Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Zellmembranen sind sehr überfüllte und komplexe Systeme¹. Molekulares Crowding kann einen erheblichen Einfluss auf die Diffusion membrangebundener Entitäten wie Protein und Lipide ^2,3,4 haben. Ebenso werden bimolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen wie die Rezeptordimerisierung oder die Oligomerisierung von Membrankomplexen durch Crowding ^5,6,7 beeinflusst. Die Art, Konfiguration und Konzentration von Crowdern kann die Membranbindung, Diffusivität und Protein-Protein-Interaktion auf verschiedene Weise steuern ^8,9. Da die Kontrolle der Membranüberfüllung auf zellulären Membranen und die Interpretation ihres Einflusses auf eingebettete Biomoleküle eine Herausforderung darstellt, haben Forscher versucht, alternative In-vitro-Systeme zu etablieren¹⁰.

Ein beliebter Ansatz für künstliche überfüllte Membranen ist die Dotierung der Doppelschichtmembranen mit polymeren (wie Polyethylenglykol, PEG)-gepfropften Lipiden^11,12. Während der Visualisierung der Protein- und Lipiddynamik auf unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) schirmen diese Polymere die in die Membran eingebetteten Komponenten zusätzlich vom darunter liegenden negativ geladenen Substrat (z. B. Glas) ab, indem sie die Doppelschicht effektiv von der darunterliegenden Unterstützung wegheben. Durch Variation der Größe und Konzentration des Polymers kann man das Ausmaß der molekularen Verdrängung sowie seine Trennung vom zugrunde liegenden festen Träger^13,14 kontrollieren. Dies ist eindeutig ein Vorteil gegenüber Lipiddoppelschichten, die auf festen Substraten ohne Polymerpolster^15,16 gelagert werden, wo Transmembranbiomoleküle ihre Aktivität verlieren können^17,18,19. Noch wichtiger ist, dass es uns ermöglicht, die überfüllte Umgebung der Zellmembran in vitro zu rekapitulieren, was für viele Membranprozesse entscheidend ist.

Oberflächengepfropfte Polymere auf Membranen unterliegen ebenfalls Änderungen in ihrer Konfiguration in Abhängigkeit von ihrer Pfropfdichte¹². Bei geringen Konzentrationen verbleiben sie in einer entropisch gewundenen Konfiguration, einem sogenannten Pilz, über der Membranoberfläche. Mit zunehmender Konzentration beginnen sie zu interagieren und neigen dazu, sich abzuwickeln und auszudehnen, was schließlich zu einer dichten bürstenartigen Formation auf der Membran²¹ führt. Da der Übergang vom Pilz- zum Bürstenregime sehr heterogen ist und sich in schlecht charakterisierten Bedingungen des Polymers manifestiert, ist es wichtig, gut charakterisierte Bedingungen für das Gedränge auf polymergepfropften Membranen zu verwenden. Im Vergleich zu einer aktuellen Studie²⁰ identifizieren und berichten wir überfüllte Membranzusammensetzungen, die den diffusiven Transport und die Aktivität von Transmembranbiomolekülen aufrechterhalten.

In diesem Protokoll diskutieren wir, wie PEGylierte Lipidmembranen erzeugt werden können, und geben Empfehlungen für PEG-Dichten, die Crowding in zwei verschiedenen Regimen der Polymerkonfiguration (nämlich Pilz und Bürste) nachahmen. Das Protokoll beschreibt auch die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichdatenerfassung und -analyse für Moleküle, die in diese überfüllten Membranen eingebettet sind. Zunächst beschreiben wir die gründlichen Reinigungsschritte, den Aufbau der Bildgebungskammer und die Erzeugung von PEG-SLBs. Zweitens liefern wir Details für die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichexperimente. Drittens diskutieren wir i) die Extraktion der relativen Bindungsaffinitäten, ii) die Charakterisierung der molekularen Diffusion und iii) das Zählen von Untereinheiten in einer Proteinanordnung aus Filmen einzelner Moleküle auf der Membran.

Während wir dieses System mit Einzelmolekül-Bildgebung charakterisiert haben, ist das Protokoll für alle Membranbiophysiker nützlich, die daran interessiert sind, die Wirkung von Crowding auf biomolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen zu verstehen. Insgesamt präsentieren wir eine robuste Pipeline zur Herstellung von überfüllten und unterstützten Lipiddoppelschichten, zusammen mit verschiedenen Einzelmolekül-Assays, die an ihnen durchgeführt werden, und den entsprechenden Analyseroutinen.

