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Methodenartikel

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

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DOI:

10.3791/64302

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16. Dezember 2022

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, The University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Zusammenfassung

Mit außergewöhnlicher Effizienz, Genauigkeit und Leichtigkeit hat das CRISPR/Cas9-System die Genom-Editierung in Zellkultur- und Labortierversuchen deutlich verbessert. Bei der Erstellung von Tiermodellen bietet die Elektroporation von Zygoten eine höhere Effizienz, Einfachheit, Kosten und einen höheren Durchsatz als Alternative zur Goldstandardmethode der Mikroinjektion. Die Elektroporation ist auch schonender, mit höherer Lebensfähigkeit und liefert zuverlässig Cas9 / Single-Guide-RNA (sgRNA) Ribonukleoproteine (RNPs) in die Zygoten gängiger Labormausstämme (z. B. C57BL / 6J und C57BL / 6N), die eine 100%ige Liefereffizienz erreichen. Diese Technik ermöglicht Insertions-/Deletionsmutationen (Indels), Punktmutationen, die Deletion ganzer Gene oder Exons und kleine Insertionen im Bereich von 100-200 bp, um LoxP oder kurze Tags wie FLAG, HA oder V5 einzufügen. Während es ständig verbessert wird, präsentieren wir hier den aktuellen Stand von CRISPR-EZ in einem Protokoll, das die sgRNA-Produktion durch In-vitro-Transkription , Embryo-Prozessierung, RNP-Assemblierung, Elektroporation und die Genotypisierung von Präimplantationsembryonen umfasst. Ein Forscher mit minimaler Erfahrung in der Manipulation von Embryonen kann mit diesem Protokoll in weniger als 1 Woche genetisch veränderte Embryonen erhalten. Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und leistungsfähige Methode an, die mit Mausembryonen verwendet werden könnte.

Einleitung

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierungzugänglicher und erschwinglicher geworden 1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern 4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und Studenten geeignet und erfordert auch teure Geräte, die sich ein bescheiden finanziertes Labor nicht leisten kann. Die Mikroinjektion wird in der Regel von erfahrenen Technikern in transgenen Anlagen mit Zeitplänen und Servicepreisen durchgeführt, die für viele Forscher preisbegrenzend sind. Ein zugänglicherer Ansatz ist die Elektroporation, die sich als sehr effektiv für die Verabreichung von CRISPR-Cas9-mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium erwiesen hat7. Weitere Verbesserungen bei der Genom-Editierung und den Verabreichungsstrategien von CRISPR deuten darauf hin, dass vorkonfektionierte RNPs, die bereits mit sgRNAs verbunden sind, ein wirksames Mittel zur Verringerung des Mosaizismus sein könnten8.

Der Grund für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls bestand darin, viele der Einschränkungen und Hindernisse zu umgehen, die mit der Mikroinjektion verbunden sind. Wie der Name schon sagt, wäre eine einfache, hauseigene und kostengünstige Methode, mit der schnell festgestellt werden kann, ob sich ungetestete sgRNA-Designs während eines Mikroinjektionsexperiments lohnen, ein sehr praktischer Schritt zur Qualitätskontrolle im ersten Durchgang (Abbildung 1). Während diese Methode die Mikroinjektion für komplexere Strategien, wie die Einführung langer Spender-DNA-Sequenzen für rekombinationsbasierte Ergebnisse, nicht ersetzen kann, ist sie ideal für weniger komplexe Strategien wie kleine Deletionen oder Insertionen und die Markierung von Genen. Diese Methode eignet sich für Forscher mit grundlegenden Fähigkeiten in der Manipulation von Embryonen, die einfache Bearbeitungsbedürfnisse haben, ihre Hypothese innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung testen möchten oder es vorziehen, sgRNAs in Embryonen zu testen, bevor sie einen Termin mit einem Mikroinjektionsspezialisten vereinbaren. Hier werden Editierreagenzien vorübergehend als Cas9 / sgRNA-RNPs über Elektroporation (eine Reihe elektrischer Impulse) in Embryonen im pronuklearen Stadium eingebracht, um die Effizienz zu maximieren und gleichzeitig den Mosaikismus zu verringern8. Unter Verwendung einer Embryonen-Genotypisierungsmethode liegen die Bearbeitungsergebnisse in ca. 1 Woche9 vor, wodurch der Bedarf an verschiedenen Mikroinjektionsanwendungen zu deutlich reduzierten Kosten reduziert wird.

