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Methodenartikel

Chemische Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung von implantatassoziierten Infektionen mit röntgenangeregter Lumineszenz-chemischer Bildgebung durch Gewebe

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DOI:

10.3791/64252

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30. September 2022

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1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Biological Sciences, Clemson University, 3Department of Bioengineering, Clemson University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur hochauflösenden optischen Detektion chemischer Informationen um implantierte medizinische Geräte mit röntgenangeregter lumineszenzchemischer Bildgebung (XELCI) vor. Dieses neuartige bildgebende Verfahren wird in unserem Labor entwickelt und ermöglicht die Untersuchung der Biochemie implantatassoziierter Infektionen.

Zusammenfassung

Mikrobielle Infektionen, die mit implantierbaren medizinischen Geräten in Verbindung gebracht werden, sind ein großes Problem für das Versagen der Frakturfixierung. Eine frühzeitige Diagnose einer solchen Infektion ermöglicht eine erfolgreiche Eradikation mit Antibiotika ohne zusätzliche Kosten für eine zweite Operation. In dieser Arbeit beschreiben wir XELCI als eine Technik mit hoher Röntgenauflösung, Implantatspezifität und chemischer Empfindlichkeit gegenüber nicht-invasiv abgebildeten chemischen Konzentrationen in der Nähe der Oberfläche implantierter medizinischer Geräte. Die Geräte sind mit chemisch berichtenden Oberflächen beschichtet. Diese chemisch ansprechende Oberfläche besteht aus zwei Schichten, die auf ein implantierbares medizinisches Gerät aufgetragen sind. eine pH-empfindliche Schicht (Bromthymolblau oder Bromkresolgrün eingearbeitetes Hydrogel), die zur Überwachung über eine rotlichtemittierende Szintillatorschicht (Gd2 O2S: Eu) aufgetragen wird. Ein fokussierter Röntgenstrahl bestrahlt einen Punkt auf dem Implantat, und das vom Szintillator erzeugte rote Licht (mit 620 nm und 700 nm Peaks) wird durch die Sensorschicht übertragen, wodurch sich das spektrale Verhältnis je nach pH-Wert ändert. Ein Bild wird erzeugt, indem der Röntgenstrahl über das Implantat abgetastet und das spektrale Verhältnis des Lichts, das das Gewebe durchdringt, Punkt für Punkt gemessen wird. Wir nutzten dieses bildgebende Verfahren zur Überwachung von implantatassoziierten Infektionen, die zuvor auf der Knochenoberfläche des Femurs mit einem modifizierten implantierbaren Plattensensor aufgetreten waren. Jetzt untersuchen wir pH-Veränderungen, die durch Infektionen des Tibia-Markstäbchens auftreten. Zwei verschiedene Arten von Markstäben werden in Studien mit Kaninchen vor dem Pilotprojekt verwendet, und wir haben gelernt, dass die XELCI-Technik verwendet werden kann, um chemische Veränderungen zu überwachen, die nicht nur auf der Knochenoberfläche, sondern auch im Inneren des Knochens auftreten. Dies ermöglicht eine nicht-invasive Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung und niedrigem lokalen pH-Hintergrund, um die Biochemie implantatassoziierter Infektionen zu untersuchen.

