Method Article

Entwicklung und Erprobung von methylierten nanostrukturierten Dipeptiden, die die Aktivität der Src-Kinase in vitro für Anti-Krebs-Anwendungen hemmen

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Protokoll zum Entwerfen und Testen von Dipeptiden vorgestellt, die die Aktivität von Src-Kinase-Enzymen unter Verwendung von azellulären und zellulären Assays für Anti-Krebs-Anwendungen hemmen können. Die hier formulierten Peptide (W-RCH3, WCH3-R CH3 und W-R(CH3)2) hemmten die Src-Kinase mit IC50-Werten von 510 nM, 916 nM bzw. 1 μM.

Abstract

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Mit dem Ziel, eine neuartige Krebsbehandlung zu entwickeln, wurden hier sieben Dipeptide entwickelt, die methyliertes Tryptophan und/oder methyliertes Arginin enthielten und mittels Fmoc-Festphasenpeptidsynthese hergestellt wurden. Die Überexpression des Src-Tyrosinkinase-Enzyms wurde mit der Entwicklung verschiedener Krebsarten in Verbindung gebracht. Dipeptide, die unnatürliche Aminosäuren wie methyliertes Arginin (RCH3), dimethyliertes Arginin (R(CH3)2) und/oder methylierte Tryptophan (WCH3)-Reste enthalten, haben bereits gezeigt, dass sie die Src-Kinase hemmen. In dieser Studie wurden drei solcher Dipeptide, W-RCH3, WCH3-R CH3 und W-R(CH3)2, mit azellulären Assays getestet und es wurde festgestellt, dass sie IC50-Werte (die Konzentration, bei der eine 50%ige Hemmung auftritt) von 510 nM, 916 nM bzw. 1 μM aufwiesen. Diese Werte waren vergleichbar mit denen, die für zyklische Penta- bis Nano-W-R-Peptide ([W-R]5-[W-R]9) erhalten wurden, die in früheren Studien synthetisiert wurden. Die unmethylierten Versionen der Dipeptide zeigten jedoch keine inhibitorische Aktivität gegen die Src-Kinase. Alle diese Dipeptide (50 μM) zeigten nach einer Inkubation von bis zu 72 Stunden mit drei verschiedenen Krebszelllinien, darunter Leukämie (CCRF-CEM), Brustadenokarzinom (MDA-MB-231) und Ovarialadenokarzinom (SK-OV-3), keine Zytotoxizität, was auf eine begrenzte Permeabilität der Peptide durch die Zellmembran hinweist. Daher sind weitere Studien erforderlich, um die Permeabilität dieser Peptide für Antikrebsanwendungen zu verbessern, z. B. durch die Verwendung eines Peptidträgers oder eine zusätzliche Peptidfunktionalisierung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein Protokoll zur Synthese und zum Test von Peptiden liefert, die die Src-Kinase-Aktivität hemmen und somit eine vielversprechende krebshemmende Wirkung besitzen, wie mit azellulären und zellulären Assays gezeigt wurde.