Die Wirksamkeit dieser Methode erreicht ihren Höhepunkt im pronukleären Embryostadium, wenn der Embryo noch nicht mit den mütterlichen und väterlichen Vorkernen verschmolzen ist oder in die S-Phase eingetreten ist (Abbildung 2). Superovulation wird verwendet, um die Anzahl der Zygoten zu maximieren, produziert aber sowohl pronukleäre Zygoten als auch unbefruchtete Eier. Gesunde Zygoten können auch vor der Elektroporation vorselektiert werden, um die Gesamteffizienz zu erhöhen. Da andere Elektroporationsprotokolle Zygoten effizient editiert haben, ohne dass ein ähnlicher Schritt 7,10,11,12,13,14,15 erforderlich ist, ist ein optionaler Schritt dieses Protokolls die leichte Erosion der Zona pellucida (ZP). Das ZP ist eine Glykoproteinschicht, die die Bindung von Spermatozoen, die Akrosomenreaktion und die Befruchtung von Embryonen im Pronuklearstadium unterstützt. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass eine sanfte säurebasierte Erosion des ZP eine zuverlässige Cas9-RNP-Elektroporation mit nur marginalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit bietet.

Wir haben RNP-Lieferraten von bis zu 100% Effizienz durch Elektroporation in Mausstämmen beobachtet, die häufig in der Forschung verwendet werden, wie C57BL / 6J und C57BL / 6N 9,16. Unabhängige Gruppen haben auch auf Elektroporation basierende Verfahren entwickelt, deren Wirkungsgrade größer oder gleich denen der Mikroinjektion 11, 12, 13, 14, 15, 17 sind, wobei die Elektroporationsprotokolle bei Ratten18, 19, Schweinen 20,21, 22 und Kühen 23 gut funktionieren Daher empfehlen wir den Lesern, die Protokolle zu vergleichen, um die Bedingungen zu finden, die ihren Experimentier- und Ausrüstungsanforderungen am besten entsprechen. Das hier beschriebene System verwendet gängige Materialien und Geräte, die nur grundlegende Fähigkeiten zur Manipulation von Embryonen erfordern. Diese Technik ist für eine Reihe von Bearbeitungsstrategien wirksam und macht diese Methode für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich.

Das Design idealer Small-Guide-RNAs (sgRNAs) ist für eine effiziente Bearbeitung unerlässlich. Wir empfehlen, zwei bis drei sgRNA-Strategien pro Zielort direkt in Mausembryonen zu screenen, insbesondere wenn die Generierung von Mauslinien gewünscht wird. Einmal entwickelt, werden klonenfreie Methoden wie die In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung hochwertiger sgRNAs empfohlen3. Die RNPs und sgRNAs werden mit 30-50 prozessierten Embryonen im Pronuklearstadium gemischt und einer Reihe von elektrischen Impulsen ausgesetzt, um zuerst vorübergehend die ZP und die Zellmembran zu permeabilisieren, mit nachfolgenden Impulsen, um die Poren offen zu halten und die RNPs durch die Zygote24 zu elektrophorisieren. Nach der Optimierung fanden wir heraus, dass sechs 3-ms-Impulse bei 30 V für Massenembryonen (~ 50) optimal für die Editiereffektivität und Lebensfähigkeit waren und eine hocheffiziente Cas9 / sgRNA-RNP-Lieferung 9,16,25 ermöglichten. Editierereignisse in einzelnen Mausmorula können mit einer Vielzahl von Validierungsstrategien bestätigt werden, die für die CRISPR-Bearbeitung üblich sind, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), T7-Endonuklease-Verdauung und Sanger-Sequenzierung der interessierenden Region26.

Die aktuelle Methode eignet sich am besten für einfache Bearbeitungsschemata (Abbildung 3), wie z. B. Einfügungen/Löschungen (Indels), Exon-große Löschungen in der Größenordnung von 500-2000 bp und die Bereitstellung von Punktmutationen und kleinen Insertionen wie C- oder N-Terminal-Tags (z. B. FLAG, HA oder V5)9,16,27. Das Potenzial für komplexe Genom-Editierung, wie große Insertionen von Fluoreszenz-Tags oder bedingten Allelen, bleibt ungewiss und steht derzeit im Fokus bevorstehender Verbesserungen.

