Summary
Microcomputertomografie (μCT) is een niet-destructief beeldvormingsinstrument dat een belangrijke rol speelt bij het beoordelen van de botstructuur in preklinische studies, maar er is een gebrek aan consensus over μCT-procedures voor het analyseren van de botgenezende callus. Deze studie biedt een stapsgewijs μCT-protocol waarmee de genezing van fracturen kan worden gevolgd.
Abstract
Micro-computertomografie (μCT) is de meest voorkomende beeldvormingsmodaliteit om de driedimensionale (3D) morfologie van bot en nieuw gevormd bot tijdens fractuurgenezing te karakteriseren in translationeel wetenschappelijk onderzoek. Studies van lange botbreukgenezing bij knaagdieren omvatten meestal secundaire genezing en de vorming van een gemineraliseerde eelt. De vorm van de gevormde callus en de dichtheid van het nieuw gevormde bot kunnen aanzienlijk variëren tussen tijdspunten en behandelingen. Terwijl standaardmethoden voor het kwantificeren van parameters van intact corticale en trabeculaire bot op grote schaal worden gebruikt en ingebed in commercieel beschikbare software, is er een gebrek aan consensus over procedures voor het analyseren van de genezende callus. Het doel van dit werk is om een gestandaardiseerd protocol te beschrijven dat botvolumefractie en eeltmineraaldichtheid in de genezende callus kwantificeert. Het protocol beschrijft verschillende parameters waarmee rekening moet worden gehouden tijdens beeldvorming en analyse, waaronder de uitlijning van het monster tijdens beeldvorming, de grootte van het relevante volume en het aantal segmenten dat is gevormd om het eelt te definiëren.
Introduction
Micro-computertomografie (μCT) beeldvorming is op grote schaal gebruikt in preklinisch botonderzoek en levert niet-invasieve beelden met hoge resolutie om de microstructuur van botten te evalueren 1,2,3,4,5. μCT omvat een groot aantal röntgenfoto's, verkregen uit een roterend monster of met behulp van een roterende röntgenbron en detector. Algoritmen worden gebruikt om 3D-volumetrische gegevens te reconstrueren in de vorm van een stapel afbeeldingssegmenten. Klinische CT is de gouden standaard voor 3D-beeldvorming van menselijke botten en μCT is een veelgebruikte techniek voor het evalueren van botgenezingsefficiëntie bij proefdieren 1,2,3,4,6,7. Gemineraliseerd bot heeft een uitstekend contrast met röntgenstraling, terwijl zachte weefsels een relatief slecht contrast hebben, tenzij een contrastmiddel wordt gebruikt. Bij de beoordeling van fractuurgenezing genereert μCT beelden die gedetailleerde informatie geven over de 3D-structuur en dichtheid van de gemineraliseerde callus. In vivo μCT-scanning kan ook worden gebruikt voor longitudinale, tijdsverloopbeoordeling van fractuurgenezing.
De kwantificering van intact corticale en trabeculaire bot met behulp van μCT is over het algemeen goed ingeburgerd en gestandaardiseerd8. Hoewel preklinische studies een verscheidenheid aan kwantificeringsmethoden gebruiken om fractuurgenezing 9,10,11 te analyseren, is een gedetailleerd protocol van μCT-beeldanalyse voor eeltkwantificering nog niet gepubliceerd. Daarom is het doel van deze studie om een gedetailleerd stap-voor-stap protocol te bieden voor μCT-beeldvorming en analyse van botgenezende callus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is ontwikkeld om lange-bot genezende callus geoogst van geëuthanaseerde muizen te karakteriseren. De meeste stappen kunnen echter worden toegepast op ratten en ook worden gebruikt voor in vivo scannen van gebroken botten. Het protocol beschrijft een bepaald μCT-systeem en specifieke beeldverwerkings-, analyse- en visualisatiesoftware (zie Materiaaltabel), maar de methodologie is algemeen toepasbaar op andere scanners en software. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Pennsylvania State University College of Medicine. Muizen die in deze studie werden gebruikt, waren 16 weken oude, mannelijke C57BL / 6J-muizen (gemiddeld gewicht 31,45 ± 3,2 g).