Einleitung

In den Vereinigten Staaten werden jährlich etwa 2 Millionen Frakturfixierungsgeräte eingesetzt, von denen 5 % bis 10 % zu implantatassoziierten Infektionen führen1. Diese Infektionen sind in späteren Stadien aufgrund der Heterogenität und Antibiotikaresistenz der Biofilme schwieriger mit Antibiotika zu behandeln 2,3. Wenn sie frühzeitig diagnostiziert werden, können Infektionen mit Antibiotika und chirurgischem Debridement behandelt werden, um zusätzliche medizinische Kosten für eine zweite Operation zu vermeiden, bei der die Hardware an der behandelten Frakturstelle ersetzt wird. Einfache Röntgenaufnahmen und andere fortschrittliche Röntgentechniken werden bei der Diagnose von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen, Pseudarthrosen und damit verbundenen Komplikationen eingesetzt. Obwohl diese Techniken häufig verwendet werden, um strukturelle Informationen über den umgebenden Knochen und das umgebende Gewebe am orthopädischen Implantat zu erhalten, sind sie nicht in der Lage, biochemische Informationen in der spezifischen Umgebung zu liefern. Daher haben wir eine neuartige röntgenangeregte lumineszenzchemische Bildgebungstechnik (XELCI) entwickelt, mit der biochemische Informationen nicht-invasiv am Implantatort abgebildet werden können. Die Diagnostik von orthopädischen Implantat-assoziierten Infektionen erfolgt in der Regel mit einem oder einer Kombination verschiedener Methoden. Klinische Beobachtungen (Schmerzen, Schwellungen, Rötungen, Wundausfluss etc.) deuten auf erste Anzeichen einer Infektion hin. Später werden radiologische und labortechnische Experimente durchgeführt, um das Versagen der Knochenheilungsprogression zu bestätigen und den pathogenen Erreger zu identifizieren 4,5. Zur besseren Darstellung des infizierten Implantats und der damit verbundenen Infektion werden nuklearmedizinische Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Radionukleotidmethoden wie die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt 6,7. CT und MRT sind vorteilhaft bei der Bestimmung von Knochennekrosen bzw. Weichteilanomalien, verursachen jedoch Interferenzen in geringem Abstand zu den Metallimplantaten8. Verschiedene Röntgenmethoden wie SPECT und PET in Kombination mit Radioisotopen-markierten Analyten als in vivo bildgebende Kontrastmittel werden häufig zur Diagnose der implantatassoziierten Osteomyelitiseingesetzt 2. Aktuelle Anwendungen kombinieren sowohl Daten aus CT-Scans als auch Markierungsdaten aus SPECT oder PET, um anatomische Informationen zu generieren9. Obwohl eine oder mehrere dieser Bildgebungsmodalitäten zur Unterstützung der Infektionsdiagnose verwendet werden, können sie die mit der Infektion verbundenen pH-Schwankungen nicht frühzeitig erkennen, um die Behandlungen mit Antibiotika einzuleiten und zusätzliche medizinische und chirurgische Kosten zu vermeiden.

Der Hauptvorteil des in dieser Studie verwendeten Bildgebungssystems zur Überwachung implantatassoziierter Infektionen besteht darin, dass es biochemische Informationen über die Mikroumgebung des Biofilms mit einer spektralen Referenz aufdecken kann. Obwohl das Hauptaugenmerk auf der Bildgebung und Kartierung des pH-Werts an der infizierten Stelle liegt, kann diese Methode geändert werden, um andere Biomarker zu überwachen, die spezifisch für implantatassoziierte Infektionen sind. XELCI ermöglicht es somit, die Pathophysiologie der Infektion zu verstehen. Die hochauflösende Bildgebung ermöglicht es, die Heterogenität während des Wachstums der Infektion abzubilden. Der pH-Wert an der Oberfläche, an der die Biofilmbildung stattfindet, ist sehr wichtig für das Verständnis biochemischer Veränderungen. Auch andere Veränderungen der Mikroumgebung können aufgrund von antibiotikabedingten Stressreaktionen von Bakterien auftreten10,11. Durch oberflächenspezifische und räumlich hochauflösende Bildgebung kann die antibiotische Wirkung auf die Biofilm-Mikroumgebung überwacht werden. Die Technik kann auch verwendet werden, um die Biofilmumgebung für gezielte Experimente zur Verabreichung von Medikamenten zu untersuchen. Wir können die gezielte Freisetzung von Medikamenten mit niedrigem pH-Wert oder die Erhöhung des pH-Werts untersuchen, um sie anfälliger für die Arbeit bei einem höheren pH-Wert zu machen.

Drei spezifische Merkmale dieses Bildgebungsverfahrens sind die Röntgenauflösung, die Spezifität der Implantatoberfläche und die chemische Empfindlichkeit (Abbildung 1A). Diese Merkmale können mit den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren zur Bildgebung orthopädischer implantatbedingter Infektionen verglichen werden (Abbildung 1B). Nach der Bestrahlung mit Röntgenstrahlen erzeugen Phosphorpartikel, die auf der Implantatoberfläche beschichtet sind, rotes Licht und Nah-IR-Licht (NIR), das einige Zentimeter Gewebe durchdringen kann (wenn auch mit einer gewissen Dämpfung)12,13. Tabelle 1 zeigt einige der Merkmale des entwickelten Bildgebungssystems im Vergleich zu anderen Methoden, die zur Messung des pH-Werts in Biofilmen oder durch Gewebe verwendet wurden.