Introduction

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Krebs wird durch das abnormale Wachstum normaler Zellen verursacht und ist eine der tödlichsten Krankheiten auf der ganzen Welt. Diese abnormalen Zellen breiten sich durch einen Prozess namens Metastasierung auf verschiedene Organe im Körper aus. Die häufigste Krebsform ist Brustkrebs, bei der im Jahr 2020 2,26 Millionen Menschen auftraten. Darüber hinaus gab es im Jahr 2020 rund 1,80 Millionen Todesfälle aufgrund von Lungenkrebs1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation starben im Jahr 2020 rund 10 Millionen Menschen an Krebs2. Krebszellen unterscheiden sich von normalen Zellen dadurch, dass sie bestimmte Enzyme, wie zum Beispiel Protein-Tyrosinkinasen (PTKs), überexprimieren. Das National Cancer Institute definiert Kinasen als Enzyme, die in der Lage sind, andere Proteine oder Zucker zu phosphorylieren3. Das Wissen um die regulatorische Funktion von Kinasen kann die Entwicklung wirksamer Krebsmedikamente erleichtern. Zum Beispiel katalysieren PTKs die Phosphorylierung anderer Proteine oder Zucker, und als Folge wird ATP durch den Verlust einer Phosphatgruppe in ADP umgewandelt. Insgesamt 80% der Onkogene und Protooncogene kodieren für PTKs4. Src-Kinasen sind eine Familie von Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen, darunter Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes und Yrk, die in Krebszellen, insbesondere bei Brustkrebs, überexprimiert werden 5,6. Src-Tyrosinkinasen sind mit Mitogenese, Differenzierung, T-Zell-Aktivierung und Zelltransformation assoziiert. Src hilft bei der Invasion und Metastasierung von Krebszellen aufgrund seiner Fähigkeit, die Adhäsion von Krebszellen zu reduzieren. Es gibt fünf verschiedene Domänen in der Src-Kinase, die von den N- bis C-Terminen geordnet sind: Fettsäuredomäne, Src-Homologie-3-Domäne (SH3), Src-Homologie-2-Domäne (SH2), Tyrosinkinase-Domäne (SH1) und C-terminale regulatorische Domäne7.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Die Zieldomänen im Src-Kinase-Enzym, einschließlich einer SH3-Domäne, einer SH2-Domäne, einer Kinase-Domäne (SH1) und eines kurzen C-terminalen regulatorischen Segments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Kinasedomäne SH1 wird bei der Entwicklung von Src-Kinase-Inhibitoren am häufigsten ins Visier genommen, da sie zwei konservierte Stellen für ATP und Substratbindung enthält (Abbildung 1). Wenn die Aminosäuresequenz der Kinasedomäne bekannt ist, kann das Substrat auch als Ziel verwendet werden, um eine Verbindung zu entwerfen, die die Substratbindung an die Src-Kinase8 nachahmt. Darüber hinaus können andere Sites wie die SH3- und SH2-Domains als Ziele verwendet werden. Im Vergleich zu anderen Chemotherapeutika weisen Kinase-Inhibitoren eine geringere Toxizität und eine höhere Wirksamkeitauf 9. Mit Stand September 2021 gibt es 73 kleine Moleküle, die als Kinase-Inhibitoren wirken und von der FDAzugelassen wurden 10. Imatinib ist ein Beispiel für ein Krebsmedikament, das selektiv die Aktivität der Tyrosinkinase hemmt; Einige Patienten sind jedoch aufgrund des Auftretens einer Punktmutation in der Kinasedomäne11 resistent gegen das Medikament. AstraZeneca brachte Saracatinib auf den Markt, ein Medikament, das die Src-Familie der Tyrosinkinasen mit einemIC-50-Wert (die Konzentration, bei der eine 50%ige Hemmung auftritt) von 2,7 nM hemmt, aber es wurde in Phase-2-Studien ausgeschlossen12. Von den 52 PTK-Inhibitoren, die Anfang 2020 von der US-amerikanischen FDA zugelassen wurden13, blockieren nur 28 Zielrezeptor-PTKs, 11 blockieren das Nicht-Rezeptor-PTK, 11 hemmen Protein-Serin/Threonin-Proteinkinasen und zwei blockieren MEK1/213. Das zunehmende Forschungsinteresse in der Onkologie wird die Entdeckung von Kinase-Inhibitoren als potenzielle Krebsmedikamente weiter vorantreiben. Bisher wurden jedoch nur 50 von 500 Proteinkinasen für die Behandlung ins Visier genommen; Daher wird erwartet, dass in naher Zukunft eine größere Anzahl von Kinasen für die Arzneimittelentwicklung untersucht wird14. Darüber hinaus besteht die Notwendigkeit, Kinase-Inhibitoren zu entdecken, um noch nicht identifizierte Kinase-Mutationen zu erforschen, die zu Krebs führen.