1. Weefseloogst en -conservering
OPMERKING: Gebruik een geschikt muizenfractuurmodel. Voor deze studie werd het mid-diafysaire open tibiale fractuurmodel gebruikt volgens het standaardprotocol beschreven in12,13.
- Aan het einde van het fractuurmodelexperiment euthanaseert u de muis door een intraperitoneale injectie van ketamine of xylazine toe te dienen (respectievelijk 500 mg / kg of 50 mg / kg).
- Oogst met een schaar het gebroken bot van het middendijbeen tot het tibiotalaire gewricht zonder de breukplaats te verstoren. Verwijder de spieren rond het bot en laat alleen het zachte weefsel achter dat in direct contact staat met het bot om de fractuurplaats te ondersteunen tijdens de volgende verwerkingsstappen. Verwijder de intramedullaire pin met behulp van micro-mug rechte hemostatische tang.
- Bewaar de monsters in formaline bij 4 °C of in zoutoplossing bij -20 °C. De keuze van het conserveringsvoertuig hangt af van de beoogde toepassingen stroomafwaarts van μCT. In dit onderzoek werden de monsters bewaard in een zoutoplossing bij -20 °C.
2. μCT-scanning
- Monstervoorbereiding
- Voor het gelijktijdig scannen van meerdere monsters plaatst u maximaal zes monsters in een speciaal ontwikkeld, 3D-geprint scanarmatuur (figuur 1 A,B) of iets dergelijks. Gelijktijdig scannen vermindert de scantijd en -kosten. Het aangepaste armatuur dat in deze studie wordt gebruikt, bevat zes sleuven om de lange botmonsters vast te houden en een middengat voor een hydroxyapatiet (HA) fantoom (figuur 1A, B; Materiaalopgave).
OPMERKING: Het HA-fantoom dient als standaard in stap 4.2 (zie hieronder) om μCT-eenheden (meestal Hounsfield) om te zetten in HA-dichtheid (mgHA/ccm). - Plaats het voorbereide armatuur in een spuit of een conische buis die vergelijkbaar is met de diameter van het gezichtsveld (FOV; Figuur 1C). In deze studie werd een spuit van 20 mm gebruikt om het gezichtsveld van 21,5 mm te evenaren.
- Om te voorkomen dat monsters tijdens het scanproces uitdrogen, vult u de spuit of de canonieke buis met het conserveermiddel dat in stap 1.3 wordt gebruikt (zoutoplossing werd in dit onderzoek gebruikt).
- Voor het gelijktijdig scannen van meerdere monsters plaatst u maximaal zes monsters in een speciaal ontwikkeld, 3D-geprint scanarmatuur (figuur 1 A,B) of iets dergelijks. Gelijktijdig scannen vermindert de scantijd en -kosten. Het aangepaste armatuur dat in deze studie wordt gebruikt, bevat zes sleuven om de lange botmonsters vast te houden en een middengat voor een hydroxyapatiet (HA) fantoom (figuur 1A, B; Materiaalopgave).
- Scannen
- Controleer voorafgaand aan het scannen of de μCT-machine als volgt is gekalibreerd: plaats een HA-fantoom op de middellijn van de μCT FOV, scan het fantoom en meet de dichtheid van HA. Zorg ervoor dat de gemeten dichtheid overeenkomt met de dichtheid die door de fabrikant is opgegeven.
- Lijn de middellijn van de monsterarmatuur uit met de geschatte middellijn van de μCT FOV. Dit zorgt ervoor dat de monsters zich binnen de FOV bevinden en dat hun lange assen een oriëntatie hebben die ongeveer samenvalt met de axiale richting van de resulterende afbeeldingen.
OPMERKING: Deze gestandaardiseerde oriëntatie kan later helpen om de analyseprocedure minder vatbaar te maken voor variabiliteiten, zoals in de hoeveelheid weefsel die wordt beschouwd binnen het volume van belang. - Stel de scanparameters van het μCT-systeem in (Materiaaltabel). De parameters die in deze studie worden gebruikt zijn 10,5 μm (isotrope voxelgrootte), 55 kVp (energie/intensiteit), 145 μA (stroom) en 300 ms (integratietijd). Bepaal de voxelgrootte op basis van de geschatte dikte van de muistrabeculae (20-60 μm)8. Inspecteer de scan visueel in verschillende weergaven om er zeker van te zijn dat deze het hele volume van alle eeltmonsters beslaat.