XELCI ist ein neuartiges bildgebendes Verfahren zur optischen Erfassung chemischer Informationen mit hoher räumlicher Auflösung in der Nähe von implantierten medizinischen Geräten in Kombination mit Röntgenanregung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Hier wird die selektive Anregung und optische Detektion von röntgenerregbaren Phosphorpartikeln genutzt. Das Implantat ist mit zwei Schichten beschichtet, einer pH-empfindlichen, farbstoffinkorporierten Polymerschicht über einer Schicht aus Szintillatorpartikeln. Sobald eine Sequenz von fokussierten Röntgenstrahlen das Implantat bestrahlt, erzeugt die Szintillatorschicht sichtbares Licht (620 nm und 700 nm). Dieses erzeugte Licht durchdringt die pH-empfindliche Schicht und moduliert das Lumineszenzspektrum in Abhängigkeit vom pH-Wert der Umgebung. Ein niedriger pH-Wert wird im Allgemeinen mit Infektionen und Biofilmbildung in Verbindung gebracht. Mit fortschreitender Infektion ändert sich der pH-Wert von physiologischem pH-Wert (pH 7,2) zu sauer (weniger als pH 7), und der pH-Farbstoff im Sensor ändert seine Farbe und damit seine Absorption. Die Variation des Lumineszenzspektrums ist in Abbildung 2E für den pH-Farbstoff Bromocresolgrün bei pH 7 und pH 4 dargestellt. Das durch Gewebe und Knochen durchgelassene Licht wird gesammelt und das spektrale Verhältnis bestimmt den pH-Wert. Um ein pH-Bild zu erzeugen, bestrahlt der fokussierte Röntgenstrahl jeweils einen Punkt in der Szintillatorfolie und tastet den Strahl Punkt für Punkt über die Probe ab. Zuvor wurde diese Technik angewendet, um pH-Variationen auf der Oberfläche der orthopädischen Implantate darzustellen14,15 und wurde getestet, um pH-Variationen im Markkanal durch Knochen und Gewebe zu überwachen.

Abbildung 3 unten zeigt eine schematische Darstellung des Bildgebungssystems. Grundlegende Komponenten des Bildgebungssystems sind die Röntgenanregungsquelle mit Polykapillaroptik, ein einteiliger Acryl-Lichtleiter, der mit zwei Photomultiplier-Röhren verbunden ist, der motorisierte x-, y- und z-Tisch (30 cm x 15 cm x 6 cm Verfahrweg) und der zur Datenerfassung angeschlossene Computer. Die Röntgenquelle, der x,y,z-Tisch und die Sammeloptik (Winkel, Lichtleiter, Photomultiplier-Röhren (PMTs)) befinden sich im röntgensicheren Gehäuse, während der Röntgencontroller, die Stromquelle für PMTs, der Funktionsgenerator, der mit der Datenerfassungsplatine (DAQ) und dem Computer verbunden ist, draußen untergebracht sind. Als Verriegelung dient ein Druckknopf, Schließerschalter, der zwischen dem Gehäuse und der Vorderseite der Tür platziert ist. Wenn die Tür nicht vollständig geschlossen ist (der Verriegelungsschalter ist geöffnet), schaltet sich die Röntgenquelle nicht ein und schaltet die Röntgenquelle automatisch aus, wenn sie während des Betriebs geöffnet wird. Die Motoren können einen kontinuierlichen Scan durchführen und an einen beliebigen diskreten Ort bewegt werden. Die Scangeschwindigkeit für die y-Achse beträgt in der Regel 1-5 mm/s, während die Schrittweite auf der x-Achse typischerweise von 150-2000 μm gewählt werden kann. Die Parameter können je nach benötigter räumlicher Auflösung gewählt werden. Gleichmäßige Belichtungszeiten werden durch eine konstante Geschwindigkeit während eines kontinuierlichen Scans bestätigt.

