Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Summary

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Abstract

Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt. Daher ist die Verwendung geeigneter präklinischer kardialer Sicherheitsbewertungsmodelle ein kritischer Schritt bei der Arzneimittelentwicklung. Derzeit hängt die kardiale Sicherheitsbewertung noch stark von Tierversuchen ab. Tiermodelle sind jedoch aufgrund artspezifischer Unterschiede, insbesondere in Bezug auf kardiale elektrophysiologische Eigenschaften, von einer schlechten translationalen Spezifität für den Menschen geplagt. Daher besteht ein dringender Bedarf, ein zuverlässiges, effizientes und humanbasiertes Modell für die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung zu entwickeln. Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als unschätzbares In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. hiPSC-CMs können von Personen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen und verschiedenen Krankheitszuständen erhalten werden, was sie zu einem idealen Surrogat macht, um die medikamenteninduzierte Kardiotoxizität individuell zu beurteilen. Daher müssen Methoden zur umfassenden Untersuchung der funktionellen Merkmale von hiPSC-CMs festgelegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir verschiedene funktionelle Assays, die an hiPSC-CMs bewertet werden können, einschließlich der Messung der Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und der Kalziumhandhabung. Insgesamt hat die Einbeziehung von hiPSC-CMs in die präklinische kardiale Sicherheitsbewertung das Potenzial, die Arzneimittelentwicklung zu revolutionieren.

Introduction

Die Entwicklung von Medikamenten ist ein langer und teurer Prozess. Eine Studie über neue therapeutische Medikamente, die zwischen 2009 und 2018 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassen wurden, berichtete, dass die geschätzten Mediankosten für aktivierte Forschung und klinische Studien 985 Millionen US-Dollar pro Produkt^{betrugen 1}. Arzneimittelinduzierte Kardiotoxizität ist die Hauptursache für Arzneimittelabnutzung und Rückzug vom Markt². Insbesondere wird Kardiotoxizität unter mehreren Klassen von Therapeutika berichtet³. Daher ist die kardiale Sicherheitsbewertung....

Protocol

1. Vorbereitung von Medien und Lösungen

1. Bereiten Sie das hiPSC-CM-Wartungsmedium vor, indem Sie eine 10-ml-Flasche 50x B27-Ergänzung und 500 ml RPMI 1640-Medium mischen. Lagern Sie das Medium bei 4 °C und verbrauchen Sie es innerhalb eines Monats. Gleichen Sie das Medium vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) aus.
2. Das hiPSC-CM-Seeding-Medium wird durch Mischen von 20 ml Serumersatz und 180 ml hiPSC-CM-Erhaltungsmedium (10% Verdünnung, v/v) hergestellt. Während frisch zubereitetes Saatmedium bevorzugt wird, kann es nicht länger als 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Gleichen Sie das Medium vor Gebrauch auf RT aus.
3. Bereiten S....

Results

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktionsbewegung, das Feldpotential, das Aktionspotential und der Ca²⁺ -Transient von hiPSC-CMs gemessen werden. Ein schematisches Diagramm einschließlich der enzymatischen Verdauung, Zellaussaat, Aufrechterhaltung und funktionellen Assay-Leitung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Bildung der hiPSC-CM-Monoschicht ist für die Messung der Kontraktionsbewegung notwendig (Abbildung 2B). Eine repräsentative Spur de.......

Discussion

Die humane iPSC-Technologie hat sich zu einer leistungsstarken Plattform für die Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening entwickelt. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der hiPSC-CM-Kontraktilität, des Feldpotentials, des Aktionspotentials und des Ca²⁺-Transienten. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Charakterisierung der hiPSC-CM-Kontraktilität und Elektrophysiologie. Diese funktionellen Assays wurden in mehreren Publikationen unserer Gruppe 12,13,18,24,25,26,27 angew.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glasbodenschale mit 20 mm Micro-Well #1,5 Deckglas	Cellvis	D35-20-1,5-N	Patchklemme
50x B27 Ergänzungen	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM Kulturmedium
6-Well-Kulturplatte	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM-Kultur
96-Well-Mikrotiterplatten aus schwarzem Polystyrol mit flachem Boden und klarem Boden TC-behandelte Mikrotiterplatten	Corning	3603	Messung der Kontraktionsbewegung
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Enzymatische Dissoziation
Integrated Studio (AxIS)	Axion Biosystems		Navigator-Software
Kapillaren aus Borosilikatglas	Harvard Apparatur	BF 100-50-10,Patchklemme
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode' s Lösung
Zellzählkammer Objektträger	ThermoFisher Scientific	C10228	Zellzählung
CytoView 48-Well-MEA-Platten	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Extrazelluläres Matrixmedium
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Intrazelluläre Pipettenlösung
EPC 10 USB Patch-Clamp-Verstärker	Warner Instruments	89-5000
Patch-Clamp Fura-2, AM, zelldurchlässig	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ transiente Messung
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode s Lösung
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' s Lösung
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode (') Lösung
KnockOut Serum Ersatz	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM Sämedium
KOH 8  M	Sigma-Aldrich	P4494	Intrazelluläre Pipettenlösung
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ transiente Messung; ultraschnelle Wellenlängenschaltung Lichtquelle
Luna-FL automatisierter Fluoreszenzzellzähler	WISBIOMED	LB-L20001	Zellzählung
Maestro Pro MEA-System	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-Matrix-Corning-356231			Extrazelluläres Matrixmedium
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Intrazelluläre Pipettenlösung
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode" Lösung
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode' Lösung
NaOH 10  M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode' Lösung
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Lösung in DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ transiente Messung
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM Kulturmedium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnologie		Kontraktionsbewegungsmessung
Sutter Mikropipettenabzieher	Sutter Instruments	P-97	Patchklemme
Trypanblauer Farbstoff	Life Technologies	T10282	Zellzählung