Method Article

Kartierung der absoluten DNA-Dichte in Zellkernen mit Hilfe der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

DOI:

10.3791/64268

⸱

November 11th, 2025

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung absoluter DNA-Dichten innerhalb adhärenter Zellkerne unter Verwendung der Voronoi-Tessellation von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiedaten, des bekannten Volumens, der Genomgröße und des Zellzyklusstadiums.

Abstract

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Im Zellkern befinden sich stumme Gene im Allgemeinen in Chromatinbereichen mit hoher Dichte, die als Heterochromatin bezeichnet werden, während aktive Gene hauptsächlich an der Grenzfläche zwischen Chromatin und dem Interchromatinraum, dem Euchromatin, zu finden sind. Gegenwärtig basiert die Charakterisierung von eu- und heterochromatin hauptsächlich auf epigenetischen Modifikationen von Histonproteinen entlang der DNA-Sequenz, während über absolute DNA-Dichten im Zellkern und deren funktionelle Implikationen wenig bekannt ist. Modelle des Zellkerns, die ausschließlich auf biochemischen Daten und Annahmen über die Natur des Chromatins als Polymer basieren, unterscheiden sich immer noch grundlegend von bildgebenden Daten, die durch hochauflösende Mikroskopie erzeugt werden. Dies deutet darauf hin, dass noch wichtige strukturell relevante Informationen fehlen. Wir glauben, dass räumliche Einschränkungen an der Genregulation beteiligt sein könnten und haben daher eine Methode entwickelt, die die Messung absoluter DNA-Dichten in Säugetierzellkernen ermöglicht, indem superaufgelöste Lokalisierungsdaten durch Voronoi-Tessellation in maßstabsgetreue Dichtekarten umgewandelt werden.

Introduction

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Seit den Anfängen der Zellbiologie fasziniert der Zellkern – der Sitz der Erbinformation – Biologen. Nach Anwendung selbst entwickelter zytologischer Färbemethoden entdeckte Emil Heitz 1928 unterschiedlich intensiv gefärbte Areale im Zellkern1. Er nannte die intensiver gefärbten, dichten Bereiche "Heterochromatin", während er die weniger stark gefärbten, weniger dichten Bereiche "Euchromatin" nannte. Im Laufe der Zeit zeigte sich, dass sich aktive Gene hauptsächlich im Euchromatin befinden, während dichtere Bereiche reich an repetitiven Elementen und stummen Genen sind. Die Begriffe Heterochromatin und Euchromatin haben sich bis heute erhalten, obwohl sich ihre Definition von strukturellen zu molekularen Eigenschaften geändert hat (siehe unten). Heute weiß man, dass der Zellkern in zwei Hauptphasen unterteilt ist. Eine Flüssigkeit (das Interchromatinkompartiment), in dem sich die Kernkörper, das Spleißkompartiment und das Nukleoplasma befinden, und die andere feste, hydrogelähnliche Chromatindomäne, die die Chromosomengebiete und die Nukleolen2 umfasst. An der Grenzfläche zum Interchromatinraum ist das Chromatin weniger dicht, und hier finden hauptsächlich die genetisch aktiven Prozesse wie Transkription, Replikation und Reparatur statt 3,4,5, während das Chromatin in der Nähe der Lamina, um die Nukleolen herum und in der Nähe der Zentromere hohe Verdichtungsgrade aufweist und im Allgemeinen transkriptionell eher inaktiv ist6.

Auf molekularer Ebene wird Chromatin aus DNA aufgebaut, die um Nukleosomen (ein Oktamer der Kern-Histonproteine) gewickelt ist. Die Histone besitzen intrinsisch ungeordnete Schwanzdomänen, die posttranslational durch Zugabe verschiedener chemischer Gruppen (Methyl-, Acetyl-, Phosphor-, Biotin), Aminosäuren (Arginin) oder sogar Proteine (SUMO, Ubiquitin) modifiziert werden können7. Diese Modifikationen können abgelesen werden und andere Proteine (z. B. Chromatin-Remodeler, HP1, Reparaturproteine, RNA) anziehen und so den physiologischen Zustand der DNA-Sequenz definieren (transkriptionell permissiv/restriktiv), ohne ihre Sequenz direkt zu verändern (daher "epi"genetisch)7. Die Art und Anzahl der Modifikationen um eine bestimmte Sequenz kann sich zwischen den Zelltypen stark unterscheiden, ist reversibel und kann sich im Laufe der Entwicklung, der Seneszenz und der Krankheit ändern 8,9,10. Es gibt Modifikationen von Histonschwänzen, die in stark transkribierten Regionen häufiger vorkommen, und Modifikationen, die in Regionen des Genoms vorherrschen, die eine geringe oder keine transkriptionelle Aktivität aufweisen.

Zum Beispiel werden stark transkribierte Regionen, die reich an H3K4-Modifikationen sind oder deren Histonschwänze acetyliert sind, normalerweise als Euchromatin bezeichnet, während Bereiche, die reich an repressiven Histonmodifikationen sind (H3K9me3, H3K27me3 oder H4K20me3), als Heterochromatin bezeichnet werden, das weiter unterteilt wird in konstitutives Heterochromatin (transkriptionell inaktiv in allen Zellen) (z.B. H4K20me3) und fakultatives Heterochromatin (Chromatin je nach Zelltyp stummgeschaltet, z.B. H3K27me3)6. Obwohl biochemische und molekularbiologische Methoden sehr gut geeignet sind, um chemische Veränderungen auf Sequenzebene zu messen, ist es mit diesen Methoden deutlich schwieriger, Aussagen über räumliche Eigenschaften auf der Mesoskala zu treffen.

