Method Article

Mechanostimulation mehrzelliger Organismen durch ein mikrofluidisches Kompressionssystem mit hohem Durchsatz

DOI:

10.3791/64281

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Charakterisierung eines mikrofluidischen Systems, das in der Lage ist, Hunderte von Drosophila melanogaster-Embryonen mit minimalem Benutzereingriff auszurichten, zu immobilisieren und präzise zu komprimieren. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung und Rückgewinnung von Proben für die Analyse nach der Stimulation und kann skaliert werden, um andere mehrzellige biologische Systeme aufzunehmen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während der Embryogenese erzeugt die koordinierte Zellbewegung mechanische Kräfte, die die Genexpression und -aktivität regulieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Werkzeuge wie Aspiration oder Deckglaskompression verwendet, um ganze Embryonen mechanisch zu stimulieren. Diese Ansätze schränken das experimentelle Design ein, da sie ungenau sind, manuelle Handhabung erfordern und nur ein paar Embryonen gleichzeitig verarbeiten können. Mikrofluidische Systeme haben großes Potenzial, solche experimentellen Aufgaben zu automatisieren und gleichzeitig den Durchsatz und die Präzision zu erhöhen. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches System, das entwickelt wurde, um ganze Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen) Embryonen präzise zu komprimieren. Dieses System verfügt über Mikrokanäle mit pneumatisch betätigten verformbaren Seitenwänden und ermöglicht die Ausrichtung des Embryos, die Immobilisierung, die Kompression und die Entnahme nach der Stimulation. Durch die Parallelisierung dieser Mikrokanäle in sieben Bahnen können stetige oder dynamische Kompressionsmuster auf Hunderte von Drosophila-Embryonen gleichzeitig angewendet werden. Die Herstellung dieses Systems auf einem Glasdeckglas ermöglicht die gleichzeitige mechanische Stimulation und Bildgebung von Proben mit hochauflösenden Mikroskopen. Darüber hinaus ermöglichen die Verwendung biokompatibler Materialien wie PDMS und die Fähigkeit, Flüssigkeit durch das System zu fließen, Langzeitexperimente mit medienabhängigen Proben. Dieser Ansatz eliminiert auch die Notwendigkeit einer manuellen Montage, die die Proben mechanisch belastet. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, schnell Proben aus den Mikrokanälen zu entnehmen, Post-Stimulationsanalysen, einschließlich -omics-Assays, die große Probenzahlen erfordern, die mit herkömmlichen mechanischen Stimulationsansätzen nicht erreichbar sind. Die Geometrie dieses Systems ist leicht auf verschiedene biologische Systeme skalierbar, so dass zahlreiche Felder von den hier beschriebenen funktionellen Merkmalen profitieren können, einschließlich eines hohen Probendurchsatzes, mechanischer Stimulation oder Immobilisierung und automatisierter Ausrichtung.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lebende Systeme erleben und reagieren während ihrer gesamten Lebensdauer ständig auf verschiedene mechanische Eingaben1. Mechanotransduktion wurde mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsstörungen, Muskel- und Knochenschwund und Neuropathologien durch Signalwege, die direkt oder indirekt von der mechanischen Umgebung beeinflusst werden2. Die Gene und Proteine, die durch mechanische Stimulation3 in den mechanosensitiven Signalwegen4 reguliert werden, bleiben jedoch weitgehend unbekannt5, was die Aufklärung der mechanischen Regulationsmechanismen und die Identifizierung molekularer Ziele für Erkrankungen im Zusammenhang mit pathologischer Mechanotransduktion verhindert 6,7 . Ein limitierender Faktor bei der Projektion mechanobiologischer Studien auf die damit verbundenen physiologischen Prozesse ist die Verwendung einzelner Zellen mit herkömmlichen Kulturschalen anstelle intakter mehrzelliger Organismen. Modellorganismen wie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben wesentlich zum Verständnis der Gene, Signalwege und Proteine beigetragen, die an der Tierentwicklung beteiligt sind 8,9,10. Dennoch wurde die Verwendung von Drosophila und anderen mehrzelligen Modellorganismen in der mechanologischen Forschung durch Herausforderungen mit experimentellen Werkzeugen behindert. Konventionelle Techniken zur Vorbereitung, Sortierung, Bildgebung oder Anwendung verschiedener Reize erfordern meist manuelle Manipulation; Diese Ansätze sind zeitaufwendig, erfordern Fachwissen, führen zu Variabilität und begrenzen das experimentelle Design und die Stichprobengröße11. Jüngste mikrotechnologische Fortschritte sind eine großartige Ressource, um neuartige biologische Assays mit sehr hohem Durchsatz und streng kontrollierten experimentellen Parameternzu ermöglichen 12,13,14.

Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung eines verbesserten mikrofluidischen Geräts zur Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen Anwendung mechanischer Stimulation in Form von uniaxialer Kompression auf Hunderte von ganzen Drosophila-Embryonen 15 (Abbildung 1). Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem Glasdeckglas ermöglichte eine hochauflösende konfokale Bildgebung der Proben während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch eine schnelle Entnahme der Embryonen nach der Stimulation für laufende -omics-Assays (Abbildung 2). Erläuterungen zu den Designüberlegungen dieser Vorrichtung sowie zur Herstellung unter Verwendung von Softlithographie und experimenteller Charakterisierung werden hierin beschrieben. Da die Herstellung einer Siliziumwaferform aus einer solchen Vorrichtung eine gleichmäßige Beschichtung von dickem Fotolack (Dicke >200 μm) über große Flächen mit Gräben mit hohem Aspektverhältnis (AR >5) erfordert, modifizierte diese Methode das traditionelle photolithografische Formherstellungsprotokoll erheblich. Auf diese Weise erleichterte dieses Verfahren die Handhabung, Haftung, Beschichtung, Strukturierung und Entwicklung des Fotolacks. Darüber hinaus werden mögliche Fallstricke und deren Lösungen diskutiert. Schließlich wurde die Vielseitigkeit dieser Design- und Herstellungsstrategie anhand anderer mehrzelliger Systeme wie Drosophila-Eikammern und Gehirnorganoiden demonstriert16.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Siliziumwaferform

  1. Reinigen Sie den Siliziumwafer (siehe Materialtabelle) zuerst mit Aceton und dann mit Isopropylalkohol (IPA).
  2. Legen Sie den Siliziumwafer für 30 Minuten auf eine 250 °C heiße Heizplatte, um ihn zu dehydrieren (Abbildung 3A).
  3. Beschichten Sie den Siliziumwafer mit Hexamethyldisilazan (HDMS) in einem Vapor-Prime-Ofen (siehe Materialtabelle) (Prozesstemperatur: 150 °C, Prozessdruck: 2 Torr, Prozesszeit: 5 min, HDMS-Volumen: 5 μL) (Abbildung 3B).
  4. Eine Flasche SU-8 2100 Fotolack (siehe Materialtabelle) für 15 min in einen 60 °C heißen Ofen stellen, um die Viskosität zu reduzieren.
    HINWEIS: Beim Erhitzen im Ofen nimmt die Viskosität des Fotolacks ab. Fotolacke mit gesenkter Viskosität können einfacher gehandhabt und genauer auf den Wafer gegossen werden.
  5. Legen Sie den Siliziumwafer auf eine 60 °C heiße Heizplatte und gießen Sie 1 ml des erhitzten Fotolacks für jeden Zoll des Wafers, bis der Fotolack den größten Teil der Oberfläche bedeckt (Abbildung 3C).
  6. Übertragen Sie den photolackbeschichteten Siliziumwafer auf einen Spin-Coater (siehe Materialtabelle).
  7. Wenden Sie den Pre-Spin zuerst bei 250 U/min für 30 s und dann bei 350 U/min für weitere 30 s an, beide mit 100 U/min Beschleunigung (Abbildung 3D).
  8. Entfernen Sie den überschüssigen Fotolack von den Rändern des Siliziumwafers mit einem Reinraumtupfer.
  9. Wenden Sie einen Spin zuerst bei 500 U/min für 15 s mit 100 U/min Beschleunigung und dann bei 1450 U/min für 30 s mit 300 U/min Beschleunigung an (Abbildung 3E).
  10. Entfernen Sie die Randwulst mit einem Reinraumtupfer.
  11. Platzieren Sie den Siliziumwafer auf einer 50 °C heißen Heizplatte und sprühen Sie Aceton auf den Wafer, um Unvollkommenheiten zu entfernen und eine gleichmäßige Beschichtung zu fördern (Abbildung 3F).
  12. Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte langsam auf 95 °C mit einer Rate von 2 °C / min.
  13. Weichbacken Sie den Siliziumwafer bei 95 °C für 50 min (Abbildung 3G).
  14. Kühlen Sie die Heizplatte langsam auf Raumtemperatur mit einer Rate von 2°C/min ab.
  15. Legen Sie den Siliziumwafer auf einen Masken-Aligner (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Fotomaske darauf (siehe ergänzende Abbildung 1 für die Photomaskengeometrie).
  16. Besetzen Sie den Siliziumwafer 350 mJ/cm 2 UV-Licht (35 mW/cm2 für 10 s) durch die Fotomaske mit dem Kontaktmasken-Aligner aus (Abbildung 3H).
  17. Tragen Sie aufeinanderfolgende Nachbelichtungsbacken auf den Siliziumwafer auf, indem Sie den Wafer für 5 min bei 50 °C, weitere 5 Minuten bei 65 °C und schließlich weitere 20 min bei 80 °C auf eine Heizplatte legen (Abbildung 3I).
  18. Kühlen Sie den Siliziumwafer langsam auf Raumtemperatur mit einer Rate von 2 °C/min ab.
  19. Legen Sie einen Magnetrührer mit einem etwas kleineren Durchmesser als der Siliziumwafer in ein Becherglas. Drehen Sie den Siliziumwafer auf den Kopf und legen Sie ihn auf das Becherglas.
  20. Stellen Sie das Becherglas in ein anderes größeres Becherglas und füllen Sie das größere Becherglas mit einer frischen Entwicklerlösung (siehe Materialtabelle). Lassen Sie den Siliziumwafer 30 Minuten bei eingeschaltetem Rührer in den Behälter eintauchen (Abbildung 3J).
  21. Übertragen Sie den Siliziumwafer für 1 h bei 40 kHz in einen Ultraschallbadsonikator, der mit dem frischen Entwickler gefüllt ist (Abbildung 3K).
  22. Waschen Sie den Siliziumwafer gründlich mit einer IPA-Lösung, um die endgültige Siliziumwaferform zu erhalten (Abbildung 3L).