Figuur 1: Structuur van de aangepaste scanarmatuur. (A) Afbeeldingen van de scanarmatuur (boven), met de zes monstersleuven en het HA-fantoom (onder). (B) Afbeeldingen van het monster met lange botten (boven) en het HA-fantoom (onder) in de daarvoor bestemde sleuven. (C) Afbeeldingen van de scanbevestiging die in een spuit van 20 mm is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Beeldsegmentatie
OPMERKING: Raw-afbeeldingen worden automatisch gereconstrueerd tot afbeeldingsreeksgegevens.
- Beeldconversie: converteer de gereconstrueerde beeldreeksgegevens naar DICOM-beeldreeksen met behulp van een beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel). Importeer DICOM-beeldreeksen in de software (zie Materiaaltabel) voor beeldverwerking, analyse en visualisatie (Figuur 2A).
- Bijsnijden van afbeeldingen: één monster per keer, snijd elke afbeeldingsstapel bij en zorg ervoor dat het hele monster wordt opgenomen in het bijgesneden volume (figuur 2B). Sla de bijgesneden afbeelding als volgt op: klik op het tabblad Bestand linksboven in het scherm, selecteer Project opslaan en selecteer vervolgens Projectgrootte minimaliseren uit de opties die op het scherm verschijnen. Het bestand wordt opgeslagen in het commerciële softwareformaat.
- Beeldverwijdering: gebruik een filtermethode om het ruisniveau te verminderen en vervaging als volgt te voorkomen.
- Klik op het tabblad Bestand en kies de afbeelding die moet worden verwerkt met Open Data. De geopende afbeelding verschijnt in het projectweergavevenster in de linkerbovenhoek van het scherm.
- Klik met de rechtermuisknop om Beeldverwerking te selecteren en vervolgens Sandbox filteren. Klik op Maken.
- Voer het volgende uit in het venster Eigenschappen (in de linkerbenedenhoek van het scherm): kies Gegevens als voorbeeldtype; selecteer het filtertype in het vervolgkeuzemenu naast Filter; kies 3D voor interpretatie; selecteer Scheidbaar in het vervolgkeuzemenu naast kerneltype; vul de waarden voor de standaardafwijking en de kernelgroottefactor in het beschikbare lege vak naast elk vak in; selecteer Hetzelfde als invoer in het vervolgkeuzemenu naast uitvoer; klik op Toepassen.
OPMERKING: De keuze van het filtertype (beschikbare opties zijn bilateraal, box, Gaussisch, mediaan, recursief exponentieel, afbakenend, anisotrope diffusie, niet-lokale middelen, onscherpe maskering en FFT-filter) en parameters zijn afhankelijk van het ruisniveau en de voxelgrootte van gescande afbeeldingen. Voor het Gauss-filter zijn 3 x 3 x 3 en 5 x 5 x 5 veelgebruikte waarden voor de kernelgroottefactor en 0,5-2,0 wordt vaak gebruikt voor standaarddeviatie8. In deze studie werd een Gaussisch filter toegepast en werden 5 x 5 x 5 en 0,8 gebruikt voor respectievelijk de kernelgroottefactor en de standaarddeviatie.
- Afbeelding opnieuw uitlijnen
OPMERKING: Dit is een optionele stap. Wanneer tijdens het scanproces een verkeerde uitlijning van lange botmonsters ten opzichte van de coördinatenassen van het beeldvormingssysteem optreedt, kan een digitale uitlijningsmethode worden toegepast om de verkeerde uitlijning te corrigeren (figuur 2C).- Maak als volgt een 3D-gerenderde afbeelding van het voorbeeld. Selecteer in het projectweergavevenster de gefilterde, bijgesneden afbeelding (gemaakt in stap 3.3). Klik met de rechtermuisknop om Weergave en vervolgens Volumeweergave te selecteren in het vervolgkeuzemenu en klik vervolgens op Maken. Controleer het 3D-gerenderde beeld visueel in het sagittale en frontale vlak.