So wurde beispielsweise versucht, anhand von Proximity-Informationen aus Hi-C-Experimenten, die nahe Annäherungen der DNA zwischen Sequenzregionen erkennen und kartieren, räumliche Modelle des Genoms zu rekonstruieren11. Der direkte Vergleich mit hochauflösenden licht- und elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigt jedoch, dass dies nur bedingt möglich ist (Abbildung 1). Obwohl Methoden wie Hi-C12 Chromosomenterritorien in Interphase-Zellen korrekt als separate Einheiten erkennen können, sind diese Modelle eher "kurzsichtig", da die Nähe zur DNA-Sequenz allein blind ist, um räumliche Beziehungen zwischen weiter entfernten Teilen des Genoms widerzuspiegeln, und daher nicht sehr gut für eine korrekte 3D-Genomrekonstruktion geeignet sind. Daher können auch Dichteunterschiede nicht korrekt durch Kontaktfrequenzinformationen widergespiegelt werden. Dies führt zu "spaghettifizierten" Repräsentationen des Genoms im Zellkern (siehe Abbildung 1B), die in einem Knäuel aus wollartigen, frei zugänglichen Schleifen abzulaufen scheinen.

Um den Weg für ein integratives, realistischeres Bild des Zellkerns zu ebnen, das biochemische Informationen mit biophysikalischen und strukturellen Daten kombiniert, müssen Methoden entwickelt werden, die es ermöglichen, Daten zu verschiedenen Aspekten der Kernorganisation zu generieren. Bis vor kurzem war es auch schwierig, absolute DNA-Dichten in Zellkernen aus bildgebenden Daten zu bestimmen. Gründe dafür waren die eingeschränkte Auflösung herkömmlicher Lichtmikroskope, Probleme in der Elektronenmikroskopie, DNA spezifisch zu färben, und die geringen Beobachtungsvolumina in der Elektronenmikroskopie.

Die Auflösung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskope ist durch die Beugung des Lichts begrenzt. Das Bild einer Punktlichtquelle wird aufgrund der Beugungsgrenze gestreut und kann durch die Point-Spread-Funktion (PSF) beschrieben werden. Das Bild eines Fluorophors, das in guter Näherung als Punktlichtquelle angesehen werden kann, nimmt laut PSF ein Volumen einer bestimmten Größe um seine Ursprungsquelle (Fluorophor) ein13. Wenn viele Fluorophore, die viel näher beieinander liegen als die Dimensionen ihrer beugungsbegrenzten Bilder, gleichzeitig angeregt werden, überlagern sich die abgebildeten Intensitätsverteilungen, und die Position der einzelnen Fluorophore kann nicht aufgelöst werden. Die sequentielle, stochastische Lichtemission von Fluorophoren (Blinken) ermöglicht die optische Isolierung einzelner Moleküle und damit die Bestimmung ihrer genauen Positionen durch die Bestimmung der Intensitätsschwerpunkte ihrer Signale.

Dies kann verwendet werden, um strukturelle Informationen von Proben durch die Akkumulation von Fluorophor-Lokalisierungsdaten aus vielen aufgezeichneten Bildern zu rekonstruieren. Diese Methode wird allgemein als Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) bezeichnet (weitere Informationen siehe14). Je mehr Photonen ein Fluorophor während seiner "Einschaltzeit" aussendet, desto genauer lässt sich die Intensität der Gravitationszentren bestimmen. Astigmatische Linsen im Strahlengang wandeln Signale von Fluorophoren oberhalb oder unterhalb der optischen Brennebene in Ellipsen um, mit denen ihre Position entlang der optischen Achse bestimmt werden kann. Die Längsachsen der Ellipsen, die von Fluoreszenzsignalen unterhalb der Brennebene ausgehen, sind um 90° gedreht im Vergleich zu den Achsen der Ellipsen, die von Fluorophoren oberhalb der Brennebene ausgehen. Des Weiteren ermöglicht das Achsenverhältnis dieser Ellipsen die Bestimmung der Position des Moleküls entlang der optischen Achse relativ zur Fokusebene in einem Bereich von ±300 nm15.

Die Qualität der superaufgelösten Bilder, die durch die Rekonstruktion stochastischer Blinkereignisse erzeugt werden, hängt stark von der Beschriftungsdichte und der Anzahl der Blinkereignisse ab. Letztere hängen von der Photostabilität der Fluorophore und der Anzahl der Blinkereignisse ab, bevor sie schließlich versagen (Anzahl der Ein-/Aus-Zyklen). Das hier beschriebene Verfahren zur Gewinnung von hochauflösenden Bildern der intranukleären DNA-Verteilung wird als fBALM (DNA structure fluctuating-assisted binding-activated localization microscopy) bezeichnet. Es basiert auf Fluorophoren, die transient in Nukleinsäuren interkalieren und erst fluoreszieren, wenn sie an die DNA gebunden sind 16,17. Aufgrund der geladenen Reste ihres Phosphor-Diester-Rückgrats ist DNA ein stark negativ geladenes Polymer. Die Stabilisierung der komplementären DNA-Stränge in lebenden Zellen erfordert eine Neutralisierung durch positiv geladene Proteine (z.B. Histone) und Ionen. Durch Absenkung des pH-Werts wird die Stabilität der komplementären Paarung der Basen verringert, so dass interkalierende Farbstoffe ein- und ausdiffundieren können16,17.