2. Herstellung des mikrofluidischen Chips

  1. Legen Sie die Siliziumwaferform zusammen mit 10 Tropfen (~ 500 μL) Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan (PFOCTS, siehe Materialtabelle) in ein kleines Wiegeboot in der Nähe.
  2. Schließen Sie den Exsikkator für 30 Minuten an eine Vakuumpumpe bei ca. 200 Torr an.
  3. Schalten Sie das Exsikkatorventil aus und trennen Sie die Vakuumpumpe über Nacht für die PFOCTS-Beschichtung.
  4. Die vorvernetzte Lösung aus Polydimethylsiloxan (PDMS) wird hergestellt, indem die PDMS-Base mit dem Härter (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 10:1 gemischt wird.
  5. Entgasen Sie das Gemisch, indem Sie es in eine Zentrifuge geben (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur).
    HINWEIS: Durch diese Zentrifugation können Blasen auf die Oberseite wandern und somit in kurzer Zeit entfernt werden.
  6. Gießen Sie die entgaste PDMS-Lösung auf die Siliziumwaferform.
  7. Entgasen Sie es erneut, um die auf der Formoberfläche eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
  8. Das PDMS wird in einem 60-°C-Ofen für 1 h und 50 min ausgehärtet (Abbildung 3M).
  9. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Ränder des ausgehärteten PDMS-Bereichs entsprechend der mikrofluidischen Chipgeometrie zu schneiden (Abbildung 3N).
  10. Schälen Sie das PDMS-Teil und legen Sie es kopfüber auf eine Schneidematte.
  11. Schneiden Sie das PDMS-Teil mit einem Rasiermesser in seine endgültige Form (Abbildung 3O).
  12. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher am PDMS mit einem Biopsiestempel (siehe Materialtabelle) oder einer Nadel mit stumpfer Spitze (Abbildung 3P).
    1. Verwenden Sie für das Einlassloch des Embryos einen Stempel mit einem Durchmesser von 4 mm.
    2. Verwenden Sie für die Auslasslöcher des Embryos einen Stempel mit einem Durchmesser von 1,3 mm.
    3. Verwenden Sie für die Gaseinlassöffnung einen 2-mm-Stempel.
  13. Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um Partikel zu entfernen, die auf der gemusterten Oberfläche des PDMS verbleiben könnten.
  14. Reinigen Sie einen 24 mm x 60 mm großen rechteckigen Glasobjektträger zuerst mit Aceton und dann mit IPA.
  15. Trocknen Sie die Glasoberfläche mit einer Luftpistole, die an eine gefilterte Luftquelle angeschlossen ist.
  16. Tragen Sie einen Dehydrierungsbacken auf den Objektträger auf, indem Sie ihn 2 h lang auf eine 250 °C heiße Heizplatte legen (Abbildung 3Q).
  17. Decken Sie den Objektträger mit einem Becherglas ab, um eine Oberflächenkontamination zu vermeiden.
  18. Legen Sie das PDMS mit der gemusterten Seite nach oben und den dehydrierten Glasobjektträger in einen Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).
  19. Behandeln Sie das PDMS und den Objektträger 30 s lang mit Sauerstoffplasma bei 18 W.
  20. Platzieren Sie das PDMS auf dem Objektträger, dessen gemusterte Oberfläche dem Objektträger zugewandt ist, um die Mikrokanäle durch kovalente Bindung abzudichten (Abbildung 3R).
  21. Verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS-Teil vorsichtig gegen den Glasobjektträger zu drücken, um einen vollständigen Konformationskontakt zu gewährleisten.
  22. Lagern Sie den fertigen mikrofluidischen Chip über Nacht bei Raumtemperatur, damit die Verklebung ihre endgültige Festigkeit erreichen kann.