Diese Methode ist leicht zu beherrschen und kann verwendet werden, um sgRNAs in kultivierten Mausembryonen in 1 Woche9 schnell zu testen (Abbildung 1). In dieser Arbeit wird ein sechsstufiges Protokoll vorgestellt, das 1) sgRNA-Design; 2) sgRNA-Synthese; 3) Superovulation und Paarung; 4) Embryonenkultur, -entnahme und -verarbeitung; 5) RNP-Montage und Elektroporation; 6) Embryokultur und Genotypisierung. Informationen über alle verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt (Materialtabelle). Als Positivkontrolle wurden Reagenzien zur Bearbeitung des Tyrosinase (Tyr)-Locus 9,16 in die Ergänzungstabelle 1 aufgenommen.

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Protokoll

Die gesamte Tierpflege und -verwendung während dieses Protokolls entsprach den Richtlinien des Tierschutzgesetzes, dem ILAR-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien der AVMA für Euthanasie und den Richtlinien und Richtlinien und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania. Das Tierpflege- und Verwendungsprotokoll wurde von der University of Pennsylvania IACUC für dieses Projekt überprüft und genehmigt. Bitte holen Sie aus Gründen der Einhaltung und Vorsicht alle erforderlichen Genehmigungen ein, bevor Sie dieses Protokoll ausprobieren.

1. sgRNA und optionales Donor-Oligo-Design

  1. sgRNA-Design
    1. Wählen Sie sgRNA-Kandidaten aus allen weit verbreiteten Online-Algorithmen, wie z. B. Sequence Scan for CRISPR (SSC; http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)28 oder CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)29. Da jede Plattform einzigartig ist, lesen Sie bitte sorgfältig die Gebrauchsanweisungen, um ideale sgRNAs zu entwerfen. Wählen Sie für In/Del-Experimente zwei bis drei zu testende sgRNAs aus. Für Deletionen werden sgRNAs vorgeschlagen, die die Zielregion flankieren, z. B. zwei sgRNAs stromaufwärts des Ziels und zwei sgRNAs stromabwärts des Ziels.
      HINWEIS: Während verschiedene Online-sgRNA-Algorithmen Off-Targets berücksichtigen, um fehlerhafte sgRNA-Designs zu vermeiden, ist das BLAST-Tool von NCBI hilfreich, um die Qualität der ausgewählten sgRNA-Sequenzen zu bestätigen.
    2. 19-20 Nukleotide (nt), die aus dem vorherigen Schritt (1.1.1) bestimmt wurden, werden in die variable Region des sgRNA-Oligos (Ergänzungstabelle 1) eingefügt und synthetisierte sgRNA als kundenspezifische DNA-Oligos gekauft.
      HINWEIS: Eine Seitenbereinigung ist nicht erforderlich.
  2. (Optional) Donor-Oligo-Design für Homologie-gerichtete Reparatur (HDR)-vermitteltes Knock-in.
    1. Entwerfen Sie das geeignete einzelsträngige Oligodeoxynukleotid (ssODN) auf der Grundlage des gewünschten experimentellen Ergebnisses (präzise Punktmutation, loxP-Insertion, Insertion kleiner Tags usw.), wobei die Gesamtlänge auf 100-200 nt mit Homologiearmen von 50 nt oder mehr gehalten wird, die den zentralen Bereich flankieren.
    2. Um eine höhere Knock-in-Effizienz zu gewährleisten, entwerfen Sie die sgRNA so, dass sie komplementär zum ssODN30 ist, und ersetzen Sie die PAM-Sequenz (Protospacer adjacent motif) durch eine stille Mutation, um ein wiederholtes Schneiden durch das Cas9-Enzym zu verhindern.
    3. Bestellen Sie ssODN mit der benutzerdefinierten Oligo-Option.