Abhängig vom interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff kann dieser Zustand innerhalb eines bestimmten pH-Bereichs erreicht werden. Fluoreszenzfarbstoffe wie YoYo-1 und SYTOX Orange fluoreszieren nur, wenn sie an DNA gebunden sind, und da interkalierende Farbstoffe (im Gegensatz zu Farbstoffen, die die kleine Rille der DNA binden, wie Hoechst und 4',6-Diamidino-2-phenylindol [DAPI]) in der Regel sequenzunabhängig binden, eignen sie sich gut für die Kartierung der DNA-Verteilung innerhalb von Zellkernen mittels Lokalisationsmikroskopie.

Die Voronoi-Tessellation ist eine mathematische Methode, die es ermöglicht, den Raum basierend auf der Lage der Punkte in verschiedene Partitionen zu unterteilen. Im 2D-Raum spiegelt die Größe der resultierenden Kacheln den Kehrwert der Dichte der Punkte18 wider. Da die Lokalisationsmikroskopie Bilder als eine Reihe von Punkten rekonstruiert, die die Position von Fluorophoren darstellen, kann die Voronoi-Tessellation helfen, die Dichte von Lokalisierungssignalen zu bestimmen (Abbildung 2). Die Verwendung eines DNA-spezifischen Farbstoffs als Fluorophor ermöglicht daher die Messung der DNA-Dichte.

Die a priori Kenntnis des DNA-Gehalts (Anzahl der Basenpaare) und der räumlichen Dimension des Zellkerns ermöglicht die Umwandlung der relativen DNA-Dichten in absolute DNA-Dichten. Das folgende Protokoll zeigt die Kartierung absoluter DNA-Dichten in adhärenten Zellen mittels SMLM mit einer sehr hohen Auflösung und zeigt, dass diese Dichten großen Schwankungen unterliegen.

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Protocol

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HINWEIS: Abbildung 3 gibt einen Überblick über den in diesem Abschnitt beschriebenen Workflow. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Reagenzien, Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Der für diese Veröffentlichung verwendete Code kann hier eingesehen und heruntergeladen werden: https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy.

1. Zellkultur

  1. Kultivieren Sie C3H10T1/2-, HFB- und HeLa-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, die mit 5 % CO2 ergänzt wurde. Wenn Zellen nahe an der Konfluenz sind, subkultivieren Sie die Zellen, indem Sie sie in einem Verhältnis von 1:3 (C3H10T1/2, HFB) bzw. 1:10 (HeLa) teilen.
  2. Einen Tag vor der Durchführung der Messungen säen Sie die Zellen aus exponentiell wachsenden Kulturen auf eine 35 mm große Gitterschale. Stellen Sie sicher, dass die Beobachtungsschüsseln eine hervorragende optische Qualität für die Fluoreszenzmikroskopie bieten (Glasboden mit einer Dicke von 170 μm, #1,5) und über ein Gitter zur eindeutigen Lokalisierung von Zellen verfügen. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich die Zellen in einer einzelligen Suspension befinden und dass die gesamte Oberfläche der Schale homogen mit Zellen bedeckt ist.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Schalen mit einem aufgedruckten Gitter zu verwenden, um wieder genau die Zellen zu finden, die einem bestimmten Zellzyklusstadium zugeordnet wurden.
  3. Falls für das Experiment erforderlich, 100 nM Trichostatin A (TSA) in das Zellkulturmedium geben und die Zellen unter den zuvor in Schritt 1.1 beschriebenen Bedingungen inkubieren.

2. Vorbereitung der Probe

  1. Waschen Sie die Zellen am Tag der Messung einmal mit 1x DPBS, bevor Sie sie für 30 min in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x DPBS fixieren.
    HINWEIS: Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass jedes Mal eine frische PFA-Lösung zubereitet wird, und achten Sie besonders darauf, dass die PFA-Konzentration korrekt ist.
  2. Nach dem Entfernen des Fixiermittels die Zellen erneut 2x mit 1x DPBS waschen, bevor sie 20 min lang in 1x DPBS mit 0,4% Triton X-100 permeabilisiert werden.
  3. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer mit einer Pipette und führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt mit 1x DPBS durch, bevor Sie die Zellen mit einem RNase-Cocktail behandeln (Verdünnung 1:1.000 in 1x DPBS). Legen Sie die Zellen für 30 min bei 37 °C in einen Inkubator in eine befeuchtete Kammer.
  4. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie die fBALM-fähige SYTOX Orange Stammlösung verdünnen (5 mM in 1x DPBS bei 1:10.000 Verdünnung).
  5. Entfernen Sie den RNase-Puffer mit einer Pipette und führen Sie einen zusätzlichen Waschschritt mit 1x DPBS durch, bevor Sie die Färbelösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für 5 Minuten.
  6. Entfernen Sie die SYTOX Orange Färbelösung mit einer Pipette aus den Zellen, waschen Sie sie mit 1x DPBS und lagern Sie die Zellen in 1x DPBS, geschützt vor intensivem Licht.

3. Bestimmung des zytometrischen Zellzyklus

HINWEIS: Für diesen Schritt wurde hier ein inverses High-Content-Screening-Mikroskop verwendet, aber es kann auch ein automatisiertes Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verwendet werden. Die Intensität des gesamten Zellkerns ist ein Maß für seinen DNA-Gehalt; Achten Sie daher darauf, die Lochblende vollständig zu öffnen, wenn Sie ein konfokales System verwenden. Luftobjektive mit niedriger numerischer Apertur (NA) sind Ölimmersionsobjektiven vorzuziehen.