Daher zielte diese Studie darauf ab, Peptide zu entwickeln, die als Inhibitoren für die Src-Familie verwendet werden können und auf die ATP-Bindungsstelle abzielen, da sie als konservierte Stelle zwischen verschiedenen Kinasen dienen kann. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Dipeptiden, die methyliertes Tryptophan und/oder methyliertes Arginin enthalten, synthetisiert und auf ihre synergistische Fähigkeit zur Hemmung der Src-Kinase getestet. Der Indolring von Tryptophan ahmt das Adenin von ATP nach und konkurriert mit ATP von der Bindung bis zur ATP-Bindungsstelle. Darüber hinaus konkurriert das methylierte Arginin im Liganden um die SH3-Domäne von Src. Die Forscher zeigten, dass ein Polypeptid, das demethyliertes Arginin enthält, die SH3-Domäne hemmt, möglicherweise aufgrund einer spezifischen konservierten Sequenz auf dem SH3-Bindungsmotiv (d.h. PXXP), die eine Bindungsaffinität zu einem Liganden aufweist, der zwei bis drei Arg-Reste im N-Terminus oder ein bis zwei Arg-Reste auf dem C-Terminus der Liganden15 enthält. 16,17. Die Guanidino-Gruppe von Arg bindet an den konservierten Asp-99-Rest der SH3-Domäne18,19, während der verbleibende Teil des Arg an das konservierte Trp-118 des Enzyms bindet, wie durch NMR-Analysen und die Kristallstrukturen mehrerer SH3-Domänenbestätigt wurde 19. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Synthese von sieben methylierten Dipeptiden und die Überprüfung ihrer Hemmfähigkeit gegen die Src-Kinase vorgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit dieser Peptide untersucht, mehrere Krebszelllinien in vitro abzutöten.

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Protocol

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1. Synthese von Peptiden

HINWEIS: Die Synthese von W-R wird als repräsentatives Beispiel beschrieben (Abbildung 2).

  1. Wiegen Sie 566 mg (0,3 mmol) H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl-Harz und geben Sie es in das Peptidsynthesegefäß (siehe Materialtabelle), gemäß dem von Mandal et al.verwendeten Verfahren 20. Führen Sie die Peptidsynthese unter Verwendung der etablierten Strategie der Festphasenpeptidsynthese (SPPS)21 durch.
    HINWEIS: Methylierte oder dimethylierte Dipeptide, die unnatürliche Aminosäuren enthielten, wurden auf einem Eisamidharz (Ladekapazität von 0,3 mmol/g) assembliert, während Dipeptide, die natürliche Aminosäuren enthielten, auf einem Harz montiert wurden, an das die erste Aminosäure gebunden war, wie z. B. das H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl-Harz (Ladekapazität von 0,3 mmol/g). Wichtig ist, dass das Amidharz der Eisbahn ein Peptid produziert, das mit einem C-terminalen NH2 bedeckt ist.
  2. Das trockene Harz wird 1 h lang in 5 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) unter Stickstoffgasdruck gequollen, der mit dem Peptidgefäß verbunden ist.
    HINWEIS: Führen Sie den gesamten Syntheseprozess in einem Abzug durch. Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel müssen während des gesamten Experiments getragen werden. Ein Timer ist auch wichtig, um den Überblick zwischen den Schritten der Zugabe chemischer Reagenzien zu behalten.
  3. Entfernen Sie überschüssiges DMF mithilfe des Stickstoffgasdrucks, der während des gesamten Syntheseprozesses mit dem Peptidsynthesegefäß verbunden ist.
  4. Als Kupplungsreagenzien sind 473,9 mg Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) und 341 mg 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) (0,9 mmol) gewogen. Geben Sie die Pulver in ein Reagenzglas und lösen Sie sie in 5 mL trockenem DMF auf.
  5. 313,4 μl (1,8 mmol) N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) als aktivierendes Mittel in das Reagenzglas geben (Schritt 1.4) und durch Schütteln des Röhrchens mischen.
  6. Den Inhalt des Reagenzglases in das Harz geben und die Reaktion 1 h lang unter Stickstoffgas bei Raumtemperatur ablaufen lassen. Lassen Sie dann das überschüssige DMF mit Stickstoffgasdruck ab und waschen Sie das Harz 3x mit DMF.
  7. Der Schutz des N-terminalen Fmoc wird mit 5 ml 20 % Piperidin in DMF (v/v) für 20 min unter Stickstoffgas entschärft. Waschen Sie das Harz 3x mit DMF (3 x 5 mL).
  8. Trocknen Sie das Harz, indem Sie 5 ml Dichlormethan (DCM) hinzufügen und 5 Minuten lang unter Stickstoffgas halten, dann entleeren Sie das DCM mit Stickstoffgasdruck. Fügen Sie 5 mL Methanol 5 Minuten lang unter Stickstoffgas hinzu, um die Trockenheit des Harzes zu erhöhen.
  9. Geben Sie 10 ml eines frisch zubereiteten Spaltungscocktails aus TFA/Thioanisol/Dithiothreitol/Anis (90:3:5:2 v/v/w/v) für 2,5 h hinzu, um alle Seitenketten zu entschützen und das Dipeptid vom Harz abzuspalten.
    ACHTUNG: Der Dekolleté-Cocktail muss in einem Glasmesszylinder zugegeben werden, da TFA sauer und gefährlich ist; Seien Sie vorsichtig bei der Anwendung.
  10. Nach 2,5 h wird die Reaktionslösung aus dem Peptidgefäß unter Stickstoffdruck in einen Rundkolben abgelassen. 250 ml Kaltdiethylether (Et2O) werden in den Rundkolben mit dem Rohpeptid gegeben, um das Peptid auszufällen.
  11. Filtrieren Sie das gefällte Peptid mit Hilfe eines Filterpapiers in einem konischen Trichter mit einem Seitenarm, der mit Wasser verbunden ist (so dass die Filtration aufgrund des Wasserdrucks erfolgt), und sammeln Sie den Niederschlag (die Peptide), um den Äther vollständig zu entfernen. Das Rohpeptid fällt innerhalb von 10 min aus.
  12. Aufreinigung des Rohpeptids auf einer Umkehrphasen-Säule für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Gradientensystems. Verwenden Sie einen Gradienten von 0 % bis 100 % Acetonitril mit 0,1 % TFA in Wasser mit 0,1 % TFA für 30-60 min bei einer Durchflussrate von 1 ml/min.

