Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.
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Methodenartikel
Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die ersten Schritte der Herzentwicklung implizieren drastische Veränderungen im Zellverhalten und in der Zelldifferenzierung. Während die Analyse von fixierten Embryonen es ermöglicht, bestimmte Entwicklungsstadien in einem Standbild im Detail zu untersuchen, erfasst die Live-Bildgebung dynamische morphogenetische Ereignisse wie Zellmigration, Formveränderungen und Differenzierung, indem sie den Embryo während seiner Entwicklung abbildet. Dies ergänzt die fixe Analyse und erweitert das Verständnis dafür, wie sich Organe während der Embryogenese entwickeln. Trotz seiner Vorteile wird die Live-Bildgebung aufgrund ihrer technischen Herausforderungen selten in Mausmodellen eingesetzt. Frühe Mausembryonen sind empfindlich, wenn sie ex vivo kultiviert werden, und erfordern eine effiziente Handhabung. Um eine breitere Nutzung der Live-Bildgebung in der Entwicklungsforschung von Mäusen zu ermöglichen, wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Zwei-Photonen-Live-Mikroskopie vorgestellt, das eine langfristige Erfassung in Mausembryonen ermöglicht. Zusätzlich zum Protokoll werden Tipps zum Umgang mit Embryonen und zur Kulturoptimierung gegeben. Dies wird dazu beitragen, Schlüsselereignisse in der frühen Organogenese von Mäusen zu verstehen und das Verständnis der kardiovaskulären Vorläuferbiologie zu verbessern.
Einleitung
Das Herz bildet sich früh während der Embryogenese, um Nährstoffe in den gesamten Embryo zu pumpen, während er sich weiter entwickelt1. Bei Mausembryonen sammelt sich eineinhalb Tage nach Beginn der Gastrulation ein rudimentäres Herzorgan am vorderen Pol 2,3. Im Early Streak (ES)-Stadium dringen kardiale Vorläuferzellen im Epiblasten durch den primitiven Streifen in die entstehende mesodermale Schicht 4,5,6 ein und beginnen zum vorderen Pol zu wandern, wo sie sich differenzieren, um den primitiven Herzschlauch zu bild....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der CNIC und der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Referenz PROEX 220/15) genehmigt und entsprachen der EU-Richtlinie 2010/63/EU und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, die im spanischen Recht gemäß Real Decreto 1201/2005 durchgesetzt wurden.
Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von zwei Männchen aus der fluoreszierenden transgenen Mauslinie, die die NOTCH-Aktivität Tg(CBF:H2BVenus,+)18 melden. In der Materialtabelle finden Sie Details zu Mate....
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Ergebnisse
Wir haben das Protokoll verwendet, um die Aktivierung des NOTCH-Signalwegs in frühen kardialen Vorläuferzellen zu visualisieren, die sich während der primitiven Herzröhrenmorphogenese zu Endothelzellen differenzieren. Dazu kreuzten wir Wildtyp-C57BL/6-N-Mäuse mit Tg(CBF:H2BVenus,+)-Mäusen18 , um Embryonen zu erhalten, die NOTCH-Aktivität durch das gelb fluoreszierende Protein Venus berichteten. Bei E7.5 ist die Venusfluoreszenz im gesamten neuralen Ektoderm vorhanden, mit einigen positiven Kernen .......
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Diskussion
Frühe Herzvorläufer organisieren sich in einem primitiven Herzschlauch, der zu schlagen beginnt, während er sich noch bildet. Zu verstehen, wie dieser Prozess abläuft, ist der Schlüssel, um das breite Spektrum angeborener Herzfehler auf bestimmte morphogenetische Ereignisse zurückzuführen. Dafür bietet die Live-Bildgebung die Möglichkeit, die normale und fehlerhafte Embryonalentwicklung mit erhöhter zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, um frühe kardiale Vorläuferzellen zu untersuchen, da sie .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Kenzo Ivanovitch für seine früheren Arbeiten zu dieser Methode und der Gruppe von Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) für die Bereitstellung der ersten Expertise zur Embryonenmontage. Diese Studie wurde durch den Zuschuss PGC2018-096486-B-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und den Zuschuss H2020-MSCA-ITN-2016-722427 aus dem EU-Programm Horizon 2020 für MT und Zuschuss 1380918 aus dem FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program an JND unterstützt. MS wurde durch ein PhD-Stipendium der La Caixa Foundation (LCF/BQ/DE18/11670014) und ein Reisestipendium der Company of Biologists (DEVTF181145) unte....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| #55 Pinzette | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Schale mit Glasdeckglas Boden 14 mm Durchmesser | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm Schraubstock Tisch | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL Röhrchen | BD Falcon | 352070 | |
| Destilliertes Wasser | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | mit L-Glutamin, ohne Glukose, ohne Na Pyruvat |
| Fetales Rinderserum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluoreszierender Reporter transgene Mäuse (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM für die Bildgebung von lebenden Zellen |
| Hochvakuum-Silikonfett | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Halterung für Drähte | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Standmikroskop | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee fernroter gepulster Laser, abgestimmt auf 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detektoren, ausgestattet mit den Filtersätzen cyan-gelb (BP450-500/BP520-560), grün-rot (BP500-520/BP570-610) und gelb-rot (BP520-560/BP645-710) | Zeiss | ||
| Obj: 20x Wassertauchen 1,0 NA, großer Arbeitsabstand | Zeiss | ||
| P1000 und P200 Pipetten | |||
| Paraffinöl | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (die Endkonzentration sollte 50 μm betragen; g/mL Penicillin und 50 μ; g/mL Streptomycin) |
| Petrischalen 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipettenspitzen | |||
| Polymethylmethacrylat | Wiederverwendung von alten Laborgeräten | ||
| Ratte Serumkultur Embryo, männliche Ratten SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set mit 160 mm Feinanteilen | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1,0 mm Glaskapillaren | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| steril 0,22 μmu; m Spritzenfilter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL Spritze | Fisher | Scientific 15809152 | |
| Wolframnadeln | |||
| Ultraschall-Homogenisator (Ultraschallgerät) | Bandelin | BASO_17021 |
Referenzen
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113(2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medi....
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Nachdrucke und Genehmigungen