1. Reinigung von Objektträger und Deckglas für Einzelmolekülexperimente

1. Vor dem Zusammenbau der Bildkammer reinigen und bereiten Sie sowohl die Deckgläser als auch die Objektträger vor. Bohren Sie mehrere Lochpaare auf die Glasobjektträger mit einer Bohrmaschine mit diamantbeschichteten Bohrern (0,5-1 mm Durchmesser). Wenn Acrylplatten verwendet werden, verwenden Sie einen Laserschneider, um präzise Löcher (0,5 mm) zu bohren, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   HINWEIS: Jedes Lochpaar dient als Einlass und Auslass für den Strömungsaustausch für eine einzelne mikrofluidische Kammer. Eine repräsentative CAD-Datei für Bohrungen in einem Acrylobjektträger finden Sie in der ergänzenden Kodierungsdatei 1. Löcher, die auf Glasobjektträgern gebohrt werden, sind normalerweise 1,5x-2x größer als die Bohrkrone.
2. Reinigen Sie die Objektträger und Deckgläser mit Reinigungsmittel. Spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie die Dias und Deckgläser in ein separates Diafärbungsglas (Coplin) mit Wasser und beschallen Sie es für 30 Minuten in einem Badesonicator. Verwenden Sie für alle Beschallungsschritte eine Leistungseinstellung von 70 W.
3. Entfernen Sie das Wasser und füllen Sie das Coplin-Glas mit den Glasobjektträgern und Deckgläsern bis zum Rand mit Aceton (50-100 ml je nach Glasvolumen). Verwenden Sie bei Acrylplatten das gleiche Volumen an vorgemischter 50% (v/v) Acetonlösung, da sonst die Objektträger frostig werden. Schütteln Sie das Coplin-Glas, um sicherzustellen, dass alle Objektträger und Deckgläser vollständig in die Lösung eingetaucht sind, und beschallen Sie es für 30 Minuten in einem Badsonicator.
4. Entfernen Sie das Aceton und entsorgen Sie es in einem Abfallbehälter, gießen Sie Methanol in die Coplin-Gläser (50%, v / v für Acrylobjektträger) und beschallen Sie es für 30 min. Sowohl Aceton als auch Methanol werden verwendet, um organische Partikel auf den Objektträgern zu entfernen.
5. Spülen Sie die Objektträger und Deckgläser mit reichlich Wasser vom Typ 1 ab und legen Sie sie in ein Glasglas. Gießen Sie 1 M KOH-Lösung in das Glas und beschallen Sie für 1 h. Verwenden Sie für die Acryldias 0,5 M KOH.
6. Entsorgen Sie den KOH in einem anorganischen Abfallbehälter. Spülen Sie das Glas mit viel Wasser ab und legen Sie die Coplin-Gläser zur Piranha-Behandlung in einen Abzug. Führen Sie keine Piranha-Behandlung für Acryl-Objektträger durch; Fahren Sie direkt mit Schritt 1.9 fort.
   ACHTUNG: Die Piranha-Behandlung sollte in einem Abzug mit geeigneten Handschuhen, Schutzbrille und einer Schürze für den Umgang mit Säuren durchgeführt werden. Piranha-Lösung ist ein starkes Oxidationsmittel und entfernt alle übrig gebliebenen organischen Partikel von den Objektträgern und Deckgläsern.
7. Zur Herstellung der Piranha-Lösung gießen Sie vorsichtig ein 2/3-Volumen Schwefelsäure (98%, v / v) in ein Glasbecherglas und füllen den Rest mit Wasserstoffperoxid (30%, v / v). Mischen Sie die Lösung vorsichtig mit einem Glasstab, gießen Sie sie in das Coplin-Glas und lassen Sie das Coplin-Glas mindestens 1 h im Abzug.
8. Dekantieren Sie die Piranha-Lösung aus dem Coplin-Glas in einem Entsorgungsbehälter für saure Abfälle, die im Abzug aufbewahrt werden. Spülen Sie das Coplin-Glas mit einer reichlichen Menge Wasser vom Typ 1 ab.
9. Trocknen Sie die Objektträger und Deckgläser in einem sanften Stickstoffgasstrom und legen Sie sie in ein sauberes Coplin-Glas. Die getrockneten Objektträger und Deckgläser sind nun bereit für die Plasmabehandlung. Nehmen Sie ein Paar Dias und Deckgläser und legen Sie sie in die Plasmamaschine.
10. Erzeugen Sie ein Vakuum in der Kammer. Drehen Sie den Knopf auf die Radiofrequenz von 8-12 MHz, um Plasma in der Kammer zu erzeugen. Ein violettes Leuchten in der Kammer zeigt die Bildung eines Plasmas in der Kammer an.
11. Führen Sie die Plasmabehandlung für 8-10 min durch. Lassen Sie das Vakuum nach dem Ausschalten des Plasmas vorsichtig los und fahren Sie mit Schritt 2 für den Zusammenbau der mikrofluidischen Bildgebungskammer fort.

2. Montage der mikrofluidischen Kammer

HINWEIS: Die Bildkammer wird erstellt, indem doppelseitiges Klebeband zwischen einem vorgereinigten Deckglas und einem Objektträger aus dem vorherigen Schritt wie unten beschrieben eingeklemmt wird.