  1. Stellen Sie die Schale mit den Zellen auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem motorisierten Tisch und einer Software ausgestattet ist, die die Rekonstruktion großer Bereiche auf der Probe ermöglicht, indem automatisch aufgenommene Bilder zusammengefügt werden.
  2. Wählen Sie ein Objektiv, das die Aufnahme von ausreichend Zellen pro Gesichtsfeld (insgesamt mindestens 900 Einzelkerne [für Details siehe Roukos et al.19]) ermöglicht, so dass die Bildaufnahme für die Zellzyklusbestimmung in angemessener Zeit durchgeführt werden kann. Verwenden Sie ein Objektiv, das keine großen Intensitätsunterschiede zwischen der Mitte und den Rändern aufweist. Wenn ein solches Objektiv nicht verfügbar ist, wenden Sie eine Flat-Field-Korrektur auf die Bilder an (siehe Schritt 7). Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer 20x NA 0,4 Luftlinse mit einer Schärfentiefe = 8 μm ausgestattet ist.
  3. Decken Sie während der Bildaufnahme den zentralen Bereich der Schüssel mit geeigneten Filtern für das verwendete Fluorophor ab. Nehmen Sie Hellfeldbilder im Durchlichtmodus auf.
    HINWEIS: Hellfeldbilder sind wichtig für die Verschiebung von Zellen auf dem Raster in Schritt 4.6.
  4. Die Form mit den Zellen bis Schritt 4.4 bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
  5. Rekonstruieren Sie den gescannten Bereich aus den Einzelbildern, indem Sie die aufgenommenen Einzelbilder miteinander kacheln.
  6. Übertragen Sie die Bilddaten der fluoreszierenden DNA-Färbung auf einen Computer, auf dem die Open-Source-Software CellProfiler4.2.120 läuft.
  8. Klicken Sie im letzten Schritt der Pipeline zur Beleuchtungskorrektur auf Bilder speichern , um einen Speicherort für die Referenzbilder zu definieren, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Bilder analysieren .
  10. Wählen Sie im Schritt CorrectIlluminationApply der Pipeline das Referenzbild im Dropdown-Menü aus, indem Sie die Funktion Beleuchtung auswählen auswählen.
  11. Definieren Sie im letzten Schritt der Zellzyklus-Analysepipeline einen Ort, an dem das Referenzbild in Schritt 3.7 gespeichert wurde, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren , um die Massenmessung der integrierten Fluoreszenzintensitäten aller Kerne in den in Schritt 3.3 aufgezeichneten Bildern zu starten.
    HINWEIS: CellProfiler4.2.1 generiert eine Textdatei "CellCycleAnalysis_Nuclei.txt", die die Daten jedes gemessenen Zellkerns (Bild, ObjectID, integrierte Fluoreszenzintensität, Bildkoordinaten) im CSV-Format enthält.
  12. Stellen Sie sicher, dass das DisplayHistogram-Element der Pipeline als aktiv aktiviert ist.
  13. Beachten Sie die integrierten Fluoreszenzintensitäten im Histogramm für die Peaks G1 und G2 (siehe Abbildung 4B als Beispiel), und geben Sie die Intervalle um sie herum in die FilteredObjects-Elemente der Rohrleitung ein. Aktivieren Sie die Rohrleitungselemente, indem Sie auf die Kontrollkästchen klicken.
  14. Aktivieren Sie die entsprechenden DisplayDataOnImage-Pipelineelemente , um ein Bild zu generieren, das die Zellen in der Phase G1 oder G2 hervorhebt, und führen Sie die Pipeline erneut aus (siehe Abbildung 4C als Beispiel).
  15. Wählen Sie aus dem erzeugten Bild im markierten Bereich der Beobachtungskammer bis zu fünf Zellen aus, die die gewünschte Zellzyklusphase repräsentieren, und versuchen Sie, die Zellen auf dem SMLM-Mikroskop zu platzieren.
    HINWEIS: Da hier zwei Zelllinien mit unbekannter Genomgröße verwendet werden, wurden die Genomgrößen durch den Vergleich von G1 Peaks einer humanen Fibroblastenzelllinie mit den G1 Peaks von HeLa und C3H10T1/2 Zellen bestimmt. Die Histogramme und das proportionale Verhältnis zwischen ihren Genomgrößen sind in der ergänzenden Abbildung S1 zu sehen.

4. SMLM-fBALM

HINWEIS: Obwohl die Nettosumme an Sauerstoff bei diesen kombinierten biochemischen Reaktionen Null ist, wird empfohlen, die Reaktion in einer nicht verschlossenen Schale durchzuführen, da begrenzte Sauerstoffkonzentrationen die Produktion von D-Glucono-1,5-lacton verlangsamen können. Die Erhöhung der Konzentration von D-Glucono-1,5-lacton senkt allmählich den pH-Wert, was notwendig ist, da eine sofortige Absenkung des pH-Werts die Ultrastruktur der Probe verändert.