3. Vorbereitung der Fruchtfliegenembryonen

  1. Lassen Sie erwachsene Oregon-R-Fliegen Eier auf Apfelsaft-Agarplatten legen (1,5% Agar, 25% Apfelsaft, 2,5% Saccharose) und sammeln Sie die Platten zur gewünschten Entwicklungszeit nach der Eiablage für das gegebene Experiment.
    HINWEIS: Für die vorliegenden Experimente wurden die Platten nach 140 min gesammelt, um Embryonen im Zellular Stadium17 vorzubereiten und zu sortieren.
  2. Überfluten Sie den Agar mit Embryo-Eiwäsche (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) und rühren Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel, um sie vom Agar zu entfernen.
  3. Die Embryonen werden unter gelegentlichem Rühren für 90 s in eine 50%ige Bleichlösung überführt. Die Embryonen durch ein Gewebesieb abseihen und die Bleichlösung gründlich mit Wasser abwaschen.
  4. Übertragen Sie die Embryonen in eine 90 mm Glas-Petrischale mit genügend Embryo-Eiwäsche, um die Embryonen vollständig zu bedecken.
  5. Untersuchen Sie die Embryonen mit Transillumination auf einem Seziermikroskop und wählen Sie Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums für die Beladung in das mikrofluidische Gerät aus.
    HINWEIS: In dieser Anwendung wurden Embryonen im Zellularisierungsstadium ausgewählt. Die detaillierten Beschreibungen, wie die richtige Auswahl des Entwicklungsstadiums sichergestellt werden kann, finden Sie im Laborhandbuch für Drosophila17.