2. sgRNA-Synthese

  1. Template-Generierung für die In-vitro-Transkription (IVT)
    1. Um die DNA-Vorlage für sgRNA IVT durch PCR zu generieren, bereiten Sie eine IVT-Reaktion in einem PCR-Streifenröhrchen vor, das RNAse-frei ist. (siehe Ergänzungstabelle 2).
    2. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen für den Thermocycler:
      95 °C für 2 min; 30 Zyklen von 95 °C für 2 min, 57 °C für 10 s und 72 °C für 10 s; dann 72 °C für 2 min
    3. Um den Erfolg der sgRNA-DNA-Template-PCR-Reaktion zu überprüfen, wurden 5 μL des Produkts mit 1 μL 6x Beladungsfarbstoff auf einem 2% (Gew./Vol) Agarose-Gel kombiniert.
      HINWEIS: Die erwartete Produktgröße beträgt 127 bp. Die verbleibende PCR-Reaktion kann bis zu 5 Monate bei −20 °C gelagert werden.
  2. In-vitro-Transkription (IVT) von sgRNA
    1. Um die sgRNA zu erzeugen, bereiten Sie das Reaktionsgemisch (T7 IVT gemäß Herstelleranweisung) in einem PCR-Röhrchen vor und mischen Sie die Reagenzien.
      HINWEIS: Siehe Ergänzungstabelle 3 für das Beispiel des Reaktionsaufbaus. Die IVT-Reaktion ist RNase-Kontaminationssensitivität; Bemühen Sie sich daher nach Kräften, eine RNase-freie Umgebung bereitzustellen.
    2. Damit die Reaktion eingeleitet und fortgesetzt werden kann, wird das IVT-Reaktionsgemisch für >18 h bei 37 °C entweder in einem Thermocycler oder einem Wärmeblock inkubiert.
    3. Um die ursprüngliche DNA-Vorlage abzubauen (Schritt 2.1.3), wird 1 μL DNase I (2 Einheiten pro Reaktion) eingeführt und die Reaktion für 20 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
    4. Um die RNA-Bindung an die magnetischen Reinigungskügelchen zu fördern, kombinieren Sie 129 μL 100% Ethanol in der Reaktion, was jetzt 150 μL ist.
    5. Um die Reinigungskügelchen, die dazu neigen, sich während der Lagerung abzusetzen, zu resuspendieren, wirbeln Sie das Aliquot für mindestens 10 s.
    6. Um die sgRNAs zu reinigen, fügen Sie 100 μL der resuspendierten Kügelchen (Schritt 2.2.5) zur IVT-Reaktion (Schritt 2.2.4) hinzu und mischen Sie vorsichtig durch 10-faches Pipettieren auf und ab.
    7. Um eine Bindung zu ermöglichen, lassen Sie die Mischung 5 min bei RT ruhen.
    8. Um die sgRNA aus den nicht inkorporierten Reaktionsprodukten zu isolieren, legen Sie die Reaktion für 5 min bei RT auf die magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich ein kleines Pellet bildet.
    9. Um die sgRNAs zu waschen, entsorgen Sie zuerst vorsichtig den Überstand und fügen Sie dann 200 μL 80% Ethanol vom Pellet weg.
      HINWEIS: Während des 80%igen (vol/vol) Ethanol-Waschschritts ist es wichtig, das Pellet nicht durch Pipettieren zu stören, da dies die sgRNA-Konzentrationen erheblich reduziert. Stattdessen pipettieren Sie das 80% ige Ethanol vorsichtig, so dass das Pellet eingetaucht ist, und entfernen Sie das Volumen vorsichtig mit einer Pipette.
    10. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt (Schritt 2.2.9) und trocknen Sie das Pellet nicht länger als 5-6 Minuten an der Luft, da die sgRNA sonst dauerhaft mit den Kügelchen verbunden ist.
    11. Eluieren Sie die sgRNA mit 20 μL nukleasefreiem Wasser, indem Sie das Pellet 10x pipettieren, 2 min bei (RT) inkubieren und dann wieder auf den Magnetständer legen, um die Kügelchen von der jetzt gereinigten sgRNA zu trennen.
    12. Um die Qualität und Quantität der sgRNA zu bewerten, verwenden Sie ein Instrument wie ein Spektralphotometer oder einen Bioanalysator. Alternativ können Sie auf einem 2%igen Agarose-Gel 2 μL sgRNAs laufen lassen, ähnlich wie in Schritt 2.1.3.
      HINWEIS: Die Qualität wird durch ein einzelnes durchsichtiges Band bestätigt. Der Rest der sgRNA kann entweder sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.