1. Montieren Sie die Objektträger und das Deckglas nach der Plasmabehandlung wie in Abbildung 1 dargestellt. Legen Sie den Objektträger auf ein sauberes Seidenpapier. Schneiden Sie das doppelseitige Klebeband in ~2-3 mm breite Streifen und legen Sie sie auf jede Seite eines Lochpaars auf dem Glasobjektträger. Verwenden Sie eine Pipetspitze, um das Band abzuflachen, da es sonst zu einem Auslaufen von einem Kanal zum anderen kommt.
   HINWEIS: Alternativ können Sie das Band für das gesamte Objektträger mit einem Laser oder einem automatischen Plotterschneider schneiden (Abbildung 1).
2. Legen Sie das plasmabehandelte Deckglas auf den geklebten Objektträger, um die Kammer zu schließen. Verwenden Sie eine Pipetenspitze, um das Deckglas vorsichtig auf die abgeklebten Bereiche zu drücken, um den Kanal wasserdicht zu machen.
3. Wenn Sie Glasobjektträger verwenden, versiegeln Sie die Kanten mit Epoxidharz. Schließlich hat jede Bildkammer aus Objektträger und Deckglas eine Abmessung von 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (Länge x Breite x Tiefe). Lagern Sie die vorbereiteten mikrofluidischen Bildgebungskammern für 1-2 Wochen unter getrockneten Bedingungen (vorzugsweise zwischen 10-25 °C).
   HINWEIS: Für die lasergeschnittenen Bänder, die mit Acrylobjektträgern verwendet werden, ist es nicht notwendig, Epoxidharz zu verwenden, da die Bandkanten eine dichte, auslaufsichere Abdichtung bilden.

3. Herstellung von gestützten Doppelschichten auf Glassubstrat durch Vesikelfusion

HINWEIS: Überfüllte unterstützte Lipiddoppelschichten werden an den Wänden der Bildgebungskammer durch die Fusion von Lipidvesikeln erzeugt, die mit dotierten PEG-Lipiden präpariert wurden.

1. Nehmen Sie eine saubere Durchstechflasche aus Glas, vorzugsweise vorgereinigt mit Piranha-Lösung. Man fügt Chloroformlösung von 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(polyethylenglykol)-2000] (DOPE-PEG2000) in die gewünschte Molfraktion von PEG2000-Lipiden ein, so dass die Endkonzentration nach Zugabe von Puffer 3 mM Lipide in Schritt 3.4 beträgt. Andere Membranzusammensetzungen von Lipiden werden ähnlich hergestellt.
2. Trocknen Sie das Chloroform aus der Durchstechflasche mit einem leichten Stickstoffstrahl mit einem kleinen Wirbel, so dass die getrockneten Lipide gleichmäßig auf der Oberfläche der Durchstechflasche beschichtet sind. Legen Sie die Durchstechflasche für 1 h in einen Vakuum-Exsikkator. Dadurch werden alle Reste von Chloroform in der Durchstechflasche aus dem Glas entfernt. 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Bereiten Sie kleine unilamellare Vesikel (SUVs) wie unten beschrieben vor.
   1. Nach nächtlicher Inkubation 1-2 min vorsichtig vorziehen, bis die Lösung trüb und milchig wird.
   2. Nehmen Sie 100 μL dieser Lösung in ein kleines 500-μL-Zentrifugenröhrchen und beschallen Sie für ca. 1 Stunde in einem Badsonikator (eingestellt auf eine 70-W-Leistungseinstellung). Die Lösung wird klar werden; Wenn nicht, dann beschallen Sie für weitere 30 Minuten. Dieser Schritt wird SUVs mit einem Durchmesser von 50-100 nm erzeugen.
      HINWEIS: Wenn Sie sich zum ersten Mal vorbereiten, charakterisieren Sie die SUVs mit dynamischer Lichtstreuung^22,23 (DLS) oder einer gleichwertigen Methode.
4. Calciumchlorid (CaCl 2, 3 M Vorrat) zu den beschallten Vesikeln geben_, so dass seine Endkonzentration 30 mM in der Lipidlösung beträgt.
5. Schneiden Sie eine Mikropipettenspitze zum Einspritzen der Probenlösung so ab, dass sie fest in das Loch passt. Mischen Sie die Lipidlösung und injizieren Sie durch eines der in Schritt 2 gemachten Löcher in der Bildgebungskammer. Wischen Sie die überschüssige Lösung, die aus der Kammer kommt, mit einem sauberen Tuch ab, um die Kontamination benachbarter Kanäle zu verhindern.
6. Lassen Sie diese Baugruppe 90 min in einer befeuchteten Kammer. Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie ein feuchtes Tuch am Ende eines 50-ml-Zentrifugenröhrchens platzieren. Legen Sie den Schieber seitlich in das Rohr mit geschlossenen Rohrkappen. Die Vesikel verschmelzen und erzeugen eine gleichmäßige Doppelschicht auf der Glasoberfläche.
7. Waschen Sie die Kammer gründlich mit einer großen Menge PBS-Puffer (etwa das 5-fache Volumen der Bildkammer). Verhindern Sie das Eindringen von Luftblasen in die Kammer während des Waschens, da dies zu Defekten in der Membran führen kann.