  1. Bereiten Sie 1 ml des Imaging-Puffers vor, indem Sie die folgenden Zutaten mischen: 900 μl Glukose (1 g/ml Glukose in 1x DPBS), 50 μl Glukoseoxidase (0,5 mg/ml in 1x DPBS) und 50 μl Katalase (40 μg/ml in 1x DPBS).
  2. Entfernen Sie das 1x DPBS mit einer Pipette aus der Probe und geben Sie 1 ml des Bildgebungspuffers in die Schale, die die Zellen enthält.
  3. Montieren Sie die Schüssel auf dem Tisch eines SMLM-fähigen Mikroskops. Verwenden Sie ein Objektiv mit hoher NA und eine hohe optische Vergrößerung.
  4. Lokalisieren Sie einen der ausgewählten Kerne (aus Schritt 3.15) anhand des Koordinatensystems der Schüssel und zentrieren Sie ihn im Sichtfeld der Kamera.
    HINWEIS: Die enzymatische Reaktion dauert ~60-180 Minuten, bis der richtige pH-Wert für die fBALM-Methode erreicht ist und ein angemessenes Blinken ermöglicht. Es wird empfohlen, die Beobachtungsschale so schnell wie möglich zu montieren, damit sich die Probe ausreichend an die Temperatur des Instruments anpassen kann, da Temperaturänderungen zu axialer Drift führen können. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur in dem Raum, in dem sich das SMLM-Mikroskop befindet, während der gesamten Messung stabil ist.
  5. Bestimmen Sie die Höhe des Zellkerns, indem Sie den Fokus mit dem Z-Antrieb des Mikroskops ändern und die Position der oberen und unteren Grenze aufzeichnen.
  6. Überprüfen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten, ob der fBALM-Prozess durch Erhöhen der Laserleistung das richtige Blinken hervorruft. Sobald die Probe ein korrektes stochastisches Blinken zeigt, beginnen Sie mit der Aufnahme der Bildreihe, die für die Rekonstruktion des superaufgelösten SMLM benötigt wird.
    HINWEIS: Das für fBALM verwendete Mikroskop sollte mit Anregungslasern ausgestattet sein, die geeignet sind, das verwendete Fluorophor anzuregen, und die ausreichend hohe Photonendichten erzeugen können, um eine ausreichende Photonenzahl pro Bild zu gewährleisten. Testen Sie dies in einem Pilotversuch vor allen anderen Experimenten.
  7. Sobald das korrekte Blinken des fBALM-Prozesses sichergestellt ist, beginnen Sie die Aufnahme der Bildserie mit einer Belichtungszeit von 50 ms, was zu einer Bildrate von ~20 fps führt.
  8. Nehmen Sie einen Z-Stack durch den Kern (um den Mittelteil herum) mit 200 nm-Schrittintervallen und nur 500 Bildern pro optischem Lichtschnitt. Zurück in der Mitte des Abschnitts nehmen Sie eine Bildserie von 50.000 Bildern auf, um genügend Blinkereignisse für eine gute Rekonstruktion struktureller Details mit hoher Lokalisierungsgenauigkeit zu sammeln (dies dauert ~45 Minuten).
    HINWEIS: Der Z-Stack ist wichtig, um den Anteil des DNA-Signals im mittleren Abschnitt in Bezug auf den gesamten Zellkern zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die effektive Pixelgröße gut für SMLM22 geeignet ist und das Signal an der Kamera den Sensor nicht überlastet.
  9. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Anforderungen erfüllt sind
    1. Stellen Sie sicher, dass der Erfassungscomputer über genügend Speicherplatz verfügt, da die Dateigrößen der Bildstapel je nach Anzahl und Größe von 16-Bit-Bildern recht groß werden können.
    2. Stellen Sie sicher, dass der Computer, auf dem die Erfassungssoftware ausgeführt wird, ein Dateisystem auf dem verwendeten Speichergerät verarbeiten kann, das große Dateigrößen (>4 GB) verarbeiten kann, und dass die Übertragungsrate auf das Speichergerät ausreichend hoch ist, um die Dateien in Echtzeit zu schreiben, wenn Bilddaten direkt auf dem Speichergerät aufgezeichnet werden.
    3. Wenn Sie die Daten nach der Bildaufnahme speichern, stellen Sie sicher, dass der Computer mit ausreichend RAM (z.B. 64 GB) ausgestattet ist.

5. Vorbereitung und Aufnahme einer Schale mit fluoreszierenden Kügelchen für die Z-Kalibrierung des SMLM-Mikroskops

HINWEIS: Für eine korrekte axiale Kalibrierung der astigmatischen Linsen des Mikroskops, um die richtigen Positionen entlang der optischen Achse zuzuweisen, sollte die Aufzeichnung von Z-Stapeln aus fluoreszierenden 100-nm-Kügelchen in Betracht gezogen werden.

  1. Verdünnen Sie die Kügelchen 1:10.000 in 1x DPBS und säen Sie die 100-nm-Kügelchen auf die gleiche Art von Schale, die für die SMLM-Messungen verwendet wird.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur die beste optische Qualität und Spezifikationen wie z. B. #1.5 Deckgläser.
  2. Montieren Sie die Kalibrierschale auf das Mikroskop. Zeichnen Sie Bildstapel durch die Fokusebene der Kügelchen auf (insgesamt ~1,5 μm; hier werden 10 nm-Schritte verwendet)15.
  3. Übertragen Sie die Daten auf den Datenanalyserechner.
    HINWEIS: Lagern und verwenden Sie die Kalibrierungsobjektträger nicht über einen längeren Zeitraum.

6. SMLM-Datenverarbeitung

HINWEIS: Für die Registrierung der Lokalisierungen wurde das ImageJ23 Plug-in "ThunderSTORM"24 verwendet (z.B. Umwandlung der blinkenden Punkte im Bildstapel in eine Liste mit Lokalisierungskoordinaten, Frame-Nummer, etc.). ImageJ oder Fiji25 läuft auf allen gängigen Desktop-Betriebssystemen (Linux/Windows/macOS) und kann kostenlos heruntergeladen und genutzt werden.