3. Superovulation

  1. Um genügend Embryonen zur Verfügung zu stellen, um jedes sgRNA-Design zu testen, superovulieren Sie zwei bis drei C57BL / 6J-Weibchen, die zwischen 3 und 5 Wochen alt sind, wie zuvor beschrieben9. Es wird empfohlen, 20-30 Embryonen pro sgRNA zu elektroporieren, um genügend Ergebnisse zu erzielen, um die Wirksamkeit zu bestätigen.
    HINWEIS: Wenn die Befruchtung erfolgreich ist, erwarten Sie 10-20 Embryonen pro Paarung.
  2. Um den Eisprung zu induzieren, befolgen Sie diesen Hormoninjektionsplan:
    1. Tag 1: Verabreichung von 5 I.E. Serumgonadotropin (PMSG) (100 μl) durch eine intraperitoneale (IP) Injektion mit einer 26 G-Spritze an 3-5 Wochen alte weibliche Mäuse.
    2. Tag 3: Nach 46-48 h PMSG-Injektion injizieren Sie 5 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) (100 μL) durch eine IP-Injektion, um den Eisprung zu induzieren.
    3. Um die Zucht einzurichten, paaren Sie die Weibchen 1:1 mit einem Männchen aus zuverlässiger Zucht direkt nach der hCG-Injektion.
      HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich die Hormone abbauen und ihre Aktivität verlieren, führen Sie Injektionen unter 30 Minuten Auftauen durch.

