Intravitalmikroskopie zur Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der Leber der Maus

Zusammenfassung

Die Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das Einblicke in die zeitlichen und räumlichen Beziehungen von schnellen und/oder sequenziellen Prozessen bietet. Darin beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung sowohl von Protein-Protein-Wechselwirkungen als auch von Thrombozyten-Neutrophilen-Endothel-Wechselwirkungen in Lebersinusoiden in einem Mausmodell der experimentellen Sepsis (Endotoxämie).

Zusammenfassung

Entzündungen und Thrombosen sind komplexe Prozesse, die sich vor allem in der Mikrozirkulation abspielen. Obwohl die Standardhistologie einen Einblick in den Endweg sowohl bei Entzündungen als auch bei Thrombosen geben kann, ist sie nicht in der Lage, die zeitlichen Veränderungen zu zeigen, die im Laufe des Zeitverlaufs dieser Prozesse auftreten. Unter der Intravitalmikroskopie (IVM) versteht man die Verwendung von Bildgebung an lebenden Tieren, um zeitliche Einblicke in physiologische Prozesse in vivo zu gewinnen. Diese Methode ist besonders leistungsfähig bei der Beurteilung von zellulären und Proteininteraktionen innerhalb des Blutkreislaufs, da die schnellen und sequenziellen Ereignisse oft notwendig sind, damit diese Wechselwirkungen auftreten können. Obwohl die IVM eine extrem leistungsfähige bildgebende Methode ist, die in der Lage ist, komplexe Prozesse in vivo zu betrachten, gibt es eine Reihe von methodischen Faktoren, die bei der Planung einer IVM-Studie zu berücksichtigen sind. In diesem Artikel wird der Prozess der intravitalen Bildgebung der Leber beschrieben, wobei wichtige Überlegungen und potenzielle Fallstricke identifiziert werden, die auftreten können. Daher beschreibt diese Arbeit die Verwendung von IVM zur Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in Lebersinusoiden, um die relativen Beiträge jeder einzelnen in verschiedenen Modellen akuter Leberschädigung zu untersuchen.

Einleitung

Entzündungen und Thrombosen sind komplexe Prozesse, die sich vor allem in der Mikrozirkulation abspielen. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Vorbereitung, die eine Bildgebung der Lebermikrovaskulatur in vivo ermöglicht. Obwohl die Standardhistologie einen Einblick in die Endwege von Entzündungen und Thrombosen geben kann, kann sie nicht die zeitlichen Veränderungen zeigen, die während des Prozesses auftreten. Darüber hinaus ist diese Methode besonders leistungsfähig bei der Beurteilung der vorübergehenden Zell- und Proteininteraktionen, die innerhalb des mikrovaskulären Kreislaufs auftreten, da sie in der Lage ist, die oft schnellen und sequenziellen Wechselwirkungen, die innerhalb biologischer Systeme stattfinden, mittels Videomikroskopie zu erfassen. In dieser Arbeit wird die Verwendung der Intravitalmikroskopie zur Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in Lebersinusoiden beschrieben, um den relativen Beitrag der einzelnen in verschiedenen Modellen der akuten Leberschädigung zu untersuchen.

Während diese chirurgische Vorbereitung und Bildgebungsmodalität das Potenzial haben, an eine Vielzahl von Entzündungs- und pathologischen Modellen angepasst zu werden, werden hier zwei Modelle der vaskulären Entzündung skizziert: ein Endotoxämie-Modell der murinen Sepsis und eine Paracetamol (APAP)-induzierte Leberschädigung. Die Injektion von Endotoxin (Lipopolysaccharid; LPS) zur Induktion eines experimentellen Modells der murinen Sepsis begann bereits in den 1930er Jahren mit seiner Isolierung und anschließenden Erforschung als Schlüsselmolekül bei der Progression der Sepsis¹. Obwohl dieses Modell insofern eingeschränkt ist, als LPS nur eine einzige Komponente von gramnegativen Bakterien ist, handelt es sich um eine weithin akzeptierte und genutzte Methode, die relativ einfach und schnell durchzuführen ist. Darüber hinaus repliziert es schnell und genau die physiologischen Manifestationen der Sepsis¹. Angesichts der Rolle, die die intestinale Endotoxinabsorption bei der Entwicklung von Lebererkrankungen und Entzündungen^{spielt 2}, ist dies ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der Leber der Maus.

Neben einem LPS-Modell der Sepsis bietet die APAP-Überdosierung ein hervorragendes Modell für die Untersuchung pathologischer Zell-Zell-Interaktionen in der Leber. Eine Überdosierung von APAP kann zu akutem Leberversagen führen, das durch Thrombozytopenie und Thrombozytenakkumulation in der Leber gekennzeichnet ist und anschließend die Leukozyten-vermittelte Lebererholung blockiert³. Während die chirurgische Vorbereitung und Bildgebungsmethode für dieses Modell für eine Reihe von biologischen Fragestellungen und zur Untersuchung verschiedener pathologischer Prozesse angepasst werden kann, sind sowohl das LPS-Modell der Sepsis als auch die APAP-induzierte Leberschädigung hervorragende Modelle für die Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in vivo.