Sobald der fokussierte Röntgenstrahl auf die Röntgenlumineszenzpartikel bestrahlt wird, durchdringt das erzeugte Licht den pH-empfindlichen Film, indem es das Licht in Abhängigkeit vom umgebenden pH-Wert moduliert. Das transmittierte Licht interagiert (streut und absorbiert teilweise) mit einem Gewebe, während die Lichtabschwächung durch Streuung und Absorption mit zunehmender Gewebedicke zunimmt. Die Optik der Kollektion umfasst einen einteiligen, gegabelten Acryl-Lichtleiter, der zu Beginn mit einem reflektierenden Aluminiumbogen (mit 90°-Biegung und polierter reflektierender Innenfläche) ausgestattet ist. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das Licht kollimiert wird, sobald das Licht den Lichtleiter erreicht. Diese Ergänzungen verbesserten die Effizienz der Lichtsammlung erheblich. Für weitere Details zeigt Abbildung 4 die Maschinenzeichnungen des Bogens und des Lichtleiters. Der 90°-Bogen wurde aus Aluminium gefräst, die Innenfläche auf Hochglanz poliert und der Lichtleiter mit Acryl bearbeitet. Wir haben auch einen Breitband-Langpass-Blaulichtfilter (der 350-450 nm Licht blockiert) am Anfang des Ellbogens angebracht, um sicherzustellen, dass nur rotes Licht durchgelassen wird. Das Ende des einteiligen Acryl-Lichtleiters teilt sich in zwei Ströme, die zu zwei verschiedenen PMTs führen. Die PMTs sind in einer kleinen lichtdichten Metallbox eingeschlossen, die mit einem thermoelektrischen Kühler in Kontakt steht, um die PMTs auf ~5 °C abzukühlen. Am Anfang eines der PMTs ist ein Schmalbereichs-Langpassfilter (der 570-640 nm Licht blockiert und 640-740 nm Licht durchlässt) angebracht, um nur das 700 nm Licht zu messen. Daher können die Lichtverhältnisse von 620 nm und 700 nm separat berechnet werden. Die PMTs sind im Photonenzählmodus aufgebaut und erzeugen für jedes detektierte Photon Transistor-Transistor-Logik-Impulse (TTL). Ein Datenerfassungssystem zählt die Impulse (Sättigungspunkt 20 Millionen Impulse pro Sekunde) über USB-Kommunikation. Nach der Verarbeitung der Daten werden zwei separate Intensitätskarten erstellt, und unter Berücksichtigung des Verhältnisses der Signalwellenlängenintensität (620 nm) zur Referenzwellenlängenintensität (700 nm) wird ein endgültiges Bild erstellt. Dieses Verhältnis erklärt Unterschiede in der Gesamtlichtsammeleffizienz, die stark von der Position der Sammeloptik, der Röntgenbestrahlungsintensität und der Gewebedicke abhängen. Darüber hinaus ist eine räumlich getrennte Referenzregion ohne pH-Indikatorfarbstoff für die spektrale Verzerrung durch wellenlängenabhängige Gewebepenetration verantwortlich. Eine grafikbasierte Programmiersprache wird zur Steuerung des Bildgebungssystems verwendet, und ein grundlegendes Flussdiagramm des Vorgangs ist unten dargestellt. Der Bildgebungsaufbau ist mit Ausnahme des Computers, des Röntgencontrollers und der Datenerfassungseinheit in einem sicheren Röntgengehäuse untergebracht, um die Strahlenbelastung zu minimieren.

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Protokoll

Dieses Verfahren folgt den Tierverwendungsprotokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Clemson University genehmigt wurden. Die Experimente werden gemäß dem Clemson University Biosafety Committee (IBC) und dem Radiation Safety Committee (RSC) sowie unter Einhaltung der einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

HINWEIS: Ein Flussdiagramm zum Abschließen eines XELCI-Scans ist unten in Abbildung 5 dargestellt, gefolgt von einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Beschreibung des Bildgebungsverfahrens.

