Method Article

Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Abstract

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Die Fähigkeit von Zellen, auf externe Signale zu reagieren, ist für die Zellentwicklung, das Wachstum und das Überleben unerlässlich. Um auf ein Signal aus der Umgebung reagieren zu können, muss eine Zelle in der Lage sein, es zu erkennen und zu verarbeiten. Diese Aufgabe beruht hauptsächlich auf der Funktion von Membranrezeptoren, deren Aufgabe es ist, Signale in die biochemische Sprache der Zelle umzuwandeln. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranrezeptorproteinen beim Menschen. Unter den GPCRs sind metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) eine einzigartige Unterklasse, die als obligate Dimere fungieren und eine große extrazelluläre Domäne besitzen, die die Ligandenbindungsstelle enthält. Jüngste Fortschritte in Strukturstudien von mGluRs haben das Verständnis ihres Aktivierungsprozesses verbessert. Die Ausbreitung großräumiger Konformationsänderungen durch mGluRs während der Aktivierung und Modulation ist jedoch kaum verstanden. Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der Strukturdynamik von Biomolekülen auf Einzelproteinebene. Um den dynamischen Prozess der mGluR2-Aktivierung zu visualisieren, wurden fluoreszierende Konformationssensoren auf Basis des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren (UAA) entwickelt, die eine ortsspezifische Proteinmarkierung ohne Störung der nativen Struktur von Rezeptoren ermöglichten. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie diese Experimente durchzuführen sind, einschließlich des neuartigen UAA-Markierungsansatzes, der Probenvorbereitung und der smFRET-Datenerfassung und -analyse. Diese Strategien sind verallgemeinerbar und können erweitert werden, um die Konformationsdynamik einer Vielzahl von Membranproteinen zu untersuchen.

Introduction

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Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptorenab 1. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur2. Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen3. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung z....

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Protocol

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Der gesamte Workflow des Protokolls wird in Abbildung 1 beschrieben.

1. Vorbereitung der Probenkammer

  1. Gleit- und Deckglasreinigung
    HINWEIS: Diese Schritte zielen darauf ab, die Oberflächen der Objektträger sowie die Deckgläser zu reinigen und für die Aminosilanisierung vorzubereiten. Eine kritische Voraussetzung für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimenten an oberflächengebundenen Molekülen ist eine passivierte Oberfläche. Die zuverlässigste und reproduzierbarste Passivierungstechnik besteht darin, inerte Polymerketten kovalent als dichte Schicht an die Glasoberfläche anzubrin....

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Results

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Expression und fluoreszierende Markierung des UAA-basierten FRET-Sensors
Hier werden beispielhafte Ergebnisse der Insertion und Fluoreszenzmarkierung einer LF (AZP) innerhalb der CRD von mGluR2 (548UAA) diskutiert11. Wie bereits erwähnt, ist zum Einfügen von AZP in mGluR2 die Koexpression der technischen translationalen Maschinerie erforderlich, die eine modifizierte tRNA-Synthetase und komplementäre tRNA (pIRE4-Azi) und mGluR2 mit einem bernsteinfarbenen Codon an Position 548 .......

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Discussion

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GPCRs sind Proteine, die auf der Zellmembran arbeiten, um die Signaltransduktion einzuleiten. Viele GPCRs bestehen aus mehreren Domänen, wobei die Signalisierung von der kooperativen Interaktion zwischen den Domänen abhängt. Um die Eigenschaften dieser Membranrezeptoren zu modulieren, ist es wichtig, das dynamische Verhalten der verschiedenen Domänen zu verstehen. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine Fluoreszenztechnik, die die Messung von Proteinkonformation und -dynamik in Echtzeit ermögl.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Wir danken den Mitgliedern des Reza Vafabakhsh Labors für die Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01GM140272 (an R.V.), vom Searle Leadership Fund for the Life Sciences an der Northwestern University und vom Chicago Biomedical Consortium mit Unterstützung der Searle Funds des Chicago Community Trust (an R.V.) unterstützt. B.W.L. wurde vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-Natrium-L-AscorbatSigma AldrichKatze # 11140-250G
4-azido-L-phenylalaninChem-Impex InternationalKatze # 06162
548UAALiauw et al. 2021Transfiziertes Konstrukt
EssigsäureFisher Chemical64-19-7
AcetonFisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279Software, Algorithmus
Aminoguanidin (Hydrochlorid)Cayman Chemical81530
AminosilanAldrich919-30-2
Bad Ultraschallgerät 2,8 lFisher ScientificUltraschallbad 2,8 l
Biotin-PEGLaysan Bio IncArtikel# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Chemistry Tools1237-500
Kupfer (II)-sulfatSigma AldrichCat # 451657-10G
DeckglasVWR16004-306Probenkammer
Cy3 Alkin-Click-Chemie-WerkzeugeTA117-5
Cy5 Alkin-Click-Chemie-WerkzeugeTA116-5
DDMAnatraceTeil# D310 1 GMReinigungsmittel
DDM-CHS (10:1)AnatraceTeil# D310-CH210 1 MLReinigungsmittel mit Cholecterol
Definiertes fötales RinderserumThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockKerbfilter
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897UKamera
ET542lpChromaLangpass-Emissionsfilter
FF640-FDi01SemrockEmission dichroitischer Filter
FLAG-Tag AntikörperGenscriptA01429
Fluoreszierende PerleInvitrogen T7279TetraSpeck MikrosphärenKugel Kugel
GlasobjektträgerFisherfinest12-544-4Probenkammer
GlutamatSigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001Zelllinie
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
BildsplitterOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
LaserOxxius4-Linien-Laserkombinierer
Lipofectamine 3000 TransfektionsreagenzThermo Fisher ScientificL3000015Transfektionsreagenz
MethanolFisher Chemical67-56-1
MikroskopOlympusOlympus IX83
Milli-Q WasserBarnsteadWasser Deionisierer
m-PEGLaysan Bio IncArtikel# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635SemrockDichroitischer Spiegel
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091Reduziertes Serummedium
OptiMEM/Reduziertes SerummediumThermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212Datenanalyse- und Grafiksoftware
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
pIRE4-AziAddgenePlasmid # 105829Transfiziertes Konstrukt
Poly-L-LysinhydrobromidSigma AldrichCat # P2636
Protocatechusäure (PCA)HWI-Gruppe99-50-3
smCamera (Version 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/Kamera Software
NatriumbicarbonatFisherBioReagents144-55-8
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma1310-73-2
SpritzenfilterWhatman UNIFLOCat#9914-2502Flüssigkeitsfiltration
TroloxSigma53188-07

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

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Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

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