Die IVM hat einige inhärente Vorteile gegenüber histologischen Standardtechniken. Während histologische Standardmethoden die Untersuchung ganzer oder geschnittener Gewebeproben und die Wertschätzung von Proteinen und Gewebearchitektur ermöglichen, sind diese Methoden mit Einschränkungen verbunden. Diese Prozesse erfordern konstruktionsbedingt eine Gewebeverarbeitung, die das Potenzial hat, das, was sich im lebenden System befindet, zu verzerren oder zu maskieren. Das Gewebe muss während der histologischen Präparation fixiert werden, was das Potenzial für Fixationsartefakte oder eine verstärkte Autofluoreszenz birgt. Die Fixierung kann auch zu intrazellulären Veränderungen im Gewebe führen, und die Möglichkeit einer unsachgemäßen Fixierung kann zu einer Gewebedegradation führen. Darüber hinaus fehlt es histologischen Methoden an Potenzial, die zeitlichen Aspekte von Protein- oder zellulären Wechselwirkungen direkt zu untersuchen, und es besteht das Potenzial, ephemere oder seltene Wechselwirkungen zu übersehen.

Umgekehrt ermöglicht die Intravital-Fluoreszenzmikroskopie, viele der Komplikationen und Einschränkungen zu vermeiden, die der Standardhistologie innewohnen. Die IVM vermeidet die Fixierung und damit den Artefakt- oder Gewebeabbau, der bei der histologischen Präparation auftreten kann. Von Natur aus ermöglicht es auch die Bildgebung von Geweben innerhalb des lebenden biologischen Systems, so dass eine Gewebeisolierung und -sektion nicht erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht es die Bildgebung und Untersuchung von transienten oder seltenen Prozessen, die mit der Histologie nur schwer oder gar nicht erfasst werden können. Diese IVM-Methode kann auch verwendet werden, um sequenzielle Prozesse zu erfassen und zu identifizieren (z. B. durch Blutplättchen oder Leukozyten initiierte Wechselwirkungen, die zu Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten führen, die an das vaskuläre Endothel gebunden sind). Schließlich kann diese Methode an eine Vielzahl von bildgebenden Systemen angepasst werden. Abhängig von den Anforderungen der Studie und dem gewünschten Datensatz kann die externalisierte Leber nach der chirurgischen Vorbereitung auf nahezu jedes gewünschte Bildgebungssystem gelegt werden. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich auf die Bildgebung mit Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Spinning-Disk-Mikroskopie, konfokaler Laserscanning-Mikroskopie mit einem Resonanzkopfscanner sowie Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet. Es gibt jedoch keinen Grund zu der Annahme, dass diese Methode auf die oben genannten Mikroskopiesysteme beschränkt werden sollte.

Diese Methodenarbeit skizziert ein Protokoll für IVM, das zuvor zur Untersuchung von Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der Mausleber verwendet wurde. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die temporale Thrombozyten-Endothel-Adhäsion von Thrombozyten zu vergleichen, die entweder mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern markiert oder genetisch für endogene Fluoreszenz modifiziert wurden⁴. Dieses Protokoll wurde verwendet, um transiente Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in den Lebersinusoiden in einem endotoxämischen Modell der Leberentzündung zu bewerten und P-Selektin und rekombinantes Protein zu co-lokalisieren. Darüber hinaus ermöglichte dieses Protokoll die Bestimmung, ob die Unterschiede in der Neutrophilendichte, die in der Standardhistologie beobachtet wurden, auf Unterschiede in den Geschwindigkeiten der roten Blutkörperchen (als Surrogat für die volumetrische Flussrate) zurückzuführen ^waren5. Schließlich wurde diese Methode verwendet, um die Thrombozytenrekrutierung durch Kupffer-Zellen in den Lebersinusoiden in einem akuten Modell der APAP-induzierten Leberschädigung zu bewerten⁶. Diese Arbeit wäre mit den üblichen histologischen Methoden nicht möglich gewesen. Wie bereits erwähnt, kann dieses Protokoll für eine Vielzahl von Bildgebungssystemen angepasst werden, und mit der richtigen chirurgischen Vorbereitung, der Auswahl der Fluoreszenzantikörper und den Bildgebungseinstellungen ist dieses Protokoll äußerst zuverlässig und reproduzierbar für die Untersuchung der Leberpathologie.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Baylor College of Medicine und dem Research & Development Committee des Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center genehmigt. Alle Experimente sind endgültig, wobei die Euthanasie am Ende unter einer chirurgischen Anästhesieebene durchgeführt wird. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung von Antikörpern und Farbstoffen