4. Mikroskopaufbau und Einzelpartikel-Bildgebungsmessungen

HINWEIS: Einzelmolekülexperimente werden an einem objektivbasierten Mikroskopaufbau mit interner Totalreflexionsfluoreszenz^24,25,26 (TIRF) durchgeführt (Abbildung 2). Die TIRF-Bildgebung bietet ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis für die Einzelmolekül-Bildgebung, obwohl Epifluoreszenzmikroskope auch unter bestimmten Bedingungen verwendet werden können (insbesondere wenn die fluoreszierenden Biomoleküle durch Waschen aus der Bulk-Lösung entfernt werden können). Der Prismentyp TIRF kann verwendet werden, aber der Objektivtyp ist vorzuziehen, um die Einrichtung der Mikrofluidik²⁷ zu erleichtern. Für Objektiv-TIRF wird ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur (100-fache Vergrößerung, normalerweise als TIRF-Objektiv im Handel erhältlich) empfohlen.

1. Bevor Sie ein Experiment zur Mobilität und Montage durchführen, richten Sie das TIRF-Mikroskop aus, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund der Beleuchtung durch das evaneszente Feld zu gewährleisten. Halten Sie die Laserleistung während der Ausrichtung niedrig, zwischen 100 μW und 1 mW.
   ACHTUNG: Beim Ausrichten des Laserstrahls sollte eine Laserschutzbrille verwendet werden.
   1. Um das Mikroskop auszurichten, bereiten Sie eine fluoreszierende Perlenprobe vor, indem Sie sie in niedrigen Konzentrationen (bei ~ 100 pM) in den mikrofluidischen Kanal geben, so dass sich fluoreszierende Flecken von einzelnen Perlen in den Bildern nicht überlappen.
   2. Visualisieren Sie zunächst die Perlen im Epifluoreszenzmodus. Während sich die Beleuchtung im Epifluoreszenzmodus befindet, bewegen Sie den M5-Spiegeltranslationstisch (den Spiegel, der den Laser zum dichroitischen reflektiert) so, dass sich der aus dem Objektiv kommende Strahl biegt, bis er sich schließlich in einer vollständigen internen Reflexionskonfiguration befindet.
   3. Überprüfen Sie, ob die TIR-Beleuchtung erreicht wurde. Wenn das TIR-Evaneszenzfeld die Wulstprobe beleuchtet, ist zu prüfen, ob nur die Perlen auf der Oberfläche sichtbar sind und keine frei schwebenden Perlen von der Oberfläche entfernt beobachtet werden.
2. Stellen Sie zu Beginn des Experiments die Laserleistung an der hinteren Brennebene des Objektivs auf 5-10 mW ein, um eine Photozerstörung (Photobleiche) der Fluorophore zu verhindern.
3. Halten Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich zuerst auf die nackte Membran (ohne Fluorophore). In der Regel reichen dazu kleine Spuren von Verunreinigungen in Lipidmembranen aus. Optional: Fügen Sie in Schritt 3.1 eine kleine Anzahl fluoreszierender Perlen oder Quantenpunkte (sub-picomolarer Bereich) ein, so dass nur zwei bis fünf fluoreszierende Partikel im Sichtfeld vorhanden sind, um die Identifizierung des richtigen Fokus zu erleichtern.
4. Die Probe (Membranproteine usw.) wird mit einer Mikropipette in die in Schritt 3.7 hergestellte PEG-SLB-beschichtete Bildgebungskammer injiziert.
5. Um die Einzelmolekülbindungskinetik zu messen, verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um die markierten Biomoleküle durch die Einlasslöcher in die mikrofluidische Kammer zu leiten (Abbildung 3). Verwenden Sie eine Durchflussrate von 50-500 μL/min.
   1. Starten Sie die Filmaufnahme, bevor Sie die Lösung in die Bildkammer hinzufügen. Erfassen Sie >5.000 Bilder mit einer Bildrate von 25-50 Bildern / s unter kontinuierlichem Fluss, bis das Auftreten neuer Flecken auf der Membranoberfläche nicht weiter zunimmt (Video 1). Für die Analyse der Bindungskinetik folgen Sie den Schritten aus 6.1.
6. Für die Einzelpartikelverfolgung fügen Sie die markierten Biomoleküle in niedrigen Konzentrationen (im Vergleich zur Bindungskonstante) mit einer Mikropipette in den Kanal ein. Optimieren Sie die Konzentration auf eine Dichte von <0,1 Partikel/μm 2, so dass sich einzelne Partikel selten kreuzen (Video 2). Dies gewährleistet die hohe Genauigkeit der aus den Datensätzen wiederhergestellten Spuren. Bei Bedarf inkubieren (bei schlechter Membranbindung durch Biomoleküle, ~10 min) in einer befeuchtenden Umgebung und waschen Sie die Kammer mit dem Puffer.
   HINWEIS: Waschen ist erforderlich, wenn die Bindung auf der Membran schlecht ist und die meisten fluoreszierenden Moleküle in der Lösung verbleiben. Andernfalls kann dies die Bildgebung beeinträchtigen und zu einem schlechten Signal-Rausch-Verhältnis führen.
7. Für die Einzelpartikel-Trajektorienanalyse erfassen Sie 200-500 Frames bei 10-100 Frames/s. Halten Sie die Objektivlinse während des Aufnahmeintervalls mit minimaler Stufendrift auf die Doppelschichtebene gerichtet.