4. Entnahme und Verarbeitung von Embryonen

  1. Entnahme von Embryonen
    1. Um Weibchen einzuschläfern und das notwendige Material zu entnehmen, wie zuvorbeschrieben 31, stellen Sie sicher, dass Sie zuerst die geeignete Methode in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien bestätigen. Verwenden Sie beispielsweise CO2 -Erstickung, Gebärmutterhalsluxation und / oder andere zugelassene Methoden.
      HINWEIS: Normalerweise zeigen >75% der hormonstimulierten Weibchen Kopulationspfropfen, was auf eine erfolgreiche Paarung hinweist.
    2. Um zu verhindern, dass Haare die Gewebeentnahme erschweren, legen Sie die eingeschläferten Weibchen auf den Rücken und sprühen Sie 70% (vol / vol) Ethanol auf die Bauchregion, die chirurgisch geöffnet werden soll.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt wird empfohlen, die chirurgischen Schritte in einer belüfteten Haube durchzuführen, um eine aseptische Umgebung aufrechtzuerhalten und das Kontaminationspotenzial zu reduzieren.
    3. Um die Bauchhöhle zu öffnen und die Eileiter zu entfernen, schneiden Sie die Haut- / Haarschicht (subkutan) mit einer chirurgischen Schere und lokalisieren Sie die Eierstöcke (Abbildung 4), die sich in der Nähe der Niere befinden und einen Teil eines Fettpolsters teilen. Die Eileiter befinden sich proximal zu den Eierstöcken (Abbildung 4). Beide Eileiter werden operativ aus dem Weibchen entfernt und in einzelne 50 μl Tröpfchen M2+BSA (4 mg/ml BSA) gegeben (Abbildung 5A).
      ANMERKUNG: Detaillierte Anweisungen für diesen Abschnitt des Verfahrens können visuell31 angezeigt oder schrittweise9 unter Verwendung zuvor veröffentlichter Protokolle befolgt werden.
    4. Um die Cumulus-Eizell-Komplexe (CoCs), die Eizellen enthalten, freizusetzen (Abbildung 4), verwenden Sie eine Dissektionszange, um die Ampulle des Eileiters zu schneiden, während Sie durch ein Stereomikroskop schauen.
    5. Um die Menge an Ablagerungen (Blut, Fett, Gewebe) zu reduzieren, übertragen und kombinieren Sie jedes CoC mit einer Handpipette von 20-30 μL auf ein einzelnes 50 μL M2 + BSA-Medium, um die Verschleppung von Ablagerungen zu vermeiden.
  2. Entfernung von Kumuluszellen
    1. Um mit der Entfernung von Kumuluszellen aus den Zygoten zu beginnen (Abbildung 4), übertragen Sie CoCs mit so wenig zusätzlichem Medium wie möglich in ein Tröpfchen von 100 μL M2+Hyaluronidase (Abbildung 5B) und mischen Sie die CoCs vorsichtig durch Pipettieren, bis die Embryonen sichtbar von den viel kleineren Cumuluszellen getrennt sind. Achten Sie darauf, die Exposition der Embryonen gegenüber M2 + Hyaluronidase auf ein Minimum zu beschränken, da dies die Lebensfähigkeit beeinträchtigen kann.
      HINWEIS: Man kann entweder vorheizen (37 °C) oder zusätzliche 50 μL M2+Hyaluronidase hinzufügen, wenn sich die Embryonen nicht innerhalb von 2 Minuten von den Kumuluszellen trennen.
    2. Um Hyaluronidase zu verdünnen und lose Kumuluszellen von den Zygoten zu entfernen, verwenden Sie eine mundbetriebene Pipette, um die Zygoten zu einem frischen 50 μL M2 + BSA-Tröpfchen zu bewegen.
      HINWEIS: Die meisten Schritte, die über diesen Punkt hinausgehen, erfordern die Verwendung einer mundbetriebenen Pipette, sofern nicht anders angegeben. Während das Risiko einer Kontamination durch den Benutzer gering ist, wird die Verwendung eines Inline-Luftfilters empfohlen, um eine aseptische Umgebung aufrechtzuerhalten. Bitte beachten Sie die zuvor beschriebenen Methoden zur Herstellung und Verwendung dieses Gerätes 9,31.
    3. Führen Sie die Embryonen mit einer Mundpipette durch mindestens vier bis fünf weitere 50 μL M2+BSA-Tröpfchen, um die Anzahl der Kumuluszellen zu reduzieren.
  3. (OPTIONAL) Ausdünnung der Zona pellucida mit saurer Tyrode (AT)-Lösung.
    1. Um die Zona pellucida des Embryos zu erodieren und zusätzliche physische Hindernisse für die Reagenzienabgabe zu verringern, werden die Embryonen in einen vorgewärmten (37 °C) 100 μL Tropfen AT-Lösung auf einer 60 mm dicken Platte übertragen (Abbildung 5C). Beobachten Sie die Zygoten kontinuierlich mit einem Stereomikroskop, bis etwa 30% der Zona pellucida erodiert sind9. Die AT-Gesamtexposition muss 60-90 s betragen. Eine längere Exposition gegenüber AT kann die Zona pellucida vollständig auflösen und die Lebensfähigkeit des Embryos gefährden.
      ANMERKUNG: Detaillierte Anweisungen und Abbildungen zu diesem Abschnitt des Verfahrens finden Sie in den zuvor veröffentlichten Methoden 9,16.
    2. Um den AT zu verdünnen, verwenden Sie eine Mundpipette, um die Embryonen durch mindestens vier 50 μL Tröpfchen M2 + BSA zu führen.
    3. Um festzustellen, ob eine angemessene Anzahl von Embryonen verarbeitet wurde, verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Embryonen zu zählen. Abhängig von der Anzahl der verwendeten weiblichen Mäuse kann man mit etwa 10-20 lebensfähigen Zygoten pro Weibchen rechnen.
      HINWEIS: In diesem Stadium sollten die Embryonen relativ frei von Ablagerungen sein, die die Beurteilung von Quantität und Qualität verhindern würden. Wenn zum Beispiel fünf Weibchen verwendet werden, liegt die erwartete Zygotenzahl wahrscheinlich zwischen 50 und 100, und ein mechanischer Zellzähler wäre angemessen, um die Embryonen zu verfolgen. Es ist üblich, etwa 10%-20% der Embryonen zu verlieren, weil sie nicht befruchtet werden oder Eizellen von geringer Qualität ovulieren. Im nächsten Schritt werden die Embryonen in 50 μL M2+BSA für nicht mehr als 30 min in einem Inkubator kurzzeitig gelagert.