1. Auswahl von Antikörpern und Farbstoffen
   HINWEIS: Die Anzahl der gleichzeitig beobachteten Farben hängt von der jeweiligen Mikroskopkonfiguration ab. In dem hier verwendeten System können vier verschiedene Wellenlängen gleichzeitig visualisiert werden.
   1. Visualisierung von Schiffen:
      1. Basierend auf dem Versuchsdesign wird das Gefäßsystem entweder mit einem endothelspezifischen (z. B. CD31) Antikörper und/oder einem Molekül, das gleichmäßig im Plasma verteilt ist (z. B. Dextran oder Albumin), markiert.
         HINWEIS: In diesem Artikel wird die Verwendung von Texas Red-markiertem Dextran (150 kDa; 250 μg/Maus) beschrieben. Der Vorteil dieses Proteins mit hohem Molekulargewicht liegt in seiner Fähigkeit, bei akuten Entzündungen im Gefäßsystem zu bleiben. Bei der Verwendung von Antikörpermarkierungen ist Vorsicht geboten, um Antikörper zu vermeiden, die das Potenzial haben, die Endothelfunktion zu beeinträchtigen.
   2. Visualisierung von Blutplättchen:
      1. Zur Identifizierung von Blutplättchen verwenden Sie entweder genetisch veränderte Mäuse (z. B. R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre) oder plättchenspezifische (z. B. Anti-GPIbβ) Antikörper für die IVM. Ausführliche Informationen zur Verwendung der Fluoreszenzmarkierung von Blutplättchen finden Sie in einer früheren Veröffentlichung⁴.
         HINWEIS: Hier werden DyLight488-markierte Anti-GPIbβ-Antikörper (X488; 6 μg/Maus) verwendet. Bei der Verwendung von Antikörpermarkierungen ist Vorsicht geboten, um eine Beeinträchtigung der Thrombozytenfunktion oder -adhäsion zu vermeiden.
   3. Visualisierung von Leukozyten:
      1. Ähnlich wie bei der Bildgebung von Blutplättchen visualisieren Sie die interessierenden Leukozyten entweder mit genetisch veränderten Mäusen (z. B. LysM-EGFP für Granulozyten) oder mit leukozytenspezifischen Antikörpern (z. B. Ly6G für murine Neutrophile). Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie mit Brillantviolett 421 (BV421) markierte Anti-Ly6G-Antikörper (3 μg/Maus). In akuten (<6 h) Versuchen sind Neutrophile mit 3 μg anti-Ly6G (Klon 1A8) pro Tier zu markieren.
         HINWEIS: Bei der Verwendung von Anti-Ly6G-Antikörpern (Klon 1A8) ist zu beachten, dass dieser Antikörper zur Depletion von Neutrophilen (0,05-1 mg Antikörper/Maus)^7-9 nach mindestens 24 h und/oder durch wiederholte Injektionen verwendet wurde. Es wurde auch berichtet, dass Anti-Ly6G (1A8)-Antikörper die Adhäsion und Transmigration von Neutrophilen bei hoher (aber nicht niedriger) Scherspannung in bestimmten, aber nicht allen Situationen beeinflussen ^9,10. Daher sollte die Antikörperdosierung im Einzelfall sorgfältig gewählt werden.
   4. Zusätzliche Proteine:
      1. Abhängig von der Anzahl der Laser und Filtersätze/Detektoren, die in einem bestimmten Bildgebungssystem verfügbar sind, fügen Sie mehr Wellenlängen hinzu, um mehr Objekte gleichzeitig zu identifizieren, und achten Sie darauf, spektrale Überlappungen zu vermeiden.
         HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Bildgebung eines 4. Objekts, P-Selektin (Klon Psel.KO2.3), unter Verwendung eines PerCP-eFluor 710-markierten Anti-P-Selektin-Antikörpers (4 μg/Maus). Obwohl die meisten Beschreibungen und Bilder in dieser Arbeit für LPS-induzierte akute Leberschäden gelten, könnten andere Verletzungsmodelle von Interesse sein und alternative Bezeichnungen erfordern. In der Diskussion finden Sie eine Beschreibung der Antikörper, die bei APAP-induzierter Schädigung verwendet werden⁶.
2. Entfernung von Konservierungsstoffen und Sterilisation
   HINWEIS: Obwohl es im Handel erhältliche Antikörper und Farbstoffe gibt, die für die Injektion in Tiere bereit sind, enthalten die meisten von ihnen Träger oder Konservierungsstoffe (z. B. Natriumazid), die für Tiere schädlich sein können oder Störvariablen hinzufügen. Antikörper und Farbstoffe, die Träger oder Konservierungsstoffe enthalten, sollten gegen Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium oder Magnesium (DPBS^-/-; oder andere physiologische Puffer) dialysiert werden.
   1. 500 mL DPBS^-/- (~1.000-faches Volumen des zu dialysierenden Antikörpers/Farbstoffs) in ein Becherglas mit magnetischem Rührstab geben. Befestigen Sie eine 7.000 MWCO-Kassette an einer Schwimmboje und legen Sie sie für mindestens 5 Minuten in den Dialysepuffer, um die Membran vorzukonditionieren. Entfernen Sie die Kassette und tupfen Sie die Kunststoffkanten mit fusselfreiem Tuch trocken. Vermeiden Sie es, die Dialysemembran zu berühren.
   2. Injizieren Sie den Antikörper/Farbstoff mit einer 18-20 G-Nadel durch einen der vier Anschlüsse in die Kassette. Legen Sie die Kassette mit dem Antikörper/Farbstoff in den Dialysepuffer. Das Becherglas auf einen Magnetrührer stellen und mindestens 1 h bei 4 °C dialysieren. Wechseln Sie den Dialysepuffer.
   3. Wiederholen Sie die Dialyse und den Wechsel des Dialysepuffers in Schritt 1.2.2 mindestens zwei weitere Male (mindestens drei Wechsel).
   4. Entfernen Sie die Kassette und tupfen Sie die Kunststoffkanten mit fusselfreiem Tuch trocken. Vermeiden Sie es, die Dialysemembran zu berühren. Aspirieren Sie den Antikörper/Farbstoff aus der Kassette mit einer 18-20 G-Nadel durch einen unbenutzten Anschluss.
   5. In einer Gewebekulturhaube werden die Präparate vor der Verwendung bei Tieren mit einem 0,2-μm-Filter sterilisiert. Nicht verwendete Portionen in sterilen Röhrchen bei 4 °C lagern.
3. Steuerung
   1. Obwohl die genauen Kontrollen, die für jedes Experiment erforderlich sind, je nach Studiendesign variieren, stellen Sie sicher, dass Sie geeignete Scheinkohorten, mit Vehikeln behandelte und nicht mit Vehikeln behandelte Gruppen sowie Isotypkontrollen einbeziehen, um unspezifische Markierungen und biologische Effekte bei der Analyse der Studienergebnisse auszuschließen.