5. Bildaufnahme zur Zählung von Untereinheiten in einer Proteinanordnung

HINWEIS: Die Bildaufnahme zur Schätzung der Stöchiometrie erfordert ein kontinuierliches Bleichen von Fluorophoren und die Erkennung der Anzahl der Schritte, bis keine Fluorophore mehr Fluoreszenz emittieren.

1. Für die Messung von Untereinheiten addieren Sie die relevante Konzentration der markierten Biomoleküle (Beispiel: siehe Ergebnisse; ClyA wurde in einer Konzentration von 25 nM in die mikrofluidische Bildgebungskammer gegeben und inkubiert (ggf. waschen). Inkubieren Sie den Objektträger in einer Befeuchtungskammer bei der gewünschten Temperatur für die erforderliche Zeit (Beispiel: 37 °C und 60 min für die Montage von ClyA).
2. Führen Sie die Bildaufnahme für die Einzelmolekül-Photobleiche wie unten beschrieben durch.
   1. Waschen Sie die Bildkammer vor der Bildgebung mit einem Puffer (falls erforderlich). Legen Sie den Objektträger auf das Mikroskop und passen Sie den Fokus an, um die markierten Moleküle sichtbar zu machen.
   2. Stellen Sie die Laserleistung auf ein Niveau ein, bei dem das Bleichen des Fluorophors allmählich erfolgt (~1-5 min). Idealerweise halten Sie für jedes zusammengesetzte Biomolekül die Photobleichschrittrate >10-20 Bildgebungsrahmen auseinander. Nehmen Sie die Bilder auf, bis alle Moleküle vollständig photogebleicht sind (Video 3).
      HINWEIS: Um die Gesamtdauer der erforderlichen Photobleichbahn zu bestimmen, zeichnen Sie die durchschnittliche Intensität einzelner Spots mit der Anzahl der Bildgebungsbilder und bestimmen Sie die Zeitkonstante durch Anpassung einer exponentiellen Zerfallsfunktion. Die Gesamtdauer der Erfassung kann auf das 5-10-fache der Zeitkonstante eingestellt werden.
3. Führen Sie eine zeitabhängige Montagemessung durch, indem Sie die Filmaufnahme starten, sobald die Probe in die Kammer eingeführt wird, und neue Photobleichfilme in festen Zeitintervallen nach der Membranbindung aus verschiedenen Segmenten des PEG-SLB aufnehmen.