5. RNP-Montage und Elektroporation

  1. RNP-Baugruppe
    1. Um den RNP-Komplex zusammenzubauen, verwenden Sie die beigefügten Beispieltabellen, um die geeigneten Reaktionsgemische basierend auf der gewünschten Bearbeitungsstrategie im RNP-Puffer zu kombinieren (100 mM HEPES pH 7,5, 750 mM KCl, 5 mMMgCl2, 50% Glycerin und 100 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid [TCEP] in nukleasefreiem Wasser)
      HINWEIS: TCEP ist ein geeignetes Reduktionsmittel, hat aber eine kurze Halbwertszeit in wässrigen Lösungen. Fügen Sie daher TCEP kurz vor der komplexen RNP-Baugruppe hinzu.
      1. Für nicht-homologe End Join (NHEJ)-vermittelte Indels siehe Ergänzungstabelle 4.
      2. Informationen zur HDR-vermittelten Bearbeitung (Homology directed repair) finden Sie in der Zusatztabelle 5.
      3. Informationen zu technischen Deletionen mit gepaarten sgRNAs finden Sie in der Ergänzungstabelle 6.
        1. Unabhängig von der Strategie kombinieren Sie die gewünschten Reagenzien bei RT in einem PCR-Röhrchen.
        2. Um die Bildung des RNP-Komplexes zu ermöglichen, wird das Gemisch 10 min bei 37 °C inkubiert.
          HINWEIS: Der RNP-Komplex kann bei RT bis zu 1 Stunde gelagert werden.
  2. Elektroporation
    1. Um die BSA vor der Elektroporation zu verdünnen, passieren Sie die Embryonen durch mindestens zwei Tröpfchen von 50 μL reduziertem Serummedium.
      HINWEIS: BSA erhöht den Widerstand während der Elektroporation und kann die Zygoten schädigen.
    2. Um die Zygoten (Schritt 4.3.2) mit dem RNP-Komplex (Schritt 5.1.1.2) für die Elektroporation vorzubereiten und zu mischen, pipettieren Sie 25-30 Embryonen in einen 10-μl-Tropfen reduzierter Serummedien und fügen Sie dann mit einer Handpipette 10 μl des RNP-Komplexes hinzu (Schritt 5.1.1.2).
    3. Um das viskose Glycerin aus dem RNP-Komplex zu verdünnen und die Probe zu homogenisieren, mischen Sie durch Pipettieren 10x oder bis die Mischung keine Anzeichen von Viskosität (Wirbelmuster) mehr mit einem Stereomikroskop aufweist.
    4. Um die Probe für das Einführen in den Elektroporator vorzubereiten, pipettieren Sie diese 20 μL Embryo + RNP-Mischung in eine 0,1 cm große Elektroporationsküvette, wobei Blasen vermieden werden.
    5. Um die Editierreagenzien in die Zygote zu bringen, elektroporieren Sie die Embryonen mit einem Rechteckwellenprotokoll unter folgenden Bedingungen: 30 V, 4-6 Impulse, 3 ms Pulslänge und 100 Pulsintervalle.
    6. Um Zygoten aus der Küvette zu entnehmen, verwenden Sie eine Handpipette, um 50 μL KSOM + BSA (1 mg / ml BSA) in die Oberseite der Küvette zu geben, um die Embryonen zu spülen, die sich möglicherweise auf dem Boden abgesetzt haben. Pipettieren Sie diese Mischung vorsichtig heraus und auf eine 60-mm-Platte.
    7. Wiederholen Sie Schritt 5.2.6 mindestens 2x-3x und kombinieren Sie jede Spülung auf einer 60-mm-Platte, bis die meisten Embryonen geborgen sind.
      HINWEIS: Eine typische Genesung beträgt >90% der ursprünglich geladenen Embryonen. Um das Überleben des Embryos zu gewährleisten, testen Sie den Inkubator und überprüfen Sie das Verfallsdatum aller Reagenzien. Embryonen sind anfällig für nicht ideale Kulturbedingungen wie Temperatur, CO2 -Gehalt, Feuchtigkeit und pH-Wert.

