Viele hochregulierte Gene stimulieren die Migration und Invasion von Tumorzellen, was zu einer schlechten Prognose führt. Es ist entscheidend zu bestimmen, welche Gene die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen der erhöhten Expression eines Gens auf die Migration und Invasion von Tumorzellen in Echtzeit zu untersuchen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Quantitative Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion nach synthetischer mRNA-Transfektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tumorzellen sind hochbeweglich und invasiv und weisen veränderte Genexpressionsmuster auf. Das Wissen, wie Veränderungen in der Genexpression die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren, ist unerlässlich, um die Mechanismen der Infiltration von Tumorzellen in benachbarte gesunde Gewebe und der Metastasierung zu verstehen. Zuvor wurde gezeigt, dass der Gen-Knockdown gefolgt von der impedanzbasierten Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion die Identifizierung der Gene ermöglicht, die für die Migration und Invasion von Tumorzellen erforderlich sind. In jüngster Zeit haben die mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 das Interesse an der Verwendung synthetischer mRNA zu therapeutischen Zwecken erhöht. Hier wurde die Methode mit synthetischer mRNA überarbeitet, um den Effekt der Genüberexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Diese Studie zeigt, dass eine erhöhte Genexpression mit synthetischer mRNA-Transfektion gefolgt von impedanzbasierter Echtzeitmessung dazu beitragen kann, die Gene zu identifizieren, die die Migration und Invasion von Tumorzellen stimulieren. Diese Methodenarbeit liefert wichtige Details zu den Verfahren zur Untersuchung des Einflusses einer veränderten Genexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen.
Einleitung
Die Motilität der Tumorzellen spielt eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung 1,2. Die Ausbreitung von Tumorzellen in benachbarte und entfernte gesunde Gewebe erschwert die Krebsbehandlung und trägt zum Rezidiv bei 3,4. Daher ist es wichtig, die Mechanismen der Tumorzellmotilität zu verstehen und entsprechende therapeutische Strategien zu entwickeln. Da viele Tumorzellen veränderte Genexpressionsprofile aufweisen, ist es wichtig zu verstehen, welche Veränderungen im Genexpressionsprofil zu einer veränderten Tumorzellmotilität führen
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Synthese von mRNA
HINWEIS: Für die mRNA-Synthese müssen alle Reagenzien und Geräte speziell behandelt werden, um die RNasen vor der Verwendung zu inaktivieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
- Linearisierung der DNA
ANMERKUNG: Maus-cDNAs von CrkI und CrkL wurden in den pFLAG-CMV-5a-Expressionsvektor kloniert, um den FLAG-Epitop-Tag am C-Terminus hinzuzufügen, und in den pcDNA3.1/myc-Him-Vektor subkloniert, um den T7-Promotor einzubauen, wie zuvor beschrieben
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Crk- und CrkL-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Motilität vieler Zelltypen, darunter Neuronen22, T-Zellen23, Fibroblasten 18,19 und eine Vielzahl von Tumorzellen13. Da Crk- und CrkL-Proteine im Glioblastom24,25,26 erhöht sind, wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen der Überexpression von CrkI, einer Spleißvariante von Crk,
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Migration und Invasion sind wichtige Merkmale von Tumorzellen. Die Messung der Motilität von Tumorzellen und das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus, der die Tumorzellmotilität steuert, liefern wichtige Einblicke in therapeutische Interventionen 2,27. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Zellmigration zu untersuchen7. Der Wundheilungstest mit Kratzern oder Kultureinsätzen ist eine einfache und häufig verwendete Methode,.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken dem Medical Writing Center at Children's Mercy Kansas City für die Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von Natalies A.R.T. Foundation (an T.P.) und durch ein Stipendium des MCA Partners Advisory Board vom Children's Mercy Hospital (CMH) und dem University of Kansas Cancer Center (KUCC) (an T.P.) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose-Gel-Bildgebungssystem |
| α-Tubulin-Antikörper | Sigma | T9026 | Zum Nachweis von α-Tubulin-Protein (Verdünnung 1:3.000) |
| CIM-Platte 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Zellinvasions- und Migrationsplatten |
| Crk-Antikörper | BD Biosciences | 610035 | Zum Nachweis von CrkI- und CrkII-Proteinen (Verdünnung 1:1.500) |
| CrkL-Antikörper | Santa Cruz | sc-319 | Zum Nachweis des CrkL-Proteins (Verdünnung 1:1.500) |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Zellkulturmedium |
| Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Puffer zum Waschen von Zellen |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Hyklon | SH30910.03 | Nahrungsergänzungsmittel für Kulturmedium |
| Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2-Inkubator |
| IRDye 800CW Ziege Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper | Li-Cor | 926-32210 | Sekundärantikörper für die Western-Blot-Analyse (Verdünnung 1:10.000) |
| IRDye 800CW Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper | Li-Cor | 926-32211 | Sekundärer Antikörper für die Western-Blot-Analyse (Verdünnung 1:10.000) |
| Lithiumchlorid | Invitrogen | AM9480 | Wird für die RNA-Fällung |
| verwendet Matrigel-Matrix | Corning | 354234 | Extrazelluläre Matrix (ECM) |
| Gel MEGAscript T7 Transkriptionskit | Invitrogen | AM1334 | Wird für die RNA-Synthese |
| verwendet Millennium RNA-Marker | Invitrogen | AM7150 | Wird für die Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese |
| verwendet Mini-Zentrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Wird zum Schleudern von Zellen |
| verwendet Mausgehirn QUICK-Klon cDNA | TaKaRa | 637301 | Quelle von Genen (Inserts) für die Klonierung |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nukleinsäure-Quantifizierungssystem |
| Neon-Elektroporationssystem | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Elektroporationssystem1 |
| Neon-Transfektionssystem 10 & Mikro; L Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Elektroporationskit |
| Neon Transfektionssystem 100 & micro; L-Kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Elektroporations-Kit |
| NorthernMax Denaturierungsgelpuffer | Invitrogen | AM8676 | Wird für die Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese |
| verwendet NorthernMax Formaldehyd-Lastfarbstoff | Invitrogen | AM8552 | Wird für die Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese |
| verwendet NorthernMax Laufpuffer | Invitrogen | AM8671 | Wird für die Elektrophorese von Formaldehyd-Agarose-Gel |
| verwendet Nukleasefreies Wasser | Teknova | W3331 | Wird für verschiedene Reaktionen während der mRNA-Synthese verwendet |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager für die Western-Blot-Analyse | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | Der Vektor, in den Insertionen (CrkI- und CrkL-cDNAs der Maus) kloniert wurden |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Quelle des FLAG-Epitops |
| Tag Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol | Sigma | P2069 | Wird für die DNA-Extraktion |
| verwendet PmeI | New England BioLabs | R0560L | Wird verwendet, um die Plasmide für die mRNA-Synthese zu linearisieren |
| Poly(A)-Tailing-Kit | Invitrogen | AM1350 | Wird für die Poly(A)-Schwanzreaktion verwendet |
| Polystyrol-Gewebekulturschale (100 x 20 mm) | Corning | 353003 | Wird zur Kultivierung von Zellen vor der Transfektion |
| verwendetPolystyrol-Gewebekulturschale (35 x 10 mm) | Corning | 353001 | Wird zur Kultivierung von transfizierten Zellen |
| verwendet Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Wird verwendet, um Protein in der Reaktionsmischung |
| zu entfernen Purifier Axiom Klasse II, Typ C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosicherheitswerkbank für die sterile Handhabung von Zellen |
| Resuspensionspuffer R | ThermoFisher Scientific | Ein Puffer, der in den Elektroporations-Kits, MPK1025 und MPK10096 enthalten ist. Der Puffer wird verwendet, um Zellen vor der Elektroporation wieder aufzurichten, und seine Zusammensetzung ist eine proprietäre Information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA-Dekontaminationslösung |
| Zepter | Millipore | C85360 | Automatisierter Handheld-Zellzähler |
| ScriptCap 2'-O-Methyltransferase-Kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Wird für die Verschließreaktion |
| verwendet ScriptCap m7G Verschließsystem | Cellscript | C-SCCE0625 | Wird für die Verschließreaktion |
| verwendet Natriumdodecylsulfatlösung | Invitrogen | 15553-035 | Detergens für die Proteinase K-Reaktion |
| Sorvall Legend XT Zentrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Tischzentrifuge zum Schleudern von Zellen |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Wird zur Dissoziation von Zellen |
| verwendet U-118MG | ATCC | HTB15 | Eine adhärente Zelllinie, die von einem menschlichen Glioblastom-Patienten abgeleitet |
| Vinculin-Antikörper | Sigma | V9131 | Wird zum Nachweis des Vinculin-Proteins (Verdünnung 1:100.000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument für die Echtzeit-Zellanalyse |
| verwendet1Elektroporationsparameter und andere verwandte Informationen für verschiedene Zelllinien sind auf der Homepage des Herstellers (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?) verfügbar. |
Referenzen
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