6. Bild- und Datenanalyse

1. Führen Sie die Einzelpartikelbindung und -verfolgung wie unten beschrieben durch.
   1. Extrahieren Sie Einzelpartikel-Trajektorien aus den oben aufgenommenen Filmen, wie in Abbildung 4 gezeigt. Um einzelne Partikel zu erkennen und zu verfolgen, verwenden Sie das MATLAB-Paket u-track²⁸ oder das Trackmate²⁹, ein Plugin in ImageJ, das auch einen robusten Einzelpartikel-Tracking-Algorithmus bietet. Führen Sie die Schritte zum Einrichten der U-Spur-Analyse aus, wie in Zusatzdatei 1 gezeigt.
      HINWEIS: Die kritischen Parameter für die Einzelpartikelverfolgung sind die Standardabweichung der Partikelgröße (in Pixeln) und die Länge des Lückenschlusses. Verwenden Sie 1 bzw. 0 für diese Parameter als strengste Kriterien für die Nachverfolgung.
   2. Um die Bindungsratenkonstanten zu berechnen, schätzen Sie zunächst die Anzahl der Partikel, die sich im Laufe der Zeit an die Membranoberfläche binden. Verwenden Sie die MATLAB-Datei binding_SPT (Supplementary Coding File 2) mit dem u-track-Ausgabeordner, um die Anzahl der Partikel auf der Membran aus Schritt 6.1 zu identifizieren und darzustellen. Anpassung der beobachteten Kinetik an geeignete kinetische Modelle (Beispiel: einzelne exponentielle Anpassung zur Bestimmung der Zeitkonstante, deren Inverse der scheinbaren Ratenkonstante zugeordnet werden kann)³⁰ , um die Geschwindigkeitskonstanten zu extrahieren (siehe Ergebnisse, Abbildung 5).
   3. Die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) der diffundierenden Partikel (z. B. DNA-Tracer in PEG-SLBs, Abbildung 6) zeigt die Art der Diffusion an. Verwenden Sie das MATLAB-Paket MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) mit dem u-track-Ausgabeordner, um das MSD-Diagramm als Funktion der Verzögerungszeit zu erhalten (Abbildung 6B).
   4. Um heterogene diffuse Spezies zu identifizieren, berechnen Sie ISD-Verteilungen (Instantane Squared Displacement), wie in Abbildung 6C dargestellt. ISD2, definiert als (X t+τ - X t)2 + (Y_t+τ− Y_t)2, wobei die Verzögerungszeit _τ = ² bevorzugt wird, da sie das Rauschen reduziert. Filtern Sie kurze Flugbahnen mit weniger als drei Bildern heraus, um das Rauschen zu reduzieren.
   5. Verwenden Sie ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) in MATLAB mit dem U-Track-Ausgang, um die ISDs der verfolgten Partikel aufzuzeichnen (Abbildung 6C).
2. Führen Sie eine Einzelmolekül-Photobleichanalyse wie unten beschrieben durch.
   1. Um die Stöchiometrie der Membrankomplexe abzuschätzen, führen Sie eine Photobleichanalyse der zeitabhängigen Intensitäten der fluoreszierenden Komplexe durch (Video 3). Wenden Sie dazu einen Driftkorrekturalgorithmus (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) an, der auf der Autokorrelation von Filmbildern basiert, um die Übersetzungsdrift zu extrahieren. Dies setzt voraus, dass die montierten Strukturen bei der Bildaufnahme weitgehend unbeweglich sind. Führen Sie das MATLAB-Paket Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) aus, um Zeitspuren der Partikelintensität aus den Filmen zu erkennen.
   2. Verwenden Sie die MATLAB-Code-Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2), um die Schritterkennung für die Intensitätszeitspuren durchzuführen. Falls die Partikel nicht unbeweglich sind, verwenden Sie das U-Track-Paket, um den Ort der sich bewegenden Partikel zu extrahieren. Dieser Satz von xy-Koordinaten kann den Rohfilmen zugeordnet werden, um die Intensitätswerte des sich bewegenden Partikels zu extrahieren, während es seitlich auf der Membran diffundiert. Verwenden Sie für diese Option das MATLAB-Paket utrack_Int (Supplementary Coding File 2) mit der Ausgabe der U-Track-Analyse.
   3. Führen Sie eine Korrektur für unvollständige Markierung der Biomoleküle mit Fluorophor-Tags durch, um die korrekte Proteinkomplex-Stöchiometrie abzuschätzen. Bestimmen Sie die Markierungseffizienz mit einem UV-VIS-Spektralphotometer, indem Sie die Absorption von Farbstoff und Protein messen, um die Konzentration abzuschätzen. Berechnen Sie die Markierungseffizienz als molares Verhältnis des Farbstoffs zum Protein.
      HINWEIS: Einige Farbstoffe absorbieren auch bei Wellenlängen nahe 280 nm, und daher sollte dieser Absorptionsbeitrag des Farbstoffs bei der Konzentrationsberechnung berücksichtigt werden.
   4. Führen Sie eine Binomialkorrektur durch, um die unvollständige Markierungseffizienz des Fluorophors auf folgende Weise zu berücksichtigen, indem Sie den MATLAB-Code Step_correction (Supplementary Coding File 2) mit den Daten aus der Schrittzählung in Schritt 6.2.2 verwenden. Zum Beispiel wenden Sie für ein porenbildendes Toxin wie Cytolysin A, das eine dodekamerische ringartige Struktur bildet, eine Binomialkorrektur mit der folgenden Formel an:
      n_k
      wobei = Beschriftungseffizienz, n = Anzahl der Photobleichschritte und s = tatsächliche Anzahl. Verwenden Sie die MATLAB-Routine Stepcount_immobile, um die korrigierten oligomeren Spezies wiederherzustellen. Man rechnet die Häufigkeit von Oligomeren (s_i) in Massenanteile um (Abbildung 7C; Ergänzende Kodierungsdatei 2).
      HINWEIS: Eine Reihe von analysierten Dateien ist in der ergänzenden Kodierungsdatei 3 enthalten. Die MATLAB-Codes in Supplementary Coding File 2 können mit diesen Datensätzen ausgeführt werden.

Überwachung der Bindung von ClyA-Protein an PEGylierte Membranen
Nach Schritt 4.5 wird die Bindungskinetik geschätzt, indem die Anzahl der Partikel, die sich im Laufe der Zeit an die Membranoberfläche binden, aufgetragen wird (Video 1). Wenn das ClyA-Protein an eine Membran mit 5 Mol-% PEG2000-Lipiden bindet, nimmt die Partikeldichte zu und erreicht die Sättigung (Abbildung 5). Eine exponentielle Zerfallsanpassung an die gebundenen Teilchen (Cyankreise) ergibt die Zeitkonstante (τb) für die Membranbindung (insbesondere passen die Anfangszeitpunkte [rote Kreise] in diesem Fall nicht an).