2. Intraperitoneale Endotoxin-Injektion

HINWEIS: Zur Bewertung der Thrombozyten-Neutrophilen-Endothel-Wechselwirkungen in den Lebersinusoiden in einem experimentellen Modell der murinen Sepsis kann die Endotoxin-Injektion verwendet werden.

1. Wiegen Sie die Mäuse, um die Menge an Endotoxin zu bestimmen, die injiziert werden soll (5 mg/kg; Escherichia coli Serotyp O111:B4; Endotoxingehalt 1 x 10⁶ EU/mg).
   HINWEIS: Die Wirksamkeit und Wirkung von Endotoxinen ist abhängig von der Spezies und dem Stamm und kann von Charge zu Charge variieren¹¹. Um die Konsistenz der Ergebnisse zu maximieren, sollten daher Versuche mit der gleichen Menge Endotoxin¹² durchgeführt werden.
2. Endotoxin verdünnt mit normaler Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid) in eine Spritze aufziehen, an der eine 27-G-Nadel befestigt ist. Halten Sie die Maus in der nicht dominanten Hand mit Daumen und Zeigefinger am Genick. Mit der anderen Hand legst du Zug auf den Schwanz, um den Bauch freizulegen, und platzierst den Schwanz zwischen der fünften Ziffer und der Handfläche der nicht dominanten Hand.
3. Reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Führen Sie die Nadel in den unteren linken (oder rechten) Bauch ein und injizieren Sie das Endotoxin.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass die Nadel nicht zu tief eingeführt wird, da die Gefahr von Organverletzungen besteht, die die Experimente verwirren können (z. B. Verletzungen des Darms, des Darms, der Nieren usw.).
4. Die Schritte 2.1-2.3 bei Kontrolltieren mit normaler Kochsalzlösung (oder Vehikel) durchführen.
   HINWEIS: Eine APAP-induzierte Leberschädigung kann mit einer ähnlichen Methodik wie oben erreicht werden, wobei APAP anstelle von Endotoxin⁶ verwendet wird. Weitere Informationen zum APAP-induzierten Leberverletzungsmodell finden Sie in der Diskussion.

3. Einleitung und Aufrechterhaltung der Narkose der Tiere und Euthanasie

1. Legen Sie die Tiere unter eine chirurgische Anästhesieebene. Halten Sie die Anästhesie mit inhalativem Isofluran über einen Nasenkonus oder eine Trachealkanüle aufrecht. Beurteilen und passen Sie den Grad der Anästhesie an, indem Sie die Bewegung nach einem Zehenklemmen überwachen.
2. Am Ende aller Experimente wird die Euthanasie durch Exsanguination unter einer chirurgischen Anästhesieebene durchgeführt, gefolgt von bilateralen Pneumothoraces.

