Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg.
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Methodenartikel
Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Krebs ist eine große Herausforderung für die globale Gesundheit. Die komplexe Mikroumgebung des Tumors schränkt jedoch im Allgemeinen den Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen ein, was zu einem Tumorrezidiv führt. Um die begrenzte Durchdringung biologischer Barrieren zu überwinden, wurden zellpenetrierende Peptide (CPPs) mit ausgezeichneter Membrantranslokationsfähigkeit entdeckt und haben sich als nützliche molekulare Transporter für den Transport verschiedener Frachten in Zellen erwiesen. Konventionelle lineare CPPs weisen jedoch im Allgemeinen eine beeinträchtigte proteolytische Stabilität auf, was ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg einschränkt. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die biologische Barrieren durchdringen können und eine verbesserte proteolytische Stabilität aufweisen, sehr wünschenswert, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe in biomedizinischen Anwendungen zu fördern. Wir haben zuvor eine Reihe von kurzen zyklischen CPPs mit aromatischen Vernetzungen synthetisiert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine überlegene Permeabilität in Krebszellen und -geweben aufwiesen. In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll für die Synthese des fluoreszenzmarkierten zyklischen Polyarginin-R8-Peptids und seines linearen Gegenstücks sowie wichtige Schritte zur Untersuchung ihrer Zellpermeabilität beschrieben.
Einleitung
In den letzten Jahrzehnten gab es rasante Fortschritte bei der Entwicklung von zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) für die Verabreichung von Medikamenten. CPPs werden häufig als molekulare Transporter zur Behandlung einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten eingesetzt, darunter neurologische Erkrankungen1,2, Herzerkrankungen3, Diabetes4, Dermatose5 und Krebs 6,7. Krebs ist nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, die mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate einhe....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Ausrüstung
Anmerkungen: Führen Sie alle Vorgänge in einem Betriebsabzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
- Montieren Sie die manuelle Peptidsynthesevorrichtung im Abzug (Abbildung 1). Setzen Sie die Dreiwegehähne (siehe Materialtabelle) auf den Vakuumverteiler (siehe Materialtabelle) und schließen Sie sie an den Stickstoff (N2) an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen.
- Befestigen Sie eine 10-ml-Polypropylensäule (siehe Materialtabelle) an den Dreiw....
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Ergebnisse
In diesem Protokoll wurde ein Syntheseverfahren vorgestellt, um das lineare Polyarginin R8 in seine cyclische Form zu bringen. Die SPPS wurde manuell mit einer einfachen Apparatur durchgeführt (Abbildung 1). Der detaillierte Syntheseprozess von SPPS ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurzzeitig war das Harz ausreichend aufgequollen, gefolgt von der Entschützung der N α-Fmoc-Schutzgruppe. Anschließend wurde die N α-Fmoc-geschützte Aminosä.......
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Diskussion
Die chemische Stabilisierung von Peptiden unter Einbeziehung von Konformationsbeschränkungen hat sich als effektive Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Zellpermeabilität des Peptids26 erwiesen. In diesem Protokoll wird ein schrittweises Vorgehen für die Synthese zyklischer CPPs mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg beschrieben. Im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Quervernetzungen22,27
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wird von der Natural Science Foundation of China (21708031), der China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,2-Ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | Gestank |
| 2-(7-Azobenzotriazol)-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-Bis(brommethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 Zellen | ATCC | 4T1-Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % FBS (Hykllon) in einem 37 > C befeuchteter Inkubator mit 5 % CO2. | |
| Acetonitril | Adamas | 1484971 | Toxizität |
| Dichlormethan | Energie | W330229 | die Haut schädlich |
| Diethylether | Aldrich | 673811 | entzündliches |
| Dimethylsulfoxid | Beyotime | ST038 | hautschädlich |
| Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Elektrospray Ionisations-Massenspektrometer | Wasser | G2-S Tof | |
| Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | HyClone | ||
| Durchflusszytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein-Isothiocyanat-Isomer ( FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-β Ala-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa-Zellen | ATCC | HeLa-Zellen wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS (Hykllon) in einem 37 > C befeuchteter Inkubator mit 5 % CO2. | |
| Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie | Agilent Agilent | 1260 | |
| Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Säule | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4,6 > 150 mm (Porengröße 120 & Aring;, Partikelgröße 4 μ m) | |
| Lyophilisator | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | Toxizität |
| Mikrotiterplatte | Thermo μ Tropfplatte | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | reizend |
| Multi-Technologie Mikroplatten-Reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamin | HEOWNS | E-81416 | reizend |
| N,N-Dimethylformamid | Energie | B020051 | schädlich für die Haut |
| Poly-Prep Säule | Bio-Rad | 7321010 | Polypropylen-Chromatographiesäulen |
| Rink Amide MBHA Harz (0,572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Dreiwege-Absperrhähne | Bio-Rad | 7328107 | |
| Einsatz für Gewebekulturplatten | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoressigsäure | HEOWNS | T63278 | ätzende |
| Triisopropylsilan | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vakuumverteiler | Promega | A7231 |
Referenzen
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