Mobilität von DNA-Tracern auf überfüllten Membranen
Wir verwenden üblicherweise DNA-Tracer (DNA, die mit einem Tocopherol an der Membran verankert ist), lipophile Tracerfarbstoffe (z. B. DiI) oder Membranproteine (z. B. ClyA), um die Membran unter PEG-vermitteltem Crowding zu charakterisieren. Die laterale Diffusion markierter Tracermoleküle (25–100 pM) kann überwacht werden, indem die Membran bei Partikelbindung abgebildet wird. In Ermangelung eines PEG-Polymers in der Membran zeigen die meisten Tracer (insbesondere solche, die sich außerhalb der Doppelschicht erstrecken) eine eingeschränkte Diffusion auf SLBs (Abbildung 6A). Mit geringen Mengen an PEG2000 in der Membran (0,5-2 Mol%) hebt sich die Doppelschicht von der darunter liegenden Oberfläche ab und die Tracermoleküle können ohne Einschränkungen diffundieren. Auf der anderen Seite wird ein extremer Einschluss bei einer hohen Konzentration von PEG (20 Mol%) beobachtet, wobei sich PEG-Moleküle in einem dichten Pinselregime befinden, wobei dazwischen eine Vielzahl von Verhaltensweisen gezeigt wird. MSD-Diagramme für diese drei Bedingungen sind in Abbildung 6B dargestellt. Basierend auf unserer Charakterisierung von POPC/DOPE-PEG2000-Doppelschichtmembranen empfehlen wir eine 1-3 mol-% DOPE-PEG2000-Fraktion, die eine Verdrängung im Pilzregime induziert. Oberhalb von 7,5 Mol-% PEG2000-Lipid beobachten wir den Beginn des Pinselregimes, und Zusammensetzungen bis 25 Mol-% PEG2000-Lipid können verwendet werden, um Verdrängung und Einschluss zu induzieren. Die dazwischenliegenden 4–7% PEG2000-Lipidbedingungen, die dem Übergang zwischen den beiden Regimen entsprechen, sind schlecht charakterisiert und sollten vermieden werden.