- Draai het gerenderde volume handmatig om een goede uitlijning in de lengteas te verkrijgen. Pas transformatie als volgt toe op de geroteerde afbeeldingen: klik in het eigenschappenvenster op de Transformatie-editor, ga vervolgens naar transformatie-editor-manipulator en selecteer Transformator in het vervolgkeuzemenu. Nu kan het monster worden gedraaid en opnieuw worden uitgelijnd. Zodra het uitlijningsproces is voltooid, klikt u nogmaals op de Transformatie-editor om de afbeelding te vergrendelen.
- Wijzig het aantal pixels van de gefilterde afbeelding (gemaakt in stap 3.3) om als volgt nieuwe dwarse (axiale) vlakke afbeeldingssegmenten te maken: Selecteer in het venster Projectweergave de afbeelding uit stap 3.4.2. Klik met de rechtermuisknop om Geometrietransformatie te selecteren en vervolgens Getransformeerde afbeelding opnieuw te samplen in het vervolgkeuzemenu en klik op Maken. Ga in het eigenschappenvenster naar Gegevens en voer het volgende uit: voor interpolatie selecteert u Standaard in het vervolgkeuzemenu; voor de modus kiest u Uitgebreid; om te behouden, kies Voxel Size; Voer bij Opvulwaarde nul in het vak Beschikbare lege ruimte in. Klik vervolgens op Toepassen.
- Bepalen van het volume van de rente (VOI)
- Ga door de dwarse beeldsegmenten en identificeer het middenvlak van de breuk eelt. Definieer de VOI op basis van de proximale en distale uiteinden van de callus. In gevallen waarin de eeltuiteinden moeilijk te definiëren zijn, definieert u de VOI op basis van een gestandaardiseerde afstand tot het callusmiddenvlak (figuur 2D).
OPMERKING: Tijdens genezingsfasen die voorafgaan aan botremodellering, is het definiëren van de randen van het gemineraliseerde eelt eenvoudig omdat de trabeculaire structuur van het nieuw gevormde geweven bot verschilt van de corticale structuur van het oorspronkelijke bot. Wanneer de remodelleringsfase echter volgt, krijgt het nieuw gevormde bot geleidelijk de corticale structuur; Zo wordt het definiëren van de randen van het eelt steeds uitdagender.
- Ga door de dwarse beeldsegmenten en identificeer het middenvlak van de breuk eelt. Definieer de VOI op basis van de proximale en distale uiteinden van de callus. In gevallen waarin de eeltuiteinden moeilijk te definiëren zijn, definieert u de VOI op basis van een gestandaardiseerde afstand tot het callusmiddenvlak (figuur 2D).
Figuur 2: Beeldsegmentatie . (A) Een afbeelding met zes monsters binnen één scan. (B) Bijsnijden van afbeeldingen om afzonderlijke monsters te isoleren. (C) Digitale uitlijning om een verkeerd uitgelijnde lengteas (gele stippellijn) te corrigeren. (D) Definitie van het VOI- en eeltmiddenvlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Beeldanalyse
- Segmentatie van het eelt en corticale bot
- Contour de buitengrens van het eelt semi-automatisch met behulp van het gereedschap segmentatie lasso met opties voor automatische overtrekken en randen overtrekken (afbeelding 3A) als volgt:
- Nadat u getransformeerde afbeeldingen opnieuw hebt samengesteld (stap 3.4.3), klikt u op het tabblad Segmentatie in de tweede tabbladrij boven aan het scherm. Selecteer in het venster van de segmentatie-editor een getransformeerde afbeelding (gemaakt in stap 3.4.3) in het vervolgkeuzemenu naast de afbeelding.
- Dubbelklik in het venster MATERIALEN op Toevoegen; Door dit te doen, verschijnen er twee tabbladen met de namen Material3 en Material4. Klik met de rechtermuisknop om materiaal3 te hernoemen naar eelt en materiaal4 naar corticale bot.
- Klik in het venster SELECTIE op het lasso-pictogram; selecteer uit de opties die worden weergegeven Vrije hand voor de 2D-modus, Binnenkant voor de 3D-modus en zowel Automatisch overtrekken als Randen traceren voor opties. Gebruik de lasso om de interessante regio's te markeren.
