Mechanostimulation mehrzelliger Organismen durch ein mikrofluidisches Kompressionssystem mit hohem Durchsatz

Dieses Protokoll erklärt, wie Mikrofluidik-Technologien hergestellt und verwendet werden können, um die experimentellen Vorteile des Probendurchsatzes, der automatisierten Handhabung und der Fähigkeit, mechanische Spannungen präzise anzuwenden und gleichzeitig Proben zu visualisieren, zu nutzen. Diese Technik minimiert den manuellen Umgang mit mehrzelligen biologischen Organismen wie Embryonen und Organoiden für deren Immobilisierung, Ausrichtung und Live-Bildgebung. Es ermöglicht auch die Anwendung mechanischer Kompression auf sie für mechanobiologische Studien.

Die Herstellung von Formen mit hohem Aspektverhältnis für diesen mikrofluidischen Chip kann mit herkömmlichen Mikrofabrikationstechniken eine Herausforderung darstellen. Die in diesem Videoartikel erläuterten Tipps können diese Herausforderungen meistern. Reinigen Sie zunächst den Siliziumwafer mit Aceton und dann mit Isopropylalkohol.

Legen Sie den Siliziumwafer für 30 Minuten auf eine 250 Grad Celsius heiße Heizplatte. Zum Austrocknen backen. Beschichten Sie den Siliziumwafer mit Hexamethyldisiloxan in einem Dampfofen.

Stellen Sie eine Flasche SU-8 2100 Photolack für 15 Minuten in einen 60-Grad-Ofen, um die Viskosität zu reduzieren. Gießen Sie einen Milliliter des erhitzten Photolacks für jeden Zoll des Siliziumwafers, der auf der Heizplatte platziert ist, bis der Photolack den größten Teil der Oberfläche bedeckt. Wenden Sie Pre-Spin zuerst bei 250 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden und dann bei 350 Umdrehungen pro Minute für weitere 30 Sekunden an, beide mit einer Beschleunigung von 100 U/min pro Sekunde.

Als nächstes wenden Sie zuerst einen Spin bei 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Sekunden mit 100 U/min pro Sekunde Beschleunigung und dann bei 1.450 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden mit 300 U/min pro Sekunde Beschleunigung an. Entfernen Sie die Randwulst mit einem Reinraumtupfer und sprühen Sie Aceton auf den Wafer, um Unvollkommenheiten zu entfernen und eine gleichmäßige Beschichtung zu fördern. Setzen Sie den Silikonwafer durch die Fotomaske 350 Millijoule pro Zentimeter quadratischem UV-Licht aus.

Verwenden Sie den Kontaktmasken-Aligner, tragen Sie den Silikonwafer nach der Belichtung auf und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Stellen Sie das Becherglas in ein anderes größeres Becherglas und füllen Sie das größere Becherglas mit einer neuen Entwicklerlösung. Legen Sie ein Metallgitter auf das Becherglas.

Platzieren Sie den Siliziumwafer kopfüber auf dem Metallgewebe. Lassen Sie den Siliziumwafer bei eingeschaltetem Rührer 30 Minuten in den Entwickler eintauchen. Den Siliziumwafer für eine Stunde bei 40 Kilohertz in einen Ultraschallbadsonikator geben, der mit dem frischen Entwickler gefüllt ist.

Nehmen Sie dann den Wafer aus dem Becherglas und waschen Sie ihn mit einer frischen Entwicklerlösung. Bereiten Sie die vorgehärtete PDMS-Lösung vor, indem Sie die PDMS-Base mit dem Härter im Verhältnis 10 zu eins mischen. Entgasen Sie das Gemisch, indem Sie es für 500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur in eine Zentrifuge geben.

Gießen Sie das vorgehärtete PDMS auf einen Siliziumwafer und entgasen Sie es erneut. Zum Schluss legen Sie das ungehärtete PDMS zur Aushärtung in einen 60-Grad-Celsius-Ofen. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Ränder des ausgehärteten PDMS-Bereichs entsprechend der mikrofluidischen Chipgeometrie zu schneiden.

Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher am PDMS mit einem Biopsiestempel oder einer Nadel mit einer stumpfen Spitze. Legen Sie das PDMS nach der Plasmabehandlung auf den Objektträger, dessen gemusterte Oberfläche zum Objektträger zeigt, um die Mikrokanäle durch kovalente Bindung abzudichten. Lassen Sie erwachsene Oregon-R-Fliegen Eier auf Apfelsaft-Agarplatten legen und sammeln Sie die Platten zur gewünschten Entwicklungszeit nach der Eiablage für das gegebene Experiment.