  1. Um ThunderSTORM in Fidschi zu verwenden, stellen Sie sicher, dass Sie die Update-Site des Hohlbein Lab unter HELP | Aktualisieren | Manage Update Sites, aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Hohlbein Lab und starten Sie Fiji neu. Stellen Sie sicher, dass das Programm über ausreichend Arbeitsspeicher verfügt.
    HINWEIS: Die Bilddaten müssen in einem Dateiformat vorliegen, das von ImageJ/Fiji gelesen werden kann. Wenn Sie die Daten auf einem kommerziellen Standardsystem aufzeichnen, öffnen Sie die Daten direkt mit dem Bio-Formate-Plug-in für ImageJ (das automatisch mit Fiji geliefert wird). In diesem Fall wurde ein MATLAB-Skript h52tif.m (bereitgestellt auf der GitHub-Seite, die am Anfang des Protokolls erwähnt wurde) verwendet, um die von unserem benutzerdefinierten Setup aufgezeichneten Daten aus dem hdf5-Format in das TIFF-Format zu konvertieren.
    1. Abhängig von der Menge an verfügbarem Speicher auf dem verwendeten System und der Anzahl der aufzuzeichnenden Frames teilen Sie die Daten in mehrere Substacks auf, um zu vermeiden, dass der Arbeitsspeicher knapp wird.
      HINWEIS: Im Folgenden werden die Einstellungen verwendet, die für die Extraktion der im Ergebnisbereich angezeigten Daten verwendet wurden. Eine ausführlichere Erläuterung der ThunderSTORM-Einstellungen finden Sie in den ThunderSTORM-Tutorials, die online zu finden sind.
  2. Optimieren Sie die Einstellungen für die Erkennung von Blinksignalen, indem Sie die ThunderSTORM-Einstellungen an die gewünschten Aufnahmebedingungen anpassen. Klicken Sie auf ThunderSTORM | Analyse ausführen, wählen Sie Kamera-Setup und geben Sie die korrekte Pixelgröße der Bilddaten, die A/D-Anzahl, die Quanteneffizienz der verwendeten Kamera, den Basispegel und die EM-Verstärkung ein (für dieses Setup Pixelgröße: 65 nm, A/D-Anzahl: 0,64, Quanteneffizienz: 0,8).
  3. Wählen Sie als Nächstes den Algorithmus aus, um die Lokalisierungskoordinaten zu bestimmen, indem Sie die Blinksignale anpassen. Verwenden Sie im Abschnitt "Bildfilterung" den Wavelet-Filter (B-Spline) mit einer B-Spline-Dimension von 3 und einer B-Spline-Skala 2.0. Legen Sie für die anderen Einstellungen die Methode "Ungefähre Lokalisierung von Molekülen" auf "Lokales Maximum", den Schwellenwert für die Spitzenintensität auf 2*std(Wave.F1) und die Konnektivität auf "8-Nachbarschaft" fest. Wählen Sie im Abschnitt Subpixel-Lokalisierung von Molekülen PSF: Integrierter Gauß, Anpassungsradius [px]: 3, Anpassungsmethode: Maximale Wahrscheinlichkeit und Anfangssigma [px]: 1,6 aus.
  4. Führen Sie das Plug-In aus, um eine Tabelle zu erstellen, die einen Eintrag für jede erkannte Lokalisierung und deren Eigenschaften enthält. Speichern Sie die Tabelle auf der Festplatte.
  5. Wenn mehrere Bildstapel analysiert werden müssen oder die Bildstapel in mehrere Stapel aufgeteilt werden müssen (z. B. um die Analyse großer Datensätze zu ermöglichen oder falls nicht viel Speicher auf dem Datenanalysecomputer verfügbar ist), automatisieren Sie die Lokalisierungserkennung, indem Sie ein Makro ausführen.
  6. Wenn die Erfassungsdaten in mehrere Bildstapel partitioniert werden mussten, verketten Sie die Lokalisierungstabellen in ThunderSTORM, indem Sie eine Datei nach der anderen importieren. Stellen Sie sicher, dass die Option An aktuelle Tabelle anhängen im Menü Import aktiviert ist und dass die korrekte Startnummer verwendet wird, um ein Überschreiben von Lokalisierungen in der Tabelle zu vermeiden.
  7. Nachdem die vollständige Lokalisierungstabelle erstellt wurde, überprüfen Sie das Ergebnis, indem Sie das Bild aus den Positionen in der Ergebnistabelle rekonstruieren. Drücken Sie die Schaltfläche Visualisierung im ThunderSTORM-Ergebnisfenster und warten Sie, bis das rekonstruierte Bild (z. B. Histogramm der Lokalisierungen) angezeigt wird.
  8. Überprüfen Sie das rekonstruierte Bild auf Probleme wie laterale Drift und andere Bildartefakte. Messen und korrigieren Sie die Drift im Untermenü Drift , indem Sie die Kreuzkorrelation der summierten Teilabschnitte des Datenstapels (hier verwendet) bestimmen oder Passermarken in der Stichprobe verwenden. Nach dem Drücken des Menüs >> geben Sie 5 Bins und den Vergrößerungsfaktor (6,5 in diesem Protokoll) ein. Warten Sie, bis ein Fenster mit der X- und Y-Drift angezeigt wird.
    HINWEIS: Die ersten Bilder nach der Aufnahme können noch unter einer starken Hintergrundfluoreszenz leiden (während die Fluorophore in den dunklen Zustand versetzt werden); Daher kann es notwendig sein, die ersten paar hundert Bilder von der Analyse auszuschließen (geben Sie z.B. "Frame >500" in das Filterfeld im ThunderSTORM-Hauptfenster ein).
  9. Um eine Überzählung von Signalen zu vermeiden, die über mehrere aufeinanderfolgende Frames sichtbar sind, wenden Sie die Zusammenführung auf die Lokalisierungsdaten an, indem Sie einen Radius verwenden, der die durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit (hier 20 nm ), 1 Dark Frame und 0 Max Frames (keine Einschränkung der maximalen Einschaltzeit eines Moleküls) berücksichtigt.
  10. Wenn nur ein dünner lichtoptischer ultradünner Schnitt analysiert werden muss, schließen Sie alle Lokalisationen oberhalb und unterhalb der Fokusebene aus dem Datensatz aus. Suchen Sie zunächst nach dem Punkt in z, der die meisten Lokalisierungen enthält, indem Sie in dem Fenster mit der Ergebnistabelle auf Histogramm plotten drücken, und verwerfen Sie dann die Lokalisierungen 50 nm über und unter diesem Punkt, indem Sie den Filterbefehl verwenden:
    z > "Histogramm Peak" - 50 & z < "Histogramm Peak" + 50
  11. Um den DNA-Anteil im aufgezeichneten Schnitt zu bestimmen, bestimmen Sie die Lokalisationen in jeder Ebene des Bildstapels (Dicke 200 nm; 100 nm auf jeder Seite), die in Schritt 4.7.1 aufgezeichnet wurden. Öffnen Sie die erste Lokalisierungsergebnistabelle des Stacks, indem Sie Plug-ins | GewitterSTURM | Import/Export | Importieren Sie die Ergebnisse und filtern Sie jede aufgezeichnete Schicht auf 200 nm. Klicken Sie dazu nach dem Tippen in das Filterfeld auf Übernehmen:
    z > -100 & z < 100
  12. Klicken Sie auf Visualisierung und wählen Sie die Option Histogramme , um ein Bild von jedem Slice zu generieren. Speichern Sie das resultierende Bild in einem Ordner im TIFF-Format. Schließen Sie alle geöffneten Bilder. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bildebenen.
  13. Öffnen Sie alle Slices, und kombinieren Sie sie mit Bild | Stapel | Bilder zum Stapeln. Bild auswählen | Stapel | Z-Projizieren, und wählen Sie die Option Summe aus. Öffnen Sie den ROI-Manager in ImageJ (Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager); Wählen Sie dann das Polygonauswahlwerkzeug aus der ImageJ-Symbolleiste im ImageJ-Hauptfenster und skizzieren Sie den Kern. Klicken Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen.
    1. Klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest , und wählen Sie Integrierte Dichte aus. Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Öffnen Sie in ThunderSTORM die Ergebnistabelle der Mittelebene wie oben beschrieben und filtern Sie diese auf eine Dicke von 100 nm , indem Sie den folgenden Befehl im Filterfeld verwenden:
      z > -50 & z < 50
  14. Generieren Sie wie oben beschrieben ein Histogramm der gefilterten Lokalisierungen, aktivieren Sie den definierten ROI, indem Sie ihn im ROI-Manager auswählen und klicken Sie auf Analysieren | Messen.
  15. Bestimmen Sie den Anteil der Lokalisationen im 100 nm dicken Mittelteil im Verhältnis zur Gesamtzahl der Lokalisationen, indem Sie die gemessenen integrierten Dichten dividieren - der Umrechnungsfaktor, der in Schritt 8.2 zur Berechnung der absoluten DNA-Dichten benötigt wird.
    HINWEIS: Der DNA-Gehalt ist proportional zur Anzahl der Lokalisationen. Um den Anteil der DNA in dem abgebildeten superauflösenden Bild (mittlerer Abschnitt) zu schätzen, ist es daher ausreichend, die Gesamtzahl der Lokalisationen über das gesamte Volumen des gesamten Zellkerns zu bestimmen und die Gesamtzahl der Lokalisationen in dem interessierenden Abschnitt zu bestimmen. Dies kann durch die Generierung von 2D-Histogrammen der Lokalisierungen erreicht werden.