- Herhaal deze contourstap met segmenten die over de VOI zijn bemonsterd (figuur 3B). De voorgevormde segmenten kunnen uit elkaar worden geplaatst (bijvoorbeeld gescheiden door 20 segmenten).
OPMERKING: In regio's met complexe eeltstructuren kan de gebruiker overwegen de afstand tussen voorgevormde segmenten te verkleinen om meer fragmenten vast te leggen (figuur 3A,B). - Interpoleer over de voorgevormde eeltcontouren om een volledig eeltlabel te maken (Figuur 3C,D) als volgt: kies in het venster MATERIALEN het Callus-bestand (gemaakt in stap 4.1.1.2.), klik op het tabblad Selectie boven aan het scherm en selecteer Interpoleren in het vervolgkeuzemenu. Klik in het venster SELECTIE op het plusteken.
- Open het Cortical Bone-bestand dat is gemaakt in stap 4.1.1.2. Segmenteer het corticale bot, inclusief de medullaire holte, zoals beschreven voor de callus in stappen 4.1.1 en 4.1.2. (Figuur 4A,B). Interpoleer de voorgevormde periostale cortex om een corticale botlabel te creëren zoals beschreven voor de callus in stap 4.1.3 (figuur 4C,D).
- Bereken het voorgevormde volume en de gemiddelde grijswaarde van het eelt als volgt: klik op het tabblad Segmentatie in de bovenste rij van het scherm en selecteer Materiaalstatistieken in het vervolgkeuzemenu. Hiermee wordt een tabel gegenereerd die alle berekende waarden bevat. De waarden van het corticale bot en de callus (na aftrek van het corticale bot) worden afzonderlijk vermeld. Zodra de tabel is gegenereerd, klikt u op Exporteren naar werkruimte om de gegevens op te slaan.
- Contour de buitengrens van het eelt semi-automatisch met behulp van het gereedschap segmentatie lasso met opties voor automatische overtrekken en randen overtrekken (afbeelding 3A) als volgt:
- Conversie van grijswaardeneenheden naar botmineraaldichtheid
- Snijd de 3D-afbeelding van het 4,5 mm HA-fantoom (figuur 2B) bij uit de hele afbeelding en klik op Segmentatie. De hars van het HA-fantoom bevat vijf kleine HA-cilinders (figuur 1A). Voor de HA-cilinder met de hoogste dichtheid definieert u de eerste en de laatste plakjes door visuele inspectie.
- Teken twee cirkels bij het eerste en het laatste segment (randen vermijden) met het penseel (afbeelding 5A) als volgt: klik in het venster MATERIALEN vier keer op Toevoegen . Klik met de rechtermuisknop om material3, material4, material5 en material6 te hernoemen naar respectievelijk phantom1, phantom2, phantom3 en phantom4. Selecteer Phantom1, klik op het penseelpictogram in het venster SELECTIE en gebruik de schuifregelaar om de penseelgrootte (cirkelvormige overtrek) aan te passen op basis van de grootte van het fantoom (de grootte van de cirkel moet kleiner zijn dan die van het fantoom).
- Pas interpolatie toe tussen de twee cirkels om als volgt een volume voor elke HA-cilinder te maken (figuur 5B): selecteer in het venster MATERIALEN de optie Phantom1, klik op het tabblad Selectie op de bovenste rij van het scherm en selecteer Interpoleren in het vervolgkeuzemenu. Klik in het venster SELECTIE op het plusteken.
- Herhaal het segmentatieproces met drie van de resterende HA-cilinders, beginnend bij de op een na hoogste HA-dichtheid en eindigend met de op een na laagste HA-dichtheid (figuur 5B). De cilinder met de laagste HA-dichtheid kan worden uitgesloten omdat deze vaak moeilijk te segmenteren is.
- Gebruik de gegenereerde 3D-labels om de gemiddelde grijswaarden van de vier geanalyseerde HA-cilinders te berekenen. Plot met behulp van een spreadsheet (zie materiaaltabel) of iets dergelijks de gemiddelde grijswaarden en de bijbehorende bmd-waarden (bone mineral dency) die door de fantoomfabrikant zijn verstrekt. Genereer een correlatievergelijking tussen BMD en de grijswaarden met behulp van lineaire regressie.