Montage von ClyA auf überfüllten Membranen
Die Intensitätsverläufe einzelner beugungsbegrenzter Flecken des ClyA-Proteins nach Inkubation auf der überfüllten Membran (Abbildung 7A,B) zeigen eine große Anzahl unterschiedlicher Photobleichschritte, was auf die Bildung verschiedener Montagezwischenprodukte31 hindeutet. ClyA, ein Transmembranprotein, interagiert in Abwesenheit von PEG mit der negativ geladenen Glasoberfläche und baut sich sehr schlecht zusammen. Bei 7,5 Mol-% PEG2000-Lipiden wurden die zusammengesetzten Komplexe gemessen und sind in Abbildung 7C dargestellt. Nach Korrektur der Markierungseffizienz (0,9 in diesem Fall) zeigt die endgültige Verteilung der Oligomere die dodekamerische ClyA-Spezies als dominante Struktur, die mit den Strukturdatenübereinstimmt 32.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Reinigungsschritte und des mikrofluidischen Kammeraufbaus. (A) Die Glasobjektträger und die Deckgläser werden mit sequentieller Beschallung in Waschmittel, Aceton, Methanol, KOH und Piranha-Lösung gereinigt, wobei zwischen jedem Schritt mehrfach mit Reinstwasser vom Typ 1 gespült wird. Die Objektträger und Deckgläser werden dann vor der Plasmabehandlung mit Stickstoffgas getrocknet. (B) Die mikrofluidische Bildgebungskammer wird dann mit einem vorgeschnittenen doppelseitigen Klebeband zusammengesetzt, das den Objektträger mit dem Deckglas verbindet. * Acryldias werden nicht mit Piranhalösung behandelt, und Aceton, Methanol und KOH werden in einer Konzentration von 50% (v / v) verwendet, die für die Deckglasreinigung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: TIRF-Mikroskopaufbau. Ein typischer objektiver TIRF-Mikroskopaufbau, der an ein inverses Mikroskop angepasst ist, wird gezeigt, wobei wesentliche Optiken hervorgehoben werden. M1–M5 sind Spiegel zur Steuerung des Laserstrahls. Die Linsen L1 und L2 werden verwendet, um den Laserstrahl zu erweitern, und die L3-Linse fokussiert den Laserstrahl auf die hintere Brennebene des Objektivs. I1 und I2 sind die Irismembranen, mit denen der Laserstrahl ausgerichtet wird. Ein Verschluss wird verwendet, um die Laserstrahlbeleuchtung zu steuern, die entscheidend ist, um unnötiges Photobleichen der Fluoreszenzmoleküle zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Aufbau der Membranbindungskinetik. Für die Durchführung des Bindungsexperiments wird ein dünner PTFE-Schlauch (0,022 in ID x 0,042 in OD) verwendet, um die Probe mit Hilfe einer Spritzenpumpe zu fließen (Bild nicht maßstabsgetreu). Das Ende des Schlauchs ist mit Hilfe einer Mikropipettenspitze mit dem Ausgang der Bildgebungskammer verbunden. Der Abwurf wird in einem kleinen Mikrospitzenreservoir gesammelt, das in die Steckdose gesteckt ist, und das eingeführte Volumen ist immer größer als das 10-fache des Volumens der Bildgebungskammer. Einschubabbildung mit Querschnitt der Bildgebungskammer. (Bild nicht maßstabsgetreu) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Pipeline für die Analyse von Einzelpartikeltrajektorien und Photobleichfilmen. (A) Die aufgenommenen Filme wurden mit U-Track in MATLAB analysiert, um die Trajektorien als (x, y) und die Intensitäten (i) jedes Partikels Bild für Bild zu erhalten. Diese Trajektorien wurden dann verwendet, um die momentane quadratische Verschiebung (ISD), ISD1 und ISD2 zu berechnen. Die ISDs können dann als Histogramme dargestellt werden, um mobile Arten zu identifizieren. Alternativ geben MSD-Diagramme (Mean Squared Displacement Plots) Aufschluss darüber, ob die Bewegung Gauß, begrenzt oder superdiffusiv ist33,34. Die Hidden-Markov-Modell-35-Analyse (HMM) kann verwendet werden, um verschiedene diffusive Zustände eines einzelnen Partikels zu unterscheiden. (B) Für die Photobleichanalyse wurden die Filme zunächst auf Drift im System korrigiert (falls erforderlich), gefolgt von Partikeldetektion oder Tracking mittels U-Track. Neben der Schätzung der Intensitätsverteilung23 (und anderer Partikelmerkmale) können die Intensitätstrajektorien für die Anzahl der Photobleichschritte mit Hilfe von Schrittfindungsalgorithmen36,37,38 analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Bindung von ClyA an unterstützte Lipidmembranen mit 5 mol% DOPE-PEG2000. Eine typische Bindungskurve erhält man, nachdem die Anzahl der Partikel in jedem durch die U-Spur identifizierten Frame gezählt wurde. Die Bildgebung wird vor dem Fluss des membranbindenden ClyA-Proteins eingeleitet. Eine exponentielle Zerfallsfunktion (schwarze Linie), die an Teilchenzahlen (Cyankreise) angepasst ist, wird verwendet, um die Zeitkonstante für die Bindung von ClyA an die Membran wiederherzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Mobilität lipophiler DNA auf PEG-Lipid-Doppelschichtmembranen . (A) Schematische Darstellung des lipophilen DNA-Tracers in der POPC/DOPE-PEG2000-Membran. (B) Mittlere quadratische Verschiebungen, die aus der Einzelpartikelverfolgung für verschiedene PEG-SLBs berechnet wurden, werden gezeigt. In 2 mol% DOPE-PEG2000 zeigt der DNA-Tracer reines Brownsches Verhalten im Vergleich zu behinderter Mobilität in Abwesenheit des Polymers (gestrichelte Linie ist als Referenz enthalten). Auf der anderen Seite weicht derselbe DNA-Tracer von der reinen Brownschen Diffusion ab, was auf eine subdiffusive Bewegung mit reduzierter Mobilität in Gegenwart von 20 Mol-% DOPE-PEG2000 hinweist. (C) Die ISD2-Verteilung für die Diffusion lipophiler DNA-Tracer in zwei verschiedenen PEG2000-Lipidmembranen wird mit nackten SLBs verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Photobleichspuren und der Aufbau von ClyA auf Lipiddoppelschichtmembranen. (A,B) Repräsentative Zeitspuren zeigen Photobleichschritte des ClyA-Nanoporenkomplexes, die in Schritt 6.2.1 nachgewiesen wurden. für einen montierten ClyA-Komplex mit 7 bzw. 5 Schritten. (C) Die Photobleichschrittverteilung (grau) für ClyA (25 nM), inkubiert auf 64,7% POPC: 27,8% Cholesterin: 7,5% DOPE-PEG2000 Membran für 60 min bei 37 °C ist dargestellt. Nach Korrektur der unvollständigen Markierungseffizienz wird der geschätzte Massenanteil verschiedener oligomerer Spezies (Magenta) gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Bindung von ClyA an die Membran. Überwachung der Cy3-markierten ClyA-Proteinbindung an die SLB-Membran, die 5 mol% DOPE-PEG2000 enthält. Die gebundenen Partikel werden durch U-Spur detektiert (Cyankreise), und Spuren werden für fünf nachfolgende Positionen in ihrer Flugbahn aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Diffusion des DNA-Tracers auf der 2 mol% PEG-Membran. Ein Film für Cy3-markierte DNA, die über Tocopherol in der 2 mol% PEG2000-Membran an der Lipidmembran verankert ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Photobleaching-Film. Ein Film von zusammengesetzten Oligomeren von Cy3-markierten ClyA-Molekülen auf der Membran mit 7,5 Mol-% DOPE-PEG2000. Größere Komplexe zeigen sich an den um ein Vielfachen höheren Intensitäten im Vergleich zu einem einzelnen Protein sowie an den mehrfachen Photobleichschritten, wenn die Partikelintensität über die Zeit unter kontinuierlicher Beleuchtung beobachtet wird. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Informationen zur Verwendung von u-track und verschiedenen MATLAB-Codes in Schritt 6. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: Eine repräsentative CAD-Datei (Computer-Aided Design) zum Lochen des Acrylobjektträgers und zum Schneiden von Klebeband für das gesamte Dia. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdateien 2: Komprimierter Ordner mit zugehörigen MATLAB-Codes, die für die Bild- und Datenanalyse in Schritt 6 benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdateien 3: Beispieldaten für die Bild- und Datenanalyse in Schritt 6. Die MATLAB-Codes sind auch unter https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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