7. Z-Kalibrierung des SMLM-Mikroskops

  1. Öffnen Sie die in Abschnitt 5 in Fidschi aufgezeichneten Bildstapel.
  2. Wählen Sie im ThunderSTORM-Plugin-Menü das Untermenü 3D-Kalibrierung | Kalibrierung der zylindrischen Linse.
  3. Geben Sie die Schrittweite ein, mit der die Kalibrierungsdaten aufgezeichnet werden (10 nm), und definieren Sie den Bereich des Bildstapels, der für die Kalibrierung verwendet wird.
  4. Geben Sie einen Speicherort für die Kalibrierungsdatei an.
  5. Verwenden Sie die Kalibrierungsdaten im Dialogfenster "Analyse ausführen", indem Sie im Bedienfeld "Subpixel-Lokalisierung von Molekülen" die Option "PSF: Elliptischer Gauß (3D-Astigmatismus)" auswählen und den Dateipfad an die in Abschnitt 5 erstellte Kalibrierungsdatei anpassen.

8. Voronoi-Tessellation

HINWEIS: Nachdem die Lokalisierungstabelle erstellt und bereinigt wurde, fahren Sie mit dem letzten Schritt der Bildanalyse fort - der Voronoi-Tessellation. Verwenden Sie für diesen Schritt MATLAB 2021. Die MATLAB-Skripte sind Teil des Softwarepakets "Localization Analyzer for Nanoscale Distributions" (LAND) und können über die Links in der Materialtabelle heruntergeladen werden. Ähnlich wie bei der Aufzeichnung der Daten und der Generierung der Lokalisierungstabelle ist es wichtig, ein System zu verwenden, das gut mit Speicher und Rechenleistung ausgestattet ist. Das System, mit dem die Bilder für diese Publikation generiert wurden, war mit 128 GB RAM und einer 9-Kern-Intel-i9-CPU ausgestattet.