1. Initialisieren Sie das System und erstellen Sie ein einfaches Röntgenbild

  1. Schalten Sie den PMT-Kühler ein, es dauert normalerweise ~15 Minuten, bis der Sollwert (z. B. 4 °C) erreicht ist. Führen Sie die restlichen Initialisierungsschritte aus, bevor Sie die PMTs einschalten.
  2. Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems. Das Steuerungssoftwareprogramm kommuniziert und initialisiert den motorisierten Tisch der x-y-z-Achse. Bewegen Sie die x-Achse und die y-Achse des Tisches in die gewünschte Ausgangsposition.
  3. Platzieren Sie die Probe auf dem beweglichen x-y-z-Tisch. Positionieren Sie die Probenhöhe (z-Achse) so, dass sich das Radiolumineszenzgerät 5-5,5 cm unter der Polykapillarfokusoptik befindet, indem Sie die Röntgenquelle und/oder den Tisch anheben oder absenken. Positionieren Sie die Probe außerdem in der x-y-Ebene mit Hilfe der Lasertraverse (zwei rote linienförmige Laserpointer, die an der Röntgenfokussierkapillare befestigt und im 90°-Winkel zueinander positioniert sind, so dass sich die Linien dort schneiden, wo das Röntgenlicht fokussiert wird). Schalten Sie die Laser aus, bevor Röntgenstrahlen und PMTs eingeschaltet werden.
  4. Befestigen Sie die Drucktastenverriegelung an der Vordertür des Bildgebungsgehäuses. Schalten Sie die Strahlquelle ein. Entfernen Sie die Fokussieroptik, um ein einfaches Röntgenbild der Probe zu erhalten.
  5. Öffnen Sie die Röntgensteuerungssoftware und stellen Sie die Röntgenleistung ein (durch Einstellen von Spannung und Strom). Öffnen Sie den Röntgenverschluss mit der Röntgensteuerungssoftware.
  6. Öffnen Sie die Software für die Röntgenkamera. Drücken Sie die Belichtungstaste, um das einfache Röntgenbild aufzunehmen. Schalten Sie die Belichtung aus und schalten Sie die Röntgenstrahlung aus.
    Anmerkungen: Bewegen Sie die Probe bei Bedarf, um die Probenposition zu verbessern, oder nehmen Sie eine Reihe von Röntgenbildern an verschiedenen Positionen auf, damit sie zusammengestellt werden können, um eine größere Röntgenansicht zu erhalten. Man kann auch eine Röntgenaufnahme auf einem separaten System machen, aber die Koregistrierung zwischen XELCI und Röntgenaufnahmen wird schwieriger, wenn sich die Probe bewegt.
  7. Öffnen Sie die Gehäuseklappe.

2. Führen Sie optional einen Hintergrundscan bei ausgeschaltetem Röntgenbild durch

  1. Schließen Sie die Polykapillaroptik wieder an die Röntgenquelle an.
  2. Schließen Sie das Gehäuse und sichern Sie die Verriegelung. Schalten Sie das PMT-Netzteil ein.
    Anmerkungen: Das PMT-Netzteil sollte immer ausgeschaltet werden, wenn die Tür geöffnet ist oder kurz vor dem Öffnen steht, um eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden.
  3. Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems und geben Sie die Schrittweite, die Scangeschwindigkeit und den Scanbereich an. Sobald alle Parameter eingestellt sind, starten Sie den Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken.
    HINWEIS: Bei einem Scan mit hoher Auflösung beträgt die Schrittweite 1000 μm und bei einem Scan mit niedriger Auflösung 250 μm. Die Scangeschwindigkeit kann von 5 mm/s bis 1 mm/s gewählt werden. Die Fläche des Scans hängt von den Abmessungen der Probe ab.
  4. Führen Sie einen Hintergrundscan bei ausgeschaltetem Röntgenbild durch, um die Dunkelzählung von allen im Gehäuse vorhandenen Lichtern außer der Probe zu bestimmen.

3. Führen Sie einen Probenscan mit eingeschaltetem Röntgenbild durch

  1. Stellen Sie sicher, dass sich die Probe mit der Lasertraverse noch in der richtigen Position befindet, um den Scan zu starten.
  2. Schließen Sie das Gehäuse und sichern Sie die Verriegelung. Wenn die PMTs ausgeschaltet sind (z. B. vor dem Öffnen der Tür ausgeschaltet), schalten Sie die PMT-Stromversorgung ein.
  3. Öffnen Sie die Steuerungssoftware des Bildgebungssystems. Geben Sie die Werte für Schrittweite, Scangeschwindigkeit und Scanbereich ein. Sobald alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um den Scan zu starten.
    HINWEIS: Bei einem Scan mit hoher Auflösung beträgt die Schrittweite 1000 μm und bei einem Scan mit niedriger Auflösung 250 μm. Die Scangeschwindigkeit kann von 5 mm/s bis 1 mm/s gewählt werden. Die Fläche des Scans hängt von den Abmessungen der Probe ab.
  4. Erstellen Sie den Scan für die Probe mit eingeschaltetem Röntgenbild.
  5. Führen Sie zunächst den Scan mit niedriger Auflösung mit größeren Schrittweiten und höherer Scangeschwindigkeit durch, um ein vorläufiges Bild des Ziels zu erhalten. Nachdem Sie einen Scan mit niedriger Auflösung des gewünschten Bereichs der Probe erhalten haben, erhalten Sie den Scan mit höherer Auflösung und kleinerer Schrittweite und geringerer Scangeschwindigkeit.
  6. Schalten Sie die PMT-Stromversorgung aus, bevor Sie die Tür öffnen.

