Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Diedre Reitz; Jérôme Savocco; Aurèle Piazza; Wolf-Dietrich Heyer

doi:10.3791/64240

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Methodenartikel

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/64240

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11. September 2022

Diedre Reitz¹ , Jérôme Savocco² , Aurèle Piazza² , Wolf-Dietrich Heyer¹^,³

¹Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, ²Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, ³Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Zusammenfassung

DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche und Interstrang-Vernetzungen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus entstehen, können durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. Darüber hinaus stellt HR einen wichtigen Mechanismus der Replikationsgabelrettung nach Strömungsabriss oder Zusammenbruch dar. Die Regulierung der vielen reversiblen und irreversiblen Schritte dieses komplexen Weges fördert seine Treue. Die physikalische Analyse der während der HR gebildeten Rekombinationszwischenprodukte ermöglicht die Charakterisierung dieser Kontrollen durch verschiedene Nukleoproteinfaktoren und deren Interaktoren. Obwohl es gut etablierte Methoden gibt, um spezifische Ereignisse und Zwischenprodukte im Rekombinationsweg zu untersuchen, hat sich der Nachweis der Bildung und Ausdehnung der D-Schleife, zwei kritische Schritte in diesem Signalweg, bis vor kurzem als schwierig erwiesen. Hier werden effiziente Methoden zum Nachweis von Schlüsselereignissen im HR-Signalweg beschrieben, nämlich DNA-Doppelstrang-Bruchbildung, D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und die Bildung von Produkten durch bruchinduzierte Replikation (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Diese Assays detektieren ihre relevanten Rekombinationszwischenprodukte und Produkte mit hoher Empfindlichkeit und sind unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit. Die Erkennung von D-Schleifen, D-Schleifenverlängerung und dem BIR-Produkt basiert auf der Proximity-Ligatur. Zusammen ermöglichen diese Assays die Untersuchung der Kinetik von HR auf Populationsebene, um die Funktionen von HR-Proteinen und Regulatoren in signifikanten Schritten des Signalwegs genau zu adressieren.

Einleitung

Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus ko....