  1. Konvertieren Sie die Lokalisierungstabelle von ThunderSTORM aus dem .csv-Format in das Orte-Format , indem Sie das MATLAB-Skript "TS2Orte.m" ausführen, das die Lokalisierungstabelle in eine MATLAB-Matrix umwandelt und im Format ".mat" speichert.
  2. Sobald die Daten das richtige Format haben, beginnen Sie mit den Vorbereitungen für die Voronoi-Tessellation und die Berechnung der DNA-Dichte. Berechnen Sie den Umrechnungsfaktor, indem Sie die Anzahl der Basenpaare im Zellkern durch die relative Anzahl der Lokalisationen im abgebildeten Schnitt in Bezug auf das Volumen dividieren (siehe Schritt 6.15). Öffnen Sie in den Ordner LAND-Voronoi und im Unterordner /coreAlgorithm die Datei voronoiCluster.m und passen Sie den Umrechnungsfaktor für die Berechnungen der absoluten Dichte in Zeile 13 an.
    ANMERKUNG: Siehe Abbildung 5 für ein Beispiel des G1 HeLa-Kerns; Es wurde ein Umrechnungsfaktor von 265 gemessen.
  3. Bearbeiten Sie das Skript, das die Analyse "VonoRoi.m" startet. Passen Sie den Dateipfad an die Orte-Lokalisierungsdaten und den Ausgabeordner für die Ergebnisdateien an. Geben Sie in der Koordinatenliste die Koordinaten an, die den Bereich definieren, in dem die Tessellation durchgeführt werden soll. Da die Berechnung der Voronoi-Tessellation sehr lange dauern kann (abhängig von den Spezifikationen des verwendeten Computers), definieren Sie mehrere zu berechnende Bereiche innerhalb desselben Eingabedatensatzes.
  4. Suchen Sie nach dem Ausführen des Skripts nach dem Bild, das die absoluten DNA-Dichten zeigt, zusammen mit anderen Dateien, die Diagramme enthalten, die das Histogramm der Flächenverteilung zeigen, und einer "densities.mat"-Datei, die die Dichten jeder einzelnen berechneten Voronoi-Zelle im Ausgabeordner enthält.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der in Abbildung 5 gezeigte HeLa-Kern wurde aus der von CellProfiler4.2.1 in Abschnitt 3 erstellten Tabelle ausgewählt, um eine integrierte Fluoreszenzintensität nahe dem ersten Peak im in Abbildung 5 gezeigten Histogramm zu haben, der die Kerne in der G1-Phase darstellt. Aufgrund seiner geringen Größe und ausgeprägten inneren Struktur ist es wahrscheinlich, dass es sich um einen frühenG1-Kern handelt, der ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird beschrieben, wie die absolute DNA-Dichte in Säugetierzellkernen mit SMLM gemessen werden kann. Darüber hinaus haben wir gezeigt, wie man das Zellzyklusstadium von kultivierten Zellen bestimmen kann und wie man diese Informationen nutzen kann, um die Menge an DNA abzuschätzen, die in einem helloptischen Ultradünnschnitt vorhanden ist. Ebenfalls ausführlich beschrieben werden die Vorbereitung adhärenter Zellen für die fBALM SMLM-Mikroskopie und die Verarbeitung von S...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Sandra Ritz für die Erlaubnis, die IMB Imaging Core Facility zur Verfügung zu stellen, Dr. Shih-Ya Chen für die Erlaubnis, uns ihr speziell angefertigtes SMLM-Mikroskop zur Verfügung zu stellen, Dr. Leonard Kubben (IMB) für die Bereitstellung humaner Fibroblasten, Dr. Christof Niehrs (IMB) für die Bereitstellung der C3H10T1/2-Zelllinie und Dr. Jan Neumann für das MATLAB-Skript, das wir für diese Arbeit modifiziert haben. Wir danken auch Dr. Marion Cremer, Dr. Thomas Cremer und Dr. Christoph Cremer für die fruchtbaren Gespräche.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zellkultur
&Micro;-Schüssel 35 mm, hoher Gitter-500 GlasbodenIbidi81168
C3H 10T1/2IMB (Niehrs Lab)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSLebenstechnologien16000-044
HelaMikroskopie-Kernanlage (IMB)
HFBIMB (Kubben Lab)
L-GlutaminSigma-AldrichG7513
Nicht-essentielle Aminosäuren und Vitamine für HFB
NatriumpyruvatS8636
Sample Prep
KatalaseMerck2593710
TraubenzuckerThermoFisher241922500
GlukoseoxidaseMerck49180
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
RNase-CocktailThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
TetraSpeck Fluoreszierende Mikrosphären-Sampler-KitThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
Software
BioFormateOpenMicroscopy.orgOpen-Source-Software https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.orgOpen-Source-Software https://cellprofiler.org
Fidschinih.govOpen-Source-Software https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
LANDnih.govOpen-Source-Software https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Mathematische WerkeKommerzielle Software – benötigt "Image Processing Toolbox"
R v.4.. 0.3r-project.orgOpen-Source-Software https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3Open-Source-Software https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Mikroskope:
AF 7000Leica
Leica-SchäferhundLeica
SMLM-MikroskopCremer-Labormaßgeschneidert von Dr. S-Y. Chen

References

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