4. Katheterisierung der Halsvene und der Luftröhre

1. Führen Sie eine Tracheotomie durch, um die Atmung zu erleichtern und Gefäßkatheter für die Injektion von markierten Antikörpern/Farbstoffen zu legen.
   HINWEIS: Ein chirurgisches Dissektionsmikroskop oder Lupen sind bei der Katheterisierung hilfreich.
2. Rasieren Sie das Fell von Hals und Bauch; Überschüssiges Haar entfernen. Legen Sie das Tier auf ein Wärmekissen, um die Körpertemperatur auf 37 °C zu halten, und verwenden Sie eine rektale Sonde, um die Kerntemperatur zu überwachen. Schrubben Sie den Hals mit Betadin, gefolgt von 70% Ethanol.
3. Machen Sie einen vertikalen Mittellinienschnitt im Hals und legen Sie die Luftröhre durch stumpfe Dissektion frei.
   1. Tracheostomy
      1. Bereiten Sie eine Trachealkanüle PE90 mit einer 21 G stumpfen Nadel vor (Abbildung 1A).
         HINWEIS: Das Hinzufügen einer ~45°-Abschrägung am Ende der Trachealkanüle kann das Einführen in die Luftröhre erleichtern. Alternativ kann auch ein peripherer intravenöser Katheter von 18-20 G anstelle eines PE90-Schlauchs verwendet werden.
      2. Sobald die Haut und die Faszie eingeschnitten sind, reflektieren Sie die Speicheldrüsen von der Mitte weg.
      3. Trennen Sie den Sternothyreose-Muskel durch stumpfe Dissektion, um einen besseren Zugang zur Luftröhre zu erhalten.
         HINWEIS: Achten Sie darauf, die versorgenden Gefäße und die Halsschlagadern, die an die Luftröhre angrenzen, zu vermeiden.
      4. Machen Sie einen kleinen (~1-2 mm) horizontalen Schnitt zwischen den Trachealringen auf der ventralen/vorderen Seite der Luftröhre (Abbildung 1B).
         HINWEIS: Die Verwendung einer Vannas-Schere erleichtert das korrekte Sezieren. Stellen Sie sicher, dass nur die vordere Fläche der Luftröhre eingeschnitten ist. Eine vollständige Durchtrennung der Luftröhre erschwert die Kanülierung der Luftröhre und birgt die Gefahr, dass nahe gelegene Gefäßstrukturen beschädigt werden.
      5. Führen Sie eine Trachealkanüle in das Loch ein. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Tube nicht über die Carina hinaus eingeführt wird.
      6. Befestigen Sie die Trachealkanüle in der Luftröhre, indem Sie eine #4-0 Seidennaht um die Luftröhre und den Schlauch binden und dabei die Trachealringe als Stütze verwenden (Abbildung 1C).
   2. Externe Gliederkanüle
      1. Bereiten Sie einen Jugularkatheter (Abbildung 2) mit einem PE50-Schlauch (AD 0,97 mm, ID 0,58 mm) vor, wobei ein PE10-Schlauch (AD 0,61 mm, ID 0,28 mm) in ein Ende eingeführt wird (Abbildung 2 Einschub) und eine 22 G oder 23 G stumpfe Nadel in das andere Ende eingeführt wird. Verwenden Sie Klebstoff, um sicherzustellen, dass der Schlauch nicht verrutscht oder ausläuft. Setzen Sie eine Spritze auf, die mit steriler normaler Kochsalzlösung gefüllt ist, um den Katheter zu spülen.
      2. Legen Sie die Vena jugularis externa (EJV) nach der Speicheldrüsenreflexion frei. Befreien Sie das EJV durch stumpfe Dissektion vom umgebenden Bindegewebe (Abbildung 3A).
      3. Ligatieren Sie mit Seidennähten #4-0 das kraniale Ende des visualisierten EJV und legen Sie eine lose Schlaufe um das kaudale Ende des EJV (Abbildung 3B). Klemmen Sie die Enden jeder Naht zusammen mit den Hämostaten und ziehen Sie die beiden Hämostaten vorsichtig voneinander weg, um die EJV freizulegen.
         HINWEIS: Der optimale Bereich für die Kanülierung befindet sich zwischen den Ästen der Vena jugularis anterior kranial und der Vena jugularis interna kaudal. Um das Platzieren der Naht zu erleichtern, falten Sie ein Stück (~15 cm) Naht in zwei Hälften und führen Sie das gebogene Ende mit einer Pinzette unter die EJV, während Sie die EJV mit einer separaten Pinzette anheben, um ein Rollen des Gefäßes zu verhindern. Schneide dann die Naht so ab, dass zwei separate Längen entstehen.
      4. Machen Sie mit einer Vannas-Schere einen kleinen (~1 mm) Schnitt in der vorderen Oberfläche des EJV. Führen Sie eine gebogene 30 G stumpfe Nadel (ergänzt mit einem 0,15 mm kleinen Stift, der stumpf gefeilt und in die Nadelspitze eingeführt wird) durch den Schnitt in den EJV ein und heben Sie ihn vorsichtig an, um den Durchgang des Katheters mit normaler Kochsalzlösung in den EJV zu erleichtern.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Katheter und die Nabe keine Luftblasen aufweisen, bevor Sie sie einführen und in die Maus spülen. Ein Luftembolus kann für das Tier tödlich sein.
      5. Sobald sich der Katheter innerhalb des EJV befindet, lockern Sie die kaudale Schlinge gerade so weit, dass der Katheter tiefer in die Vene eindringen kann. Überprüfen Sie, ob der Katheter platziert ist, indem Sie Blut absaugen und den Katheter spülen, um ihn auf Undichtigkeiten zu prüfen (Abbildung 3C).
      6. Befestigen Sie den Katheter mit der Schwanzschlaufe im EJV. Befestigen Sie den Katheter mit der Schädelnaht am kranialen Ende des EJV, um eine versehentliche Dekanülierung zu minimieren (Abbildung 3D).
      7. Verschließen Sie den Schnitt an der Halshaut mit #4-0 Seidennaht.