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Abbildung 2: Festphasen-Peptidsynthese von W-R. Abkürzungen: HBTU = 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat; DIPEA = N,N-Diisopropylethylamin; TFA = Trifluoressigsäure; DMF = Dimethylformamid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bestimmung der Zelltoxizität der synthetisierten Peptide

  1. Platten 2.000 Zellen/Well mit SK-OV-3-Zellen, 5.000 Zellen/Well mit MDA-MB-231-Zellen oder 5 × 106 Zellen/Well mit CCRF-CEM-Zellen (in einem Gesamtvolumen von 100 μl/Well) in eine 96-Well-Mikroplatte. Inkubieren Sie die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 °C, bis sie eine Konfluenz von 75 % bis 80 % erreichen.
    HINWEIS: RPMI-16-Medien werden für die Kultivierung von CCRF-CEM-Zellen und Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) sowohl für MDA-MB-231- als auch für SK-OV-3-Zelllinien verwendet. Beide Medien werden mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin in 0,9 % NaCl) ergänzt. Legen Sie alle Medien und Nahrungsergänzungsmittel für 30 Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Das Experiment sollte in einer Biosicherheitshaube, mit Handschuhen und einem Laborkittel durchgeführt werden.
  2. Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette und fügen Sie 100 μl des 50 μM Peptids oder 10 μM Doxorubicin (Dox), das als Positivkontrolle verwendet wird, in dreifacher Ausfertigung in Vertiefungen hinzu, die die drei verschiedenen Arten von Krebszellen enthalten, die in der 96-Well-Platte plattiert sind. Stellen Sie die Platte für 72 Stunden wieder in den Inkubator (unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1 beschrieben).
  3. Nach 72 Stunden 20 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) in die 96-Well-Platte geben. Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein und inkubieren Sie die Platte für 1-4 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre.
    HINWEIS: MTS ist ein Farbstoff, der zur Visualisierung lebender Zellen (unbehandelt oder mit den Peptiden behandelt) verwendet wird, da nur die lebenden Zellen MTS-Tetrazolium in farbigen Formazan-Farbstoff umwandeln, der bei 490 nm gemessen werden kann.
  4. Messen Sie die Absorption des Formazan-Produkts bei 490 nm (A490) auf einem Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle). Fügen Sie mit MTS gemischtes Medium als Rohling für das Experiment hinzu. Verwenden Sie nur Wasser (da die Peptide wasserlöslich sind) und 0,1 N HCl (da WCH3 HCl zum Auflösen benötigt) als Negativkontrollen.
  5. Messen Sie den prozentualen Anteil des Zellüberlebens anhand der folgenden Gleichung (Gl. 1) unter Verwendung eines Tabellenkalkulationsprogramms (siehe Materialtabelle). Das Verfahren ist das gleiche wie bei Mandal et al.20.
    figure-protocol-2Gl (1)

3. c-Src-Kinase-Aktivitätsassay

HINWEIS: Der Src-Kinase-Aktivitätsassay wurde unter Verwendung eines kommerziellen Assay-Kits (siehe Materialtabelle) in dreifacher Ausfertigung gemäß dem Verfahren von Chhikara et al.22 durchgeführt. Verwenden Sie WCH3 und RCH3 allein als Kontrollen, um die Wirkung der methylierten Aminosäure allein auf die Kinase und mit einer anderen methylierten oder unmethylierten Aminosäure zu vergleichen.