- Segmentatie van de gemineraliseerde callus en berekening van BMD
- Bepaal op basis van de correlatievergelijking gegenereerd in stap 4.2.5 en de gekozen drempel die gemineraliseerde en niet-gemineraliseerde callus onderscheidt, de overeenkomstige grijswaardedrempel. Label daarom het eeltgebied met grijze waarden groter dan de drempel als gemineraliseerd eelt en label de rest als niet-gemineraliseerd (figuur 6A, B). In deze studie werd 250 mgHA/ccm gebruikt als drempel voor gemineraliseerd eelt14,15.
- Bereken de totale eelt- en gemineraliseerde eeltvolumes. Bereken op basis van deze waarden de botvolumefractie (gemineraliseerd eeltvolume genormaliseerd tot het totale eeltvolume = BV/TV). Gebruik de gemeten gemiddelde grijze waarde voor het totale eelt om de BMD van eelt te berekenen met behulp van de correlatievergelijking gegenereerd in 4.2.5.
OPMERKING: Op basis van het doel van de studie en de software die voor de analyse wordt gebruikt, kunnen andere parameters zoals SMI (structuurmodelindex), trabeculaire dikte en mate van anisotropie worden berekend.
Figuur 3: Segmentatie van de buitengrens van het eelt. (A) Een contour van de buitengrens van de eelt (rode lijn). (B) Contouren bij plakjes die over de VOI zijn bemonsterd (rode plakjes). (C) Een 3D-eeltlabel gemaakt door interpolatie (rood volume). (D) Een doorsnede van het eeltlabel weergegeven in C (inclusief corticale bot). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Segmentatie van het corticale bot. (A) Een contour van het periostale oppervlak van de cortex (groene lijn). (B) Contouren bij de over de VOI bemonsterde segmenten (groene plakjes). (C) Een 3D-label van het corticale bot (met daarin de medullaire holte; groen) en de callus (rood) gemaakt van geïnterpoleerde labels van de periostale cortex en de eelt. (D) Een doorsnede van het eelt (rood) en het corticale bot (met daarin de intramedullaire holte; groen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Conversie van grijswaardeneenheden naar BMD. (A) Contouren van de HA-cilinder bij de eerste en de laatste plak (rode cirkels). (B) 3D-geïnterpoleerde HA-cilinders (links) en doorsneden (rechts). Bruin: hoogste HA-dichtheid; blauw: op één na hoogste HA-dichtheid; violet: op twee na hoogste HA-dichtheid; groen: vierde hoogste HA-dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Segmentatie van de gemineraliseerde callus. (A) De gemineraliseerde callus (≥250 mgHA/ccm) wordt in blauw weergegeven, de rest van het eelt (<250 mgHA/ccm) wordt in rood weergegeven en de ruimte die overeenkomt met het oorspronkelijke bot wordt in groen weergegeven. (B) Een 3D-weergave van elk geïsoleerd etiket. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de botvorming tijdens fractuurgenezing te controleren, werd een mid-diafysaire open tibiale fractuur geïnduceerd bij volwassen, mannelijke C75BL / 6J-muizen. De fractuur werd gestabiliseerd met behulp van een intramedullaire nagel, een gevestigd model van secundaire genezing13. Eeltweefsel werd geoogst op dag 14, 21 en 28 na fractuur12. Deze tijdspunten vertegenwoordigen verschillende fasen van genezing. Endochondrale botvorming tijdens secundaire botgenezing verloopt via de initiële vorming van een fibro-kraakbeenachtige (zachte) callus, die in latere stadia mineraliseert om micromotie bij de fractuurkloof te verminderen, waardoor de vorming van nieuwe bloedvaten over de breuklijn13 mogelijk wordt. Dag 14 na de fractuur in het muizenfractuurmodel dat in deze studie wordt gebruikt, vertegenwoordigt het stadium van gemineraliseerde zachte eelt. Naarmate de genezing vordert van dag 14 tot dag 21, wordt het gemineraliseerde zachte eelt volledig vervangen door nieuw gevormd geweven bot, wat resulteert in benige overbrugging van de breukkloof13. Tussen dag 21 en 28 ondergaat de callus resorptie en remodellering om de karakteristieke structuur van corticale bot12 te herstellen.
