Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.
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Methodenartikel
Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.
Einleitung
Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen1. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind2. Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen3. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder....
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Protokoll
Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert.
1. Vorbereitung der I-OVA NE
- Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMSO, wirbeln Sie 5 Minuten lang und lassen Sie es 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) stehen, um sich vollständig aufzulösen.
- Fügen Sie Tween 80 und I-OV....
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Ergebnisse
Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen (
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Diskussion
Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln16,20
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt von Nr. 31670938, 32070924, 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Nr. 2020XBK24 und Nr. 2020XBK26 der Sonderprojekte der Army Medical University sowie Nr. 202090031021 und Nr. 202090031035 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Platten | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 Mikroplatten-Reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 Kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Zentrifuge 5810 R | Eppendorf, Deutschland | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fötales Rinderserum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-markiertes I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| HF 90/240 Inkubator | Heal Force, Schweiz | NA | |
| HPLC | Verifizierter Lieferant - Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverses Mikroskop | Nikon, Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS System | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. | tlrl-mpla | |
| Neomycinsulfat-Salbe | Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| OVA257– 264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| RPMI 1640 Medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetisches Peptid (I-OVA) Konjugation von IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Zeiss LSM800 konfokales Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop | Zeiss, Deutschland | Zeiss LSM800 |
Referenzen
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