4. Erzeugen des Bildes

  1. Überprüfen Sie, ob der aktuelle Scan den Interessenbereich des Ziels abbildet. Wenn nicht, stoppen Sie den aktuellen Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp klicken.
  2. Passen Sie die Scanpositionen in der Steuerungssoftware erneut an und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Ausführen .
    HINWEIS: Die y-Achse wird ab der ersten Zeile des Scans kontinuierlich aufgezeichnet. Während der Durchführung eines Scans wird die Anzahl der Zählungen pro Wellenlänge und Zeit seit der letzten aktualisierten Motorposition aufgezeichnet. Die aufgezeichnete Zeit berücksichtigt alle Änderungen der Motordrehzahl und damit die Belichtungszeit. Für jedes Pixel wird die Anzahl pro Sekunde normalisiert. Der Motor der y-Achse tastet das Ende der aktuellen Reihe der y-Achse ab, und der Motor kehrt in die Ausgangsposition zurück. Dann erhöht der Motor der x-Achse seine Position um eine vom Benutzer definierte Schrittweite und tastet die zweite Reihe der y-Achse ab. Dieser Vorgang wird so lange getaktet, bis der Motor der x-Achse die vorgegebene Breite für die x-Richtung erreicht. Der Benutzer kann die Scangröße, die Motordrehzahl und die Startpositionen des Motors steuern. Die Schrittweite bestimmt die Größe der Pixel im endgültigen Bild der y-Achse.

5. Kultivierung von Bakterien für die Bildgebung unter sterilen Bedingungen (wenn bakteriell gewachsene Sensoren abgebildet werden)

  1. Um eine frische Kultur von Staphylococcus aureus 1945 (ATCC 25923) herzustellen, verwenden Sie eine Kolonie von einer TSA-Platte (Tryptic Soja-Agar), die innerhalb von 1 Woche gestreift wurde, um 5 ml sterile Tryptische Sojabrühe (TSB) zu beimpfen.
  2. Schütteln Sie die Bakterienkultur bei 37 °C für 16-18 h bis zur stationären Phase leicht.
  3. Als nächstes pelletieren Sie die Kultur aus dem TSB durch Zentrifugation bei 4000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und waschen Sie das Pellet zweimal mit Phosphatpufferlösung (PBS) und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml sterilem PBS.
  4. Quantifizieren Sie die Bakterienkonzentration anhand der optischen Dichte bei 600 nm unter Verwendung des linearen Bereichs, d. h. des OD-Bereichs, in dem das Beer-Lambert-Gesetz verifiziert wird (OD = kN; k ist ein Koeffizient relativ zur molekularen Extinktion und der Länge des Strahlengangs, N ist die Bakterienkonzentration)16. Anschließend wird die Probe mit sterilem PBS auf10 5 Zellen/ml verdünnt.
  5. Sterilisieren Sie den Tryptic Soja-Agar (TSA) durch Autoklavieren und kühlen Sie ihn dann durch Mischen ab, bis die Temperatur 45 °C erreicht. Impfen Sie die Bakterien in die TSA.
  6. Pipettieren Sie die verdünnte Bakterienkultur (100 μl) auf die Oberfläche des implantierbaren Sensors.
    HINWEIS: Die Implantate wurden durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 5 Minuten sterilisiert und in sterilem PBS gelagert.
  7. Pipettieren Sie 100 μl ungeimpftes TSA über ein anderes steriles Implantat als Kontrolle
  8. Fügen Sie dem implantierbaren Sensor zusätzlich 100 μl ungeimpftes TSA hinzu, bevor er vor der Implantation 48 h lang bei 37 °C inkubiert wird.

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Ergebnisse

Als Vorstudie haben wir den intramedullären Stäbchensensor in einer aufgebohrten Tibia eines Kaninchenkadaversabgebildet 14. Der Sensor verfügt über drei verschiedene Bereiche: den Referenzbereich, den pH-8-Bereich (basischer pH-Wert) und den pH-4-Bereich (saurer pH-Wert). Der Referenzbereich ist das Szintillatorpartikel (Gd 2 O2S:Eu), das in eine aufgeraute Epoxidfolie eingearbeitet ist. Die charakteristischen sauren und basischen pH-Bereiche repräsentieren infizierte und ni...