Überfluten Sie den Agar mit Embryo-Eiwäsche und rühren Sie die Embryonen sanft mit einem Pinsel, um sie vom Agar zu entfernen. Die Embryonen werden 90 Sekunden lang unter gelegentlichem Rühren in eine 50%ige Bleichlösung überführt. Die Embryonen durch ein Gewebesieb abseihen und die Bleichlösung gründlich mit Wasser abwaschen.

Übertragen Sie die Embryonen in eine 90-Millimeter-Glas-Petrischale mit genügend Embryo-Eiwäsche, um die Embryonen vollständig zu bedecken. Untersuchen Sie die Embryonen mit Transillumination auf einem Seziermikroskop und wählen Sie Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums für die Beladung in das mikrofluidische Gerät aus. Bereiten Sie alle sieben Mikrokanäle des Embryos vor, indem Sie sie mit 0,4 Mikrometern gefiltertem IPA durch den Haupteinlass des Embryos füllen.

Ersetzen Sie das IPA durch 0,4 Mikrometer gefiltertes entionisiertes Wasser. Dann ersetzen Sie das DI-Wasser durch eine Eiwaschlösung für den Embryo. Sammeln Sie etwa 100 vorausgewählte Embryonen aus der Glas-Petrischale mit einer Glaspipette.

Als nächstes pipetten Sie die Embryonen in den Embryo-Einlass und wenden mit einer tragbaren Vakuumpumpe etwa drei PSI-Unterdruck an den Gaseinlass an, um die Mikrokanäle des Embryos zu öffnen. Neigen Sie dann den mikrofluidischen Chip nach unten, damit sich die Embryonen automatisch ausrichten und in den Mikrokanälen des Embryos absetzen können. Wenn die Mikrokanaleinlässe des Embryos verstopft werden, indem mehrere Embryonen gleichzeitig eindringen, neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach oben und dann wieder nach unten, um die Verstopfung zu beseitigen.

Basierend auf dem erforderlichen Durchsatz werden bis zu 300 Embryonen in die Mikrokanäle des Embryos eingeführt. Sobald die Embryonenbeladung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Vakuum, um die Embryonen zu immobilisieren. Kippen Sie dann den mikrofluidischen Chip zurück in die horizontale Position.

Schließen Sie eine tragbare Überdruckquelle mit einem Manometer an den Gaseinlass an, um drei PSI-Kompressionen anzuwenden. Wenn Live-Bildgebungsexperimente an den mechanisch stimulierten Embryonen durchgeführt werden, platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf einem Standard-Glasobjektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch, wobei der Gaseinlass mit der Druckquelle verbunden ist. Untersuchen Sie die Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop in den mikrofluidischen Kanälen.

Sobald das Kompressionsexperiment abgeschlossen ist, können die Embryonen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden. Um dies zu tun, wenden Sie zuerst das Vakuum an den Gaseinlass an, um die Embryonen zu befreien. Dann neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach oben, damit sich die Embryonen nach unten in Richtung der Embryoneneinführungsöffnung bewegen.

Sammeln Sie die Embryonen aus dem mikrofluidischen Chip mit einer Glaspipette. Die Funktionalität des mikrofluidischen Geräts wurde experimentell bestimmt, indem Drosophila-Embryonen in die Kompressionskanäle geladen und Überdruck auf die Gaskanäle ausgeübt wurden. Die Embryonen erfahren keine signifikante Kompression unter Vakuum oder in neutralen Druckzuständen.

Sie werden komprimiert, wenn Überdruck angelegt wird. Messungen der abnehmenden Breite der Embryonen unter dem Mikroskop zeigen, wie der Gasdruck verwendet werden kann, um ein Zielkompressionsniveau zu erreichen. Auf diese Weise hergestellte mikrofluidische Geräte ermöglichen die chemische Stimulation immobilisierter Proben.

Die Stimulation ermöglicht eine hochraumzeitliche Bildgebung. Eine grundlegende Frage in der Entwicklungsbiologie ist, wie mechanische Kräfte die Protein- und Genexpression während der Entwicklung regulieren. Diese Technologie ermöglicht es uns, eine große Anzahl von Embryonen gleichzeitig mechanisch zu stimulieren, so dass wir ausreichende Mengen an Protein und RNA isolieren können, um vergleichende Proteomik- oder Transkriptomik-Experimente durchzuführen.

So können die Forscher mehr über die Proteine und Gene erfahren, die empfindlich auf mechanische Kräfte reagieren.