläche, 2) chemisch funktionalisiert und 3) biofunktionalisiert (Liganden, die auf die C11C16-Schicht gepfropft sind). Sie werden ab diesem Zeitpunkt als "nackt", "C11C16" bzw. "Liganden" bezeichnet.
- Vorbereitung des Goldsubstrats:
HINWEIS: Für dieses Protokoll wurden die Gold-Biochips im eigenen Haus im Reinraum hergestellt. Die selbstgebauten Biochips bestanden aus Objektträgern (SF11) mit einer Beschichtung aus Chrom (2 nm Cr) und Gold (48 nm....
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Ergebnisse
Bestimmung der optimalen pH-Bedingungen für die Ligandentransplantation
Die verschiedenen Liganden, die zur Herstellung der Biochips verwendet werden, werden in Abhängigkeit vom pH-Wert und ihrer Verfügbarkeit für die Interaktion mit der chemischen Thiolatschicht getestet (Abbildung 3). Die Liganden werden in Acetatpuffer bei unterschiedlichen pH-Werten verdünnt und auf den mit einer C11C16-Schicht chemisch funktionalisierten Biochip injiziert. Die Lösungen werden nach de.......
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Diskussion
Die neueren Methoden zur Identifizierung von EVs, die am weitesten verbreitet sind, sind proteinspezifisches Immunblotting, um die Herkunft von EVs zu bestätigen, TEM, um ihre Struktur zu bestätigen, und NTA, um ihre Anzahl und Größenverteilung in einem Probenvolumen3 zu quantifizieren. Nichtsdestotrotz haben das große Interesse an Elektrofahrzeugen in der (bio-)medizinischen Forschung und die Einschränkungen bestehender Analysewerkzeuge die wissenschaftliche Gemeinschaft dazu veranlasst, neue Met.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Kelly Aubertin und Fabien Picot von der IVETh Core Facility (Paris) werden für die Raman-Bildgebungsexperimente ausgezeichnet. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) und Zuzana Krupova (aus Helincourt, Frankreich) werden für die Bereitstellung der EV-Proben aus Blutplättchen- bzw. Rindermilchproben ausgezeichnet. Die Arbeit wurde von der Region Bourgogne Franche-Comté und der Graduiertenschule EUR EIPHI (NOVICE-Projekt, 2021-2024) unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde mit der CLIPP-Plattform und in RENATECH-Reinraumanlagen in FEMTO-ENGINEERING durchgeführt, wofür wir Rabah Zeggari danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CD41a Antikörper | Diaclone SAS (Frankreich) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Deutschland | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamin | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs aus Thrombozytenkonzentraten | Mitarbeit : Pr T. Burnouf (TMU, Taipeh) | S2889 | |
| Evs aus Rindermilch | Mitarbeit : Dr. Z. Krupova (Excilone, Helincourt - Frankreich) | 3450 | |
| Glutaraldehyd | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron-Sputtern | PLASSYS | SAB5300165 | |
| Mercapto-1-hexadecansäure | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP one | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octylglucosid (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumin Antikörper | Sigma | ||
| Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) | Sigma | ||
| Rattenalbumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Natriumacetat Puffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva Life Sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO Technologieplattform | Die Biochips wurden im Reinraum Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
Referenzen
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
