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Der Proximity-Ligation-Assay ermöglicht den Nachweis, die Lokalisierung und die Quantifizierung der Protein-Arginin-Methylierung in fixiertem Gewebe

DOI:

10.3791/64294

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

In This Article

Summary

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Der Proximity-Ligation-Assay ist eine sehr nützliche Technik zur Lokalisierung und Quantifizierung der Arginin-Methylierung eines bestimmten Proteins, wenn der modifizierte Argininrest unbekannt ist und/oder wenn kein spezifischer Antikörper verfügbar ist.

Abstract

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Die Arginin-Methylierung entwickelt sich zu einer wichtigen posttranslationalen Modifikation, die an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. Die Untersuchung im Gewebe wird oft durch das Fehlen eines spezifischen Antikörpers eingeschränkt, der den Ziel-Argininrest erkennt. Der Proximity-Ligation-Assay (PLA) wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir im Detail ein PLA-Protokoll zum Nachweis der Arginin-Methylierung, das wir auf den Glukokortikoidrezeptor (GR) angewendet haben. Nachdem wir zuvor gezeigt hatten, dass PRMT5 GRs in Zellen dimethyliert, verwendeten wir PLA mit einem pansymmetrischen Dimethyl-Antikörper und einem Anti-GR-Antikörper, um die GR-Methylierung in Brusttumoren zu messen. Wir zeigen, dass PLA einen einzigartigen Ansatz bietet, um die Arginin-Methylierung eines Zielproteins zu messen, selbst wenn der Ort der Methylierung nicht identifiziert wurde. Diese Technik könnte auf andere posttranslationale Modifikationen ausgeweitet werden, bei denen wirksame pan-Antikörper verfügbar sind. Daher beschreiben wir die PLA-Technologie, die zum Nachweis der Arginin-Methylierung in fixiertem Gewebe verwendet wird, am Beispiel von GR.

Introduction

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Die Arginin-Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) ist eine häufig vorkommende posttranslationale Modifikation (PTM), die an zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt ist. PRMTs katalysieren den Transfer von Methylgruppen vom S-Adenosylmethionin zu Argininresten. Die PRMT-Familie besteht aus neun Mitgliedern, die nach der Art der Methylierung, die sie durchführen, klassifiziert werden. Alle Mitglieder führen eine Monomethylierung (MMA) durch. Typ 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 und 8) PRMTs katalysieren die asymmetrische Dimethylierung (ADMA), während Typ 2 (PRMT5 und 9) die symmetrische Dimethylierung (SDMA) katalysier....

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Protocol

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Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Ethikkommission des Krebsforschungszentrums von Lyon genehmigt.

1. Auswahl der Antikörper

  1. Verwenden Sie Primärantikörper, die durch IHC oder Immunfluoreszenz (IF) validiert wurden.
    HINWEIS: Die für die Studie ausgewählten Primärantikörper sind entscheidend für den Erfolg von PLA und insbesondere im fixierten Gewebe. Die Verwendung eines Antikörpers, der durch IHC oder IF validiert wurde, erhöht die Erfolgsrate des Experiments. Optimierung und Spez....

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Results

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Mit dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Methylierung eines interessierenden Proteins nachzuweisen und zu quantifizieren. Hier zeigen wir das Beispiel der Methylierung von GR durch PRMT5. Die Antikörper und die experimentellen Bedingungen für PLA wurden zuvor an Zellen10 appliziert. Kurz gesagt, primäre Antikörper, die auf GR und SDMA abzielen, werden durch Proximity-Sonden erkannt, die mit komplementären Oligonukleotiden konjugiert sind. Dann erfolgt die Hybridisierung einer zirku.......

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Discussion

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Die Arginin-Methylierung trägt wie andere PTMs zur Feinregulierung der Proteinfunktionen bei. Die Auswirkungen werden jedoch unterschätzt, da es schwierig ist, diese Änderungen zu bewerten, vor allem aufgrund fehlender Instrumente. Dies gilt insbesondere für die Untersuchung der Methylierung in vivo, wo die einzige Möglichkeit, die Arginin-Methylierung zu messen, darin besteht, spezifische Antikörper zu besitzen, die den methylierten Rest des interessierenden Proteins erkennen. .......

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben

Acknowledgements

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Wir danken B. Manship für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken Laura Francols, Clémentine Le Nevé, Research Pathology Platform (CRCL) für technische Hilfe. Abbildung 1 wurde mit Servier Medical Art erstellt. Diese Studie wurde unterstützt von der Ligue Inter-régionale contre le Cancer und der Vereinigung "Le Cancer du sein, parlons-en".

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Adhäsionsfolien TOMO 90°, x100VWR631-1239
Anti-GR Antikörper (Maus)Santa Cruzsc393232
Anti-GR Antikörper (Maus)Santa Cruzsc393232
Anti-PRMT5 Antikörper (Kaninchen)Merck07-405
Anti-SDMA Antikörper (Kaninchen)CST13222
Automate dLeicaASP 6025Paraffininfiltration und Blockvorbereitung
Autostainer XLLeicaST5010Autostainer
Kassetten Q path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC1Roche5279801001
Citrat Puffer pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Dako Antikörper VerdünnungsmittelDako AgilentS202230-2Antikörper-Verdünnungsmittel
Discovery ChromoMap Diaminobenzidin (DAB) KitRoche760-159Diaminobenzidin (DAB)
Kit Discovery WashRoche7311079001
Duolink Insitu  PLA-Sonde Anti-Maus minusSigma-AldrichDUO92004PLA  Kit (Sonde Anti-Kaninchen Minus)
Duolink Insitu-Detektionsreagenzien HellfeldSigma-AldrichDUO92012PLA  Kit (In-situ-Detektionsreagenzien)
Duolink Insitu PLA-Sonde Anti-Kaninchen plusSigma-AldrichDUO92002PLA  Kit (Sonde Anti-Kaninchen plus)
Duolink Insitu-Waschpuffer HellfeldSigma-AldrichDUO82047PLA Kit (in situ Waschpuffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
Ethanol absolut ≥ 99,8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, gebrauchsfertig, 5 LMMFF/40877-36Formalin Vollautomatischer
GlaseindeckerLeicaCV5030automatisierter Eindecker
Glaseindecker 24 x 40Dutscher100037
HämatoxylinVentana760-2021
IHC InstrumentRocheDISCOVERY XTAutomatisierung von IHC
LCSRoche5264839001
MikrotomThermo ScientificMicrom HM340ESchneiden des Gewebes inkl. in Blöcken
Eindeckmedium PertexHistolab00801-FR
PAP Pen für ImmunfärbungSigma-AldrichZ672548-1EA
Paraffinwachs tek III, 4 x 2,5 kgSakura4511
Pasteur EinwegpipettenFisher Scientific12583237
PBS Puffer 10x, 100 mLMMFF/T0020
Reaktionspuffer 10xRoche5353955001
Ribo Wash 10xRoche5266262001
RiboCC1Roche
Sekundärer Antikörper gegen MausAbcamab133469
Sekundärer Antikörper OmniMap gegen Kaninchen HRPRoche760-4311
GewebeeinbettungszentrumMMFEC 350
Xylol (Mischung von Isomeren) ≥ 98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2 Mikroskopaufrechtes Hellfeldmikroskop
5266297001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S.

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Proximity Ligation AssayArginine MethylationProtein MethylationFixed TissuePost Translational ModificationGlucocorticoid ReceptorPRMT5 DimethylationPan Dimethyl AntibodyProtein LocalizationProtein Quantification
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