μCT-beelden werden verkregen en geanalyseerd op drie tijdstippen met behulp van het hierboven beschreven protocol. Op elk tijdstip werden minimaal 10 monsters geanalyseerd. Voor elk monster werden botvolumefractie en BMD berekend. De botvolumefractie werd berekend door het volume van gemineraliseerde callus (BV) te delen door het totale eeltvolume (TV). De resultaten toonden een aanzienlijke vorming van gemineraliseerde callus op dag 14 (figuur 7A, B) en incrementele toename van het botfractievolume en de BMD naarmate de genezing vorderde van dag 14 tot dag 21 en 28 (figuur 7A, B), consistent met benige overbrugging van de fractuurkloof. Zoals verwacht onderging het eelt tussen dag 21 en 28 resorptie/remodellering, zoals blijkt uit een afname van het totale eeltvolume (figuur 7A,B). Corticale overbrugging van de callus was duidelijker op dag 28 dan enig voorafgaand tijdstip (figuur 7A). Deze resultaten geven aan dat het meegeleverde μCT-protocol het mogelijk maakt om de botvorming en eeltstructuur tijdens verschillende fasen van botgenezing te monitoren.
Figuur 7: Monitoring van botgenezing met behulp van μCT. (A) 2D (sagittaal, linkerpaneel) en 3D (rechterpaneel) beelden van de genezende callus gegenereerd door μCT op de aangegeven post-fractuur tijdstippen. (B) BMD, botvolumefractie (BV/TV) en totaal eeltvolume berekend op basis van afbeeldingen in A. De resultaten tonen genezingsprogressie door de late reparatie- en remodelleringsfasen. N = 10-12. De stippen op de lijnplot vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. (*) p < 0,05 met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door de post-hoctest van Tukey. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze studie is om een gedetailleerd protocol voor μCT-analyse te beschrijven met als doel een nauwkeurige kwantificering van de 3D-gemineraliseerde eeltstructuur, die vaak fundamenteel is in bot- en fractuurgenezingsstudies. Het protocol maakt gebruik van een algemeen state-of-the-art 3D-beeldanalysesoftwareplatform dat beeldvisualisatie, segmentatie / etikettering en metingen van eenvoudig tot complex mogelijk maakt.
De meest tijdrovende taak in het protocol is semi-geautomatiseerde segmentatie van de callus, met uitsluiting van het corticale bot en het medullaire kanaal. Deze regio is ook uitgesloten in veel eerdere studies 9,16,17,18. Sommige studies hebben de inheemse corticale bot- en kanaalregio's opgenomen in hun analyses19,21, terwijl in andere studies de aanpak niet duidelijk was. Het opnemen van de inheemse cortices vermijdt de moeilijkheid en potentiële subjectiviteit bij het contouren van verkleinde gebieden van gebroken cortices, maar blaast eeltmineralisatiemaatregelen op.
Het protocol richt zich op het verkrijgen van outputmetingen, waaronder het totale eeltvolume, het gemineraliseerde volume, de botvolumefractie en de botmineraaldichtheid. Deze parameters zijn gemakkelijk te interpreteren en worden vaak gerapporteerd in de literatuur. Gemineraliseerd volume en botvolumefractie zijn afhankelijk van de geselecteerde drempel voor het onderscheiden van gemineraliseerd versus niet-gemineraliseerd, terwijl botmineraaldichtheid dat niet is. De mineraaldichtheid van het weefsel kan ook worden berekend op basis van alleen het weefsel dat als gemineraliseerd is gelabeld, in plaats van de botmineraaldichtheid op basis van zowel gemineraliseerd als niet-gemineraliseerd eelt. Van weefselmineraaldichtheid is gemeld dat deze geassocieerd is met torsiesterkte en stijfheid9; Deze metingen worden echter waarschijnlijker beïnvloed door partiële volume-effecten en beeldvormingsresolutie dan botmineraaldichtheid.