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Diskussion

Um orthopädische Implantat-assoziierte Infektionen frühzeitig erkennen und untersuchen zu können, um Komplikationen durch Osteomyelitis und sekundäre chirurgische Eingriffe zu vermeiden, haben wir XELCI als neuartiges, funktionelles Bildgebungsverfahren eingeführt. Sie ist vergleichbar mit den derzeit verfügbaren Techniken zur pH-Überwachung durch Gewebe.

Bei der Positionierung der Probe für die Bildgebung verwenden wir eine Lasertraverse, die mit einer Polykapillar-Fokussieroptik verbunden is...

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Offenlegungen

Die Autoren machen keine Interessenkonflikte geltend.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei der Clemson University, COMSET und Clemson SC BioCRAFT. Das XELCI-Setup wurde zunächst mit Mitteln von NSF CAREER CHE 12255535 und später von NIH NIAMS R01 AR070305-01 entwickelt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
90-Grad-WinkelHergestellt im Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA
Bromo Cresol GreenSigma-Aldrich45ZW10
Bromo Thymol BlueSigma76-59-5
ElectraCOOL Fortschrittliche thermoelektrische KühlplattePollock Industries, White River, VT, USATCP 50
EthanolBeantown Chemical, 9 Sagamore Park Road
Hudson, NH 03051		64-17-5
Gadoliniumoxysulfid-Europium-dotierte (Gd2O2S:Eu) Partikel-~8,0 µ mPhosphor Technologies Inc., Stevenage, EnglandUKL63/N-R1
LabVIEWNational Instruments, Austin, TX
Motorisiertes lineares vertikales Tischmodell (für die Z-Achse)Motion Control, Smithtown, NY, USAAT10-60
National Instruments c-DAQ 9171National Instruments, Austin, TXNI cDAQ™-9171
Einteiliges Acryllicht LeitfadenHergestellt im Hilltop Technology Laboratory, 51 Parker, Irvine, CA
pH 4 PufferVWR BDH ChemicalsBDH5024
pH 8 PufferVWR BDH ChemicalsBDH5060
Phosphate Buffer SolutionMP Biomedicals, Irvine, CA. USA2810305
Photomultiplier Tubes Modell P25PC-16SensTech, Surrey, UKModell P25PC-16
Staphylococcus aureus subsp. aureus RosenbachAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAATCC 25923
Tryptic Soja AgarTeknova, Hollister, CA, USA  T0520
Tryptische SojabrüheEMD Millipore, Burlington, MA, USA1005255000
Röntgenquelle-iMOXSInstitute for Scientific Instruments GmbH, Berlin, Deutschland
X,Y motorisierter Tisch-30 cm x 15 cm x 6 cm VerfahrwegThorlabs Inc., Newton, NJ, USALTS300 und LTS150

Referenzen

  1. Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infection and infection resistant materials: A mini review. International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).
  2. Renick, P., Tang, L. Device-related infections. Racing for the Surface. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).
  3. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  4. Metsemakers, W. J., et al. Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group. Injury. 49 (3), 505-510 (2018).
  5. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).
  6. Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions. Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).
  7. vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review. Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).
  8. Trampuz, A., Zimmerli, W. Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices. Injury. 37 (2), 59-66 (2006).
  9. Ady, J., Fong, Y. Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes. Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).
  10. Truong-Bolduc, Q. C., et al. Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).
  11. Hengge-Aronis, R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).
  12. Gao, R., Yan, D. Molecular phosphors for x-ray detection. Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).
  13. Gao, R., Fang, X., Yan, D. Recent developments in stimuli-responsive luminescent films. Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).
  14. Uzair, U., et al. Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).
  15. Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging. ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).
  16. Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).
  17. Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. Review of thermal properties of biological tissues. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).
  18. Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).
  19. Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy. American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).
  20. Ryan, S. G., et al. Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse. Scientific Reports. 9 (1), 19223(2019).
  21. Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).
  22. Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469(2012).
  23. Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient. Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).
  24. Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes. Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).
  25. Xiao, Y., et al. In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes. Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).
  26. Nakata, E., et al. A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives. RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).
  27. Villano, D., et al. A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH. Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).

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