  1. In einer 384-Well-Mikroplatte mit schwarzem Volumen und rundem Boden mit geringem Volumen werden 2,5 μl des Reaktionscocktails mit 0,7 nM His 6-Src-Kinasedomäne im Kinasepuffer, der Teil des Assay-Kits ist, zu 2,5 μl vorverdünnter Peptide, gelöst in 10 % DMSO (4-fache Zielkonzentration), gegeben. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Mikroplattenschüttler (5 U/min) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Der Reaktionscocktail besteht aus dem Kinase-Puffer (200 mM HEPES, pH 7,5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-Mercaptoethanol (43 mM) und Brij-35 (0,04%). Das optimale Substrat der Kinasereaktion dieses Experiments ist (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Geben Sie 5 μl des ATP/Substrat-Cocktails (40 μM/600 μM) auf die Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf einem Mikrotiterplatten-Shaker bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die 1x ADP-Nachweismischung mit 8 nM ADP-Tracer und 10 μg/ml farbstoffkonjugiertem ADP-2-Antikörper (siehe Materialtabelle) für den Stopp vor und detektieren Sie Puffer B (1x) aus dem Kit. Die Kinasereaktion (Schritt 3.2) wird durch Zugabe von 10 μl des 1x ADP-Nachweisgemisches gestoppt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
  4. Messen Sie die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplatten-Reader mit Anregung bei 580 nm, Emission bei 630 nm und 10 nm Bandbreite. Ermitteln Sie relative Fluoreszenzeinheiten (RFUs) vom Instrument, um den Prozentsatz der Enzymhemmung gemäß Gl (2) zu erhalten.
    figure-protocol-3Gl (2)
  5. Berechnen Sie den IC50-Wert , wie auf der Website des Unternehmensaufgeführt 23.

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 und die Kontrollpeptide W-R wurden mittels Fmoc-Festphasenpeptidsynthese synthetisiert (Abbildung 3) mit einer Reinheit von 95 %, 98,7 %, 99 %, 100 %, 100 % bzw. 99,5 %. Die chemischen Strukturen dieser Dipeptide wurden mit ESI-MS bestätigt. Die m/z-Werte dieser Dipeptide betrugen 374,1624, 388,1949, 388,1794, 374,1815, 402,2022 bzw. 361,1457.

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Discussion

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Die hier hergestellten und getesteten Peptide für die Hemmung der Src-Kinase und die daraus resultierende Abtötung von Krebszellen enthielten methyliertes Tryptophan und/oder methyliertes Arginin, die unnatürliche Aminosäuren sind. Die Bildung des weißen Niederschlags durch Zugabe von Diethylether ist ein kritischer Schritt bei der Synthese dieser Peptide. Allerdings können nicht alle synthetischen Peptide einen Niederschlag bilden; daher kann auch dann, wenn kein Niederschlag gebildet w...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken dem Dekanat für wissenschaftliche Forschung (DSR) an der King Abdulaziz University (KAU), Jeddah, Saudi-Arabien, der dieses Projekt unter der Fördernummer finanziert hat. (Tel.: 031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10708984001Peptidsynthese
Aldrich frittierter Filtertrichter für die FestphasensyntheseSigma-AldrichZ283304Peptidsynthesegefäß
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisolSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  Lösung  Reagenzien für Zellproliferationsassays PromegaG3582Zellproliferationsassay (MTS-Reagenz)
Dichlormethan, 99,9%, extra trockenFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 Säule  Shimadzu  (RP-HPLC-System)Wasser/Acetonitril-Gradient
IRDye QC-1 QuencherBell Brook Labs, Madison, WI3013
Mikroplatten-Reader SpectraMax M2eMolekulare Geräte
Microsoft ExcelMicrosoftTabellenkalkulationssoftware
N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Dimethylformamid, wasserfrei, 99,8 %FishersciAA43997M1
Piperidin 20 %Sigma-Aldrich80645
Rink Amid-Harz (100-200 mesh)Sigma-Aldrich8550010025
ThionaisolSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src Kinase-Aktivitäts-Assay-Kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

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