Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.

Abstract

Die Bestimmung der Bindungsaffinität und des Bindungsverhaltens zwischen einem Aptamer und seinem Ziel ist der wichtigste Schritt bei der Auswahl und Verwendung eines Aptamers für die Anwendung. Aufgrund der drastischen Unterschiede zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen müssen Wissenschaftler viel Aufwand betreiben, um ihre Bindungseigenschaften zu charakterisieren. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein leistungsfähiger Ansatz für diesen Zweck. ITC geht über die Bestimmung von Dissoziationskonstanten (K_d) hinaus und kann die Enthalpieänderungen und die Bindungsstöchiometrie der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen in der Lösungsphase liefern. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration mit markierungsfreien Molekülen durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den Bindungsereignissen auf, die bei jeder Titration erzeugt werden, so dass der Prozess die Bindung zwischen Makromolekülen und ihren kleinen Zielen empfindlich messen kann. Hier stellt der Artikel ein schrittweises Verfahren der ITC-Messung eines ausgewählten Aptamers mit einem kleinen Ziel, Tetracyclin, vor. Dieses Beispiel beweist die Vielseitigkeit der Technik und ihr Potenzial für andere Anwendungen.

Introduction

Aptamere sind ssDNA- oder RNA-Fragmente, die durch einen Evolutionsprozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu den gewünschten Zielen ^1,2 selektiert werden, die als fortgeschrittene Erkennungselemente oder chemische Antikörper 3,4,5 wirken können. Daher spielen die Bindungsaffinität und Spezifität von Aptameren an ihre Ziele eine entscheidende Rolle bei der Auswahl und Anwendung eines Aptamers, und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde für diese Charakterisierungszwecke häufig verwendet. Viele Ans....

Protocol

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Hauptschritte des ITC-Experiments zur Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins.

1. Vorbereitung der Proben

HINWEIS: Proben für ITC müssen im selben Puffer für Aptamer und Ligand vorbereitet werden, um eine Wärmefreisetzung durch das Mischen verschiedener Puffer aus der Probenzelle und der Spritze zu vermeiden. Dies wird typischerweise durch Dialyse aller Materialien in denselben Puffer erreicht. Der Puffer wird unter Verwendung eines Protokolls ausgetauscht, das vom Protokoll eines 3....

Results

ITC liefert eine genaue Dissoziationskonstante (K_d), die Bindungsstöchiometrie und die thermodynamischen Parameter von Zwei-Molekül-Wechselwirkungen⁶. In diesem Beispiel bindet das von Kim et al.9,11 ausgewählte Aptamer an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten von K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Interessanterweise wurde diese Bindung mit der Gleichgewichtsfiltrationsmethode und einem b.......

Discussion

Die hier vorgestellte Methode wurde gemäß den Anweisungen von TA Instruments modifiziert und reicht aus, um die Bindungsaffinität und Thermodynamik vieler ausgewählter Aptamere und Targets in unserem Zentrum zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten dieses Verfahrens gehören der Austausch des Puffers, um ein Ziel zu haben, das dem Liganden entspricht, das Ausführen von Proben mit geeigneten Parametern und das Finden des geeigneten Bindungsanpassungsmodells zur Analyse der Daten. Die kontinuierliche Aufzeichnung der W.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated	DNA Technologies, Inc		Die Sequenz stammt aus der Forschung von Gu, die Kd nicht mit ITC identifiziert hat (siehe Referenzen 8 und 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ L) System abgeschlossen– Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermes Titrationskalorimetriesystem
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calciumchlorid 1 M in wässriger Lösung, biotechnologische Qualität, steril
Zentrifuge	Eppendorf	5417R	Das Eppendorf 5417R ist unübertroffen in Sicherheit, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Sehr wartungsfreundlich mit einem bürstenlosen Motor, der sich mit bis zu 16.400 U/min und einem maximalen RZL von bis zu 25.000 x g dreht.
Komplette Entgasungsstation (110/230V)	TA Instruments	6326	Dieser Entgaser verfügt über eine eigenständige Rührplattform, eine Vakuumkammer, einen Vakuumanschluss, eine Temperaturregelung und einen elektronischen Timer für die ordnungsgemäße Probenvorbereitung.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7,5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spektralphotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spektralphotometer
Nanosep, Nanosep MF und NAB Zentrifugalgeräte	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrator
PBS pH 7,4	IBI Scientific	IB70165	Puffer mit Natriumphosphat, Natriumchlorid, Kaliumphosphat und Kaliumchlorid Ultrareine Qualität Steril filtriert mit 0,2 & Mikro; m Filter. Autoklaviert bei 121 Grad; C für mehr als 20 Minuten.
Posi-Click 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit großem Deckel	labForce (eine Marke von Thomas Scientific)	1149K01
Tetracyclin, Hydrochorid	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5