5. Exteriorisation der Leber

1. Reinigen Sie den Bauch mit einem Betadin-Peeling, gefolgt von 70% Ethanol.
2. Machen Sie einen ~1 cm langen vertikalen Schnitt in der Haut des Oberbauchs, beginnend an der Basis des Brustbeins. Trennen Sie mit einer stumpfen Dissektion die Haut von den Bauchmuskeln. Verätzen Sie die großen Ernährungsgefäße der Haut und der Muskeln, um Blutungen während der folgenden Schritte zu minimieren (Abbildung 4A).
3. Machen Sie einen ~1-2 cm langen horizontalen Schnitt der Haut, gefolgt vom Bauchmuskel, und halbieren Sie den vertikalen Schnitt in Schritt 5.2 etwa am oberen Rand der sichtbaren Leber; Verwenden Sie ein Kauterwerkzeug, um die Blutstillung der Haut zu unterstützen (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Die Größe des Bauchschnitts ist entscheidend für eine optimale Bildgebung der Leber. Ist die Öffnung zu klein, besteht die Gefahr einer Leberischämie durch Überdehnung oder Impingement der Leberarterie und/oder der Pfortader. Wenn die Öffnung zu groß ist, können auch andere Organe, wie z. B. der Darm, nach außen getragen werden und die Bildgebung beeinträchtigen.
4. Schneiden Sie in der Mitte eines 2 Zoll x 2 Zoll großen Kreises einen ca. 1 cm großen Kreis ein und befeuchten Sie ihn mit warmer normaler Kochsalzlösung. Positionieren Sie die Gaze so, dass die Öffnung mittig über dem Schnitt liegt. Ziehen Sie die Ränder des Schnitts vorsichtig auseinander und üben Sie leichten Druck nach oben auf den Bauch aus, um die Leber so nach außen zu verformen, dass die Leber leicht auf der angefeuchteten Gaze aufliegt (Abbildung 4C).
5. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf dem Bildgebungstablett, wobei die Leber mittig über dem Deckglas liegt (Abbildung 4D).
   HINWEIS: Bei einem Kontrolltier sollte die Leber kastanienbraun erscheinen. Bei diesem Protokoll wird für die IVM ein inverses, konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Zwei-Wege-Resonanzkopfscanner verwendet. Daher wurde ein 3D-Drucker verwendet, um ein benutzerdefiniertes IVM-Tablett zu erstellen (Abbildung 5). Die für den 3D-Druck erstellten .stl-Dateien werden zur Verfügung gestellt (Ergänzende Datei 1); Anpassungen können erforderlich sein, um den individuellen Bedürfnissen gerecht zu werden.
6. Übertragen Sie das Tier in das inverse Mikroskop.

6. Intravitalmikroskopische Bildgebung der Leber

HINWEIS: Bei diesem Protokoll wird ein konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einem Zwei-Wege-Resonanzkopfscanner für die Intravitalmikroskopie verwendet. Um die Resonanzkopffrequenz zu stabilisieren, schalten Sie das System vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang ein. Unterschiedliche Systeme können unterschiedliche Funktionen haben. Eine Diskussion darüber würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Wenden Sie sich an die Gerätevertreter, um die technischen Details der einzelnen Systeme zu erfahren.

1. Um eine chirurgische Anästhesieebene aufrechtzuerhalten, schließen Sie das Tier an das Isofluran-Verabreichungssystem an.
   HINWEIS: Je nach Versuchsprotokoll kann eine mechanische Beatmung erforderlich sein (im Gegensatz zur Spontanbeatmung).
2. Legen Sie ein Wärmekissen über das Tier und halten Sie mit der Rektalsonde eine Kerntemperatur von 37 °C aufrecht.
   HINWEIS: In diesem Protokoll dient ein rechteckiges Stück Schaumstoff, das um die IVM-Schale passt, als Isolator und Abstandshalter, auf dem das Wärmekissen platziert wird (Abbildung 4D).
3. Stellen Sie den Objektivrevolver auf die gewünschte Vergrößerung ein und tragen Sie bei Bedarf Immersionsöl auf. Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie das 60x/NA1.30 Silikonölobjektiv mit 1fach optischem Zoom.
4. Sobald die Fokusebene identifiziert ist, identifizieren Sie ≥10 zufällige Sichtfelder und vermeiden Sie die Bereiche in der Nähe der Leberränder.
   HINWEIS: Da die Leber eine Autofluoreszenz im Fluorescein-Isothiocyanat-Kanal (FITC) aufweist, verwenden Sie Epifluoreszenz, um die allgemeine Brennebene schnell zu identifizieren.
   1. Je nach System werden die Ränder der sichtbaren Leber mittels Epifluoreszenz im FITC-Kanal identifiziert und die (x,y)-Tischkoordinaten aufgezeichnet.
   2. Verwenden Sie die (x,y) Grenzen der Leber und einen Zufallszahlengenerator, um zufällige (x,y) Koordinaten zu identifizieren. Um ein akzeptables Sichtfeld zu erreichen, achten Sie bitte auf a) das Vorhandensein von Schiffen, die über das gesamte Sichtfeld verstreut sind; b) ≥80 % der Gefäße in derselben Brennebene; und (c) ≥1 Sichtfeld von Leberrändern entfernt (Beispiel in Abbildung 6). Wenn der Schwerpunkt der Bildanalyse auf Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in den hepatischen Sinusoiden liegt, schließen Sie Felder mit Gefäßdurchmessern von ≥15 μm aus (murine Sinusoide haben typischerweise einen Durchmesser von ≤10 μm).