4. Anwendung mechanischer Stimulation auf Fruchtfliegenembryonen mit dem mikrofluidischen Chip

  1. Grundierung aller sieben embryonalen Mikrokanäle, indem sie mit 0,4 μm gefiltertem IPA durch den Haupteinlass des Embryos gefüllt werden.
  2. Ersetzen Sie IPA durch 0,4 μm gefiltertes entionisiertes (DI) Wasser.
  3. Ersetzen Sie das DI-Wasser durch eine Eiwaschlösung für den Embryo.
  4. Sammeln Sie etwa 100 vorausgewählte Embryonen aus der Glaspetrischale mit einer Glaspipette.
  5. Pipettieren Sie die Embryonen in die Eingangsöffnung des Embryos (Abbildung 4A).
  6. Anlegen Sie einen Unterdruck von etwa 3 PSI (d. H. Vakuum) an den Gaseinlass mit einer tragbaren Vakuumpumpe, um die Mikrokanäle des Embryos zu öffnen.
  7. Neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach unten, damit sich die Embryonen automatisch ausrichten und in den Mikrokanälen des Embryos absetzen (Abbildung 4B).
  8. Wenn die Mikrokanaleingänge des Embryos durch mehrere gleichzeitig eintretende Embryonen verstopft werden, neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach oben und dann wieder nach unten, um die Verstopfung zu beseitigen.
  9. Basierend auf dem erforderlichen Durchsatz werden bis zu 300 Embryonen in die Mikrokanäle des Embryos eingeführt.
  10. Sobald die Embryonenbeladung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Vakuum, um die Embryonen zu immobilisieren.
  11. Neigen Sie den mikrofluidischen Chip zurück in die horizontale Position (Abbildung 4C).
  12. Schließen Sie eine tragbare Überdruckquelle (siehe Materialtabelle) mit einem Manometer an den Gaseinlass an, um eine 3-PSI-Kompression anzuwenden (Abbildung 4D).
  13. Überprüfen Sie kontinuierlich das Manometer, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Kompressionsniveau angewendet wird.
  14. Wenn Live-Bildgebungsexperimente an den mechanisch stimulierten Embryonen durchgeführt werden, platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf einem Standard-Glasobjektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch, wobei der Gaseinlass mit der Druckquelle verbunden ist.
  15. Sobald das Kompressionsexperiment abgeschlossen ist, können die Embryonen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden. Um dies zu tun, wenden Sie zunächst das Vakuum an den Gaseinlass an, um die Embryonen zu befreien.
  16. Neigen Sie dann den mikrofluidischen Chip nach oben, damit sich die Embryonen in Richtung des Embryo-Einführungsports bewegen können (Abbildung 4E).
  17. Sammeln Sie die Embryonen aus dem mikrofluidischen Chip mit einer Glaspipette.
    HINWEIS: Nach der Entnahme können die Auswirkungen der Kompression auf die embryonale Entwicklung und Lebensfähigkeit untersucht werden, indem die Fruchtfliegen bis ins Erwachsenenalter gezüchtet werden. Die Hochdurchsatz-Verarbeitungskapazität des mikrofluidischen Geräts ermöglicht auch die Verwendung von Embryonen in nachgeschalteten Omics-basierten Assays, die eine große Anzahl von Proben erfordern (Abbildung 2).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das mikrofluidische System ist in zwei Teilkompartimente unterteilt, die durch verformbare PDMS-Seitenwände getrennt sind. Das erste Kompartiment ist das Flüssigkeitssystem, in das Drosophila-Embryonen eingeführt, automatisch ausgerichtet, aufgereiht und komprimiert werden. Das zweite Kompartiment ist ein Gassystem, bei dem der Gasdruck auf beiden Seiten der Kompressionskanäle über Dead-End-Mikrokanäle gesteuert wird, um die effektive Breite der Kompressionskanäle präzise zu steuern. Das mikrofluidische...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Artikel beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Geräts zur automatischen Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen mechanischen Stimulation von Hunderten von ganzen Drosophila-Embryonen . Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem dünnen Glasdeckglas ermöglichte die Bildgebung von Embryonen mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch die Entnahme der Embryonen direkt nach der Stimulation für nachgeschaltete biologische A...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen an den in diesem Manuskript beschriebenen Produkten und haben nichts anderes offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (CMMI-1946456), dem Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) und dem National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL dreieckige perforierte Kunststoffbecher mit 60 mm PetrischalenFisher14-955-111BPerferat mit Luftlöchern
100 mm P B < 100> 0-100 500um SSP Test Grade Si WaferUniversity Wafer452
Biopsie StanzenTed Pella15110
BleicheNicht markenspezifisch
Blunt NadelsatzCML Versorgung901
Kontaktmaske AlignerQuintelQ4000 MA
SchneidematteDahleVantage 10670Größe: 24" x 36"
EntwicklerKayaku Advance MaterialsSU-8 2000
Direct Write LithographHeidelbergMLA100
PräpariermikroskopJedes kommerziell erhältliche Präpariermikroskop mit Durchlicht
Petrischale aus GlasFisherFB0875713A
GlasobjektträgerWarner Instruments64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime OfenJa EngineeringJA-3TA
NaClNicht markenspezifisch
OfenLabnetI5110A
PinselNicht markenspezifisch
PDMSDow CorningSylgard 184
PhotoresistMicroChemSU-8 2100
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-32G
Tragbare DruckquelleHygger LeisestesHGD946
ManometerCole-ParmerEW-68950-25
Spin CoaterLaurellWS-650-8B
Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan (PFOCTS)Sigma-Aldrich448931-10G
Triton-X 100FisherAAA16046AP
SchlauchSaint-Gobain02-587-1A
UltraschallreinigerCole-ParmerUX-08895-05
VakuumpumpeCole-ParmerEW-07164-87

References

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