Onderzoekers hebben een goede correlatie gemeld tussen gekwantificeerde 3D-corticale overbrugging en eeltsterkte en stijfheid (corticale overbrugging beoordeeld op 2D-röntgenfoto's wordt gewoonlijk klinisch beoordeeld bij menselijke patiënten)20. Aanvullende 3D-eelteigenschappen die in de literatuur worden gerapporteerd, omvatten momenten van traagheid10,15,19, die de geometrische verdeling van de callus kenmerken (d.w.z. hoe verspreid het weefsel is). Polair traagheidsmoment heeft theoretisch betrekking op torsieweerstand en buigmoment van traagheid heeft betrekking op buigweerstand. Hoewel deze eigenschappen konden worden berekend op basis van de gesegmenteerde eeltgegevens die in deze studie werden beschreven, is gemeld dat hun correlatie met gemeten biomechanische eigenschappen inconsistent is 9,19,2 1. Andere eerder gerapporteerde eelteigenschappen zijn connectiviteitsdichtheid, trabeculaire dikte en structuurmodelindex11,17,,2 2. Deze parameters worden vaak gebruikt om trabeculair bot te karakteriseren en worden gemakkelijk berekend door μCT-scannersoftware; Hun relatie met de kwaliteit van fractuurgenezing is echter niet zo duidelijk. De software die in dit protocol wordt gebruikt, is een programma voor algemeen gebruik, niet specifiek voor bot. Dus als bepaalde botparameters zoals trabeculaire dikte buiten dit protocol worden berekend, kunnen gesegmenteerde gegevens worden geëxporteerd naar andere programma's voor verdere analyse (bijvoorbeeld zoals in Watson et al.23).
Dit protocol biedt gedetailleerde workflows voor complexe eeltstructuurkarakterisering en kwaliteitscontrole vanuit een enkele softwareomgeving in vergelijking met andere methoden waarbij meerdere programma's nodig zijn voor analyse24. Daarom is tijdsbesparing een potentieel voordeel van dit protocol. De software maakt een verscheidenheid aan flexibele, geavanceerde 3D-visualisatiemethoden mogelijk die helpen een nauwkeurige analyse te garanderen en ook parallelle tabellering van alle resultaten mogelijk maken.
Het μCT-analyseprotocol kan worden aangepast aan verschillende fractuurmodellen bij zowel muizen als ratten; Voor andere toepassingen wordt optimalisatie van enkele van de kritieke stappen aanbevolen om de resultaatvariatie te minimaliseren. In het bijzonder moet worden gekeken naar de impact van het veranderen van de grootte van de VOI of het aantal voorgevormde segmenten binnen de VOI op de reproduceerbaarheid van de resultaten. Ook het gebruik van digitale herschikking zoals beschreven in stap 3.4 wordt aanbevolen, maar als andere software wordt gebruikt voor analyse, kan het nodig zijn om de noodzaak van deze stap te beoordelen, door gegevens te vergelijken die zijn gegenereerd met en zonder digitale herschikking.
In dit protocol werd een semi-geautomatiseerde segmentatiebenadering gebruikt voor de identificatie en scheiding van de callus van het corticale bot en merg. In gevallen zoals verkleinde fracturen, waarbij de structuur van de callus extreem complex is, wordt het contouren van de callus en het periostale oppervlak van de cortex een uitdaging. Het is in deze gevallen raadzaam om de contouring uit te voeren met meerdere experimentatoren om de subjectiviteit te beoordelen en te proberen te beperken.
Er zijn beperkingen met dit protocol. Het protocol vereist de conversie en export van DICOM-afbeeldingen, zodat afbeeldingen vervolgens in aanvullende software kunnen worden geanalyseerd; Deze stap neemt wat extra tijd in beslag en kan het gebruik van een kalibratiefantoom in het beeld noodzakelijk maken. Naarmate geautomatiseerde segmentatietechnieken blijven evolueren, inclusief technieken op basis van machine learning, kan het voordelig zijn om de handmatige contouringgedeelten van het protocol te vervangen door deze nieuwe technieken. Over het algemeen kan het gedetailleerde protocol dat hier wordt beschreven voor de analyse van botgenezende callus bij knaagdieren vooral ten goede komen aan laboratoria zonder substantiële μCT-analyse-ervaring en kan het helpen bij het vaststellen van een meer consistente en gestandaardiseerde aanpak in het hele veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 DK121327 naar R.A.E en R01 AR071968 naar F.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