7. Bildanalyse

HINWEIS: ImageJ/FIJI wurde verwendet, um alle Bilder in diesem Artikel zu verarbeiten. FIJI (fiji.sc) ist eine Open-Source-Version von Image J (imagej.nih.gov), die durch die Verwendung zusätzlicher Plugins und Makros¹³ mehr Funktionalität bietet.

1. Öffnen Sie die Mehrkanal-Zeitrafferdateien in ImageJ/FIJI.
   HINWEIS: Je nach Plattform können zusätzliche Programme/Plugins erforderlich sein. ImageJ/FIJI verfügt über einen Bioformat-Importer, der mehrere verschiedene Dateitypen öffnen kann, wie z.B. die .oir-Dateien von Olympus. Hier wurden die Dateien in .tif konvertiert, da es sich um ein weiter verbreitetes Format handelt.
2. Stellen Sie sicher, dass die richtige Skala eingestellt ist. Suchen Sie nach dem Pixel/μm-Verhältnis und dem Zeitintervall in den Metadaten/Eigenschaften.
3. Verwenden Sie verschiedene Filter, um Hintergrundgeräusche zu entfernen (z. B. einen Medianfilter mit einem Radius von 2 Pixeln, der in diesem Protokoll verwendet wird). Stellen Sie sicher, dass die Verarbeitung aller Bilder ähnlich ist, um Schwankungen bei der Nachbearbeitung zu minimieren. Da in diesen Experimenten Zählungen und Längen verglichen werden, sollte anstelle der mittleren Fluoreszenzintensität ein Filter verwendet werden, um die Klarheit und die Identifizierung und Messung von Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verbessern.
   HINWEIS: Die Verwendung und Größe der Filter hängt von der Größe der gewünschten Ziele und dem Signal-Rausch-Verhältnis in den Bildern ab.
4. Da die Heterogenität der Gefäßdichte zwischen den Sichtfeldern besteht, messen Sie die gesamte Gefäßfläche in jedem Feld mit dem Auswahlpinsel (Abbildung 7).
   1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das ovale Auswahlwerkzeug und wählen Sie das Auswahlpinsel-Werkzeug aus.
   2. Passen Sie die Größe des Pinsels an, indem Sie auf das Symbol für das Auswahlpinsel-Werkzeug doppelklicken.
   3. Zeichnen Sie über die Gefäße, um sie hervorzuheben/auszuwählen. Um Teile der Auswahl zu löschen, verwenden Sie [Alt]-Linksklick und fügen Sie Teile mit [Umschalt]-Linksklick hinzu.
   4. Drücken Sie [M], um den ausgewählten Bereich zu messen.
      HINWEIS: Wenn der Bildmaßstab richtig eingestellt wurde, sollte die Ausgabe in^{μm 2} erfolgen, was in mm² umgerechnet wird.
5. Zählen Sie die Anzahl der Blutplättchen und Leukozyten im Feld. Betrachten Sie Zellen als adhäsierte Zellen, wenn sie sich über einen Zeitraum von mehr als 30 s <1 Zellkörper bewegt haben. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen (Blutplättchen und/oder Leukozyten) pro mm².
6. Um den relativen Blutfluss innerhalb jedes Gefäßes zu schätzen, messen Sie die mittlere Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen (RBC) als Surrogat mit dem MTrackJ-Plugin in ImageJ/FIJI (imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)¹⁴, wie zuvor beschrieben⁵. Identifizieren Sie Erythrozyten als runde oder scheibenförmige Füllfehler im Dextrankanal. Speichern Sie die Tracks für Aufzeichnungen, asynchrone Analysen und Überprüfungen.
   HINWEIS: Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 8 und im ergänzenden Video S1 dargestellt.

Ergebnisse

Beurteilung der Wirkung der Vimentin-Stäbchendomäne bei der Leukozytenadhäsion an entzündetem Endothel
Die Bindung des Leukozyten-P-Selektin-Glykoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) an Endothel- und Thrombozyten-P-Selektin tritt während der akuten Phase einer Sepsis-induzierten Leberschädigung auf. Es wurde jedoch gezeigt, dass die rekombinante humane Stäbchendomäne von Vimentin (rhRod) an P-Selektin bindet und die Leukozytenadhäsion sowohl an das Endothel als auch an die Blutplättchen blockiert. Dieses Proto...

Diskussion

Der Zweck dieser Methodenarbeit besteht darin, die notwendigen Schritte zu skizzieren, die erforderlich sind, um zuverlässig hochauflösende intravitale Bilder und Videos der Mausleber unter homöostatischen Bedingungen und nach der Verabreichung von Endotoxin oder APAP zu erfassen. Während dieses Protokoll die konsistente Produktion von Daten über Thrombozyten-Leukozyten-Endothel-Interaktionen in der Leber ermöglicht hat, gibt es eine Reihe von kritischen Schritten, die für den Erfolg erf...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Chirurgisches Zubehör
2" x 2" Vliesschwämme	McKesson Med. Surg	92242000	Für die Leberisolierung
#4-0 geflochtenes Seidennaht mit Nadel	SOFSILK	N/A	4-0 Softsilk beschichtet geflochten schwarz, nicht resorbierbar: C-1 Schneidenadel
#4-0 geflochtenes Seidennaht ohne Nadel	Ethicon	N/A	4-0 Schwarze, geflochtene Seide, nicht resorbierbare
21 G stumpfe Nadel (0,5 inch)	SAI Infusion Technologies	B21-50	Diese Nadel wird verwendet, um am Ende der Trachealkanüle befestigt zu werden, um den Anschluss an das Beatmungsgerät zu ermöglichen. Eine alternative Quelle ist Instech
23 G stumpfe Nadel (0,5 Zoll)	SAI Infusion Technologies	B23-50	Diese wird für den Gefäßkatheter verwendet, um den Anschluss an eine Spritze zu ermöglichen. Eine alternative Quelle ist Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)	Kent Scientific	INS600393-G	Micro Dissecting Scissors; Hartmetall-Klingen; Gerade; Scharfe Spitzen; 24 mm Klingenlänge; 4 1/2" Gesamtlänge
McPherson-Vannas Mikroschere (Vannas)	Kent	Scientific INS600124	Diese sind nützlich für die Erstellung von Öffnungen in der Luftröhre und den Gefäßen
Polyethylenschlauch 10	Instech	BTPE-10	Dies wird verwendet, um den intravaskulären Teil des Katheters herzustellen. Eine alternative Quelle ist BD Intramedic
Polyethylenschlauch 50	Instech	BTPE-50	Dies wird verwendet, um den extravaskulären Teil des Katheters herzustellen. Eine alternative Quelle ist BD Intramedic
Polyethylenschlauch 90	Instech	BTPE-90	Dies wird zur Herstellung der Trachealkanüle verwendet. Eine alternative Quelle ist BD Intramedic
USP-Qualität sterile normale Kochsalzlösung	Coviden	8881570121	Hospira 0,0% Natriumchlorid-Injektion, USP
Mikroskopiezubehör
Isofluran-Verabreichungssystem und Beatmungsgerät	Kent Scientific	Somnosuite	Kombinations-Nagetierbeatmungsgerät und flüchtiges Anästhesie-Verabreichungssystem
Schaumstoff-Abstandshalter für Wärmekissen während der Mikroskopie	N/A	N/A	Dieser Abstandshalter sollte aus hochwertigem Schaumstoff geschnitten sein, sollte um die Lebermikroskop-Schale passen und die spezifischen Höhenabmessungen sind abhängig vom Mikroskopsystem
Laser-Scanning-Konfokalmikroskop-System mit Resonanzkopfscanner	Olympus	FV3000	Obwohl wir die Verwendung eines Olympus FV3000 mit einem Resonanzkopfscanner beschreiben, funktioniert dieses Protokoll mit den meisten bildgebenden Systemen.
Lebermikroskop-Tablett	N/A	N/A	Das Lebermikroskop-Tablett wurde für ein inverses Mikroskop entwickelt
Antikörper & Verwandte Reagenzien
Brilliant Violet 421/Anti-Maus Ly6G Antikörper	BioLegend	127628	3 µ g/Maus. Zur Markierung von Neutrophilen
BV421/F4/80 Antikörper	BioLegend	123132	0,75 mg/kg. Zur Markierung von Kupffer-Zellen
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium oder	Magnesium Gibco/ThermoFisher Scientific	14190144	Wird als Dialysat verwendet, um Natriumazid von Antikörpern zu entfernen
DyLight649/anti-GPIbβ Antikörper-Emfret	Analytics	X649	3 µ g/Maus. Zur Markierung von Blutplättchen
DyLight488/Anti-Maus GPIbβ Antikörper	emfret Analytics	X488	6 µ g/Maus. Zur Markierung von Blutplättchen
Endotoxin aus Escherichia coli Serotyp O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg; Die Wirksamkeit von Endotoxin kann von Charge zu Charge variieren. Daher sollte dieselbe Charge für eine Reihe von Experimenten verwendet werden, um die Variation aufgrund der Endotoxin-Charge
PerCP-eFluor 710/Anti-Maus-P-Selektin-Antikörper	Invitrogen	46-0626-82	4 µ g/Maus. Zur Markierung von P-Selektin
Slide-a-Lyzer 7.000 MWCO-Kassette	Thermo Scientific	66370	Zur Dialyse von Antikörpern zur Entfernung von Natriumazid
Texas Rot markiertes Dextran	Sigma-Aldrich	T1287	~150 kDa; 250 & Mikro; g/Maus
TRITC/Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A2289	500 µ g/Maus. Verdünnen Sie auf eine Stammkonzentration von 50 mg/ml (5%) in normaler Kochsalzlösung. Wird verwendet, um das Gefäßsystem zu beschriften. Es kann bei Entzündungen leichter in den interstitiellen Raum eindringen als Dextran mit hohem Molekulargewicht