6. Embryonenkultur und Genotypisierung

  1. Embryonenkultur
    1. Um Zygoten bis zu einem gewünschten Stadium zu kultivieren, verwenden Sie eine Mundpipette, um 20-30 Zygoten in einen Tropfen KSOM+BSA in einer voräquilibrierten Kulturplatte zu überführen und die Embryonen zum Tröpfchen zu bewegen (Abbildung 5D). Inkubieren Sie die Platte über Nacht in 5%CO2, bei 37 °C, bei 95% Luftfeuchtigkeit.
      ANMERKUNG: Vor dem Gleichgewicht, indem eine vorbereitete 35-mm-Kulturplatte entweder am Tag vor oder mindestens 4 h vor der Inkubation in einen Inkubator gelegt wird (Abbildung 5D).
    2. Um ideale Wachstumsbedingungen zu fördern, werden nur zweizellige Embryonen am nächsten Tag mit einem Stereomikroskop auf einen frischen Tropfen KSOM+BSA-Mischung übertragen und in den Inkubator zurückgebracht. Achten Sie darauf, die toten oder unbefruchteten Embryonen zu belassen oder zu entsorgen.
      HINWEIS: Embryonen im Pronuklearstadium wachsen typischerweise nach 72 Stunden Kultur zu Morulae und nach 84 Stunden zu Blastozysten heran.
  2. Genotypisierung
    1. Um die Bestandteile des Mediums zu verdünnen, die eine PCR-Reaktion stören könnten, waschen Sie die Morula-/Blastozysten-Embryonen mit einer Mundpipette, indem Sie zwei Tropfen DPBS passieren.
    2. Um einzelne Embryonen für die Lyse zu laden, werden einzelne Embryonen in eine Vertiefung eines 8-Well-PCR-Streifens übertragen, indem eine Pipette auf 1 μL eingestellt wird, und dann 10 μL Lysepuffer hinzugefügt (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ph 8,5, 2,5 mM MgCl 2, 0,1 mg/ml Gelatine, 0,45% Nonidet P-40, 0,45% Tween 20,0,2 mg/ml Proteinase K in nukleasefreiemH2O).
      HINWEIS: Fügen Sie die Proteinase K kurz vor der Herstellung des Lysepuffers hinzu.
    3. Um die Embryonen zu lysieren, programmieren Sie einen Thermocycler für 4 h auf 55 °C und inaktivieren Sie dann die Proteinase K mit einer 10-minütigen Inkubation bei 95 °C.
      HINWEIS: Versuchen Sie insbesondere für Erstbenutzer ein Bearbeitungsexperiment an den Tyr-Loci . Dieser Arbeitsablauf wurde optimiert und kann als Positivkontrolle dienen. Falls erforderlich, lagern Sie die Embryolysate bei 4 °C für 2-3 Tage oder bis zu 2 Wochen vor der PCR-Analyse im Gefrierschrank. Verhindern Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
    4. Um die Chancen auf eine erfolgreiche Genotypisierungsanalyse zu erhöhen, führen Sie eine verschachtelte PCR-Strategie durch, indem Sie etwas längere DNA-Fragmente, die die Zielstelle flankieren, sowie Regionen, die zur Amplifikation eines präziseren DNA-Fragments verwendet werden, amplifizieren. Befolgen Sie die Bedingungen in der Zusatztabelle 7.
    5. Befolgen Sie die unten genannten Bedingungen des Thermocyclers:
      95 °C für 2 min
      30+ Zyklen: 95 °C für 2 Minuten, 60 °C für 10 s und 72 °C für 10 s
      72 °C für 2 min
    6. Um die zweite Stufe einer verschachtelten PCR-Strategie vorzubereiten, führen Sie eine 1:10-Verdünnung des ersten PCR-Produkts durch (Schritt 6.2.5) und laden Sie 2 μL davon in die nächste PCR-Reaktion (mit Primern, die sich innerhalb des vorherigen Amplikons befinden).
      HINWEIS: Die erste PCR-Reaktion muss verdünnt werden, um die Verschleppung von flankierenden Primern in der zweiten PCR-Reaktion zu reduzieren. Bereiten Sie die verschachtelte PCR vor, indem Sie die Schritte in der Ergänzungstabelle 8 ausführen.
    7. Platzieren Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler unter den folgenden Zyklusbedingungen:
      95 °C für 2 min
      30 Zyklen: 95 °C für 2 min, 60 °C für 10 s und 72 °C für 10 s
      72 °C für 2 min
      HINWEIS: Normalerweise sind >90% der PCR-Reaktionen erfolgreich, wenn die Amplikongröße 500 bp oder weniger beträgt.
    8. (Optionale Steuerung) Bei NHEJ-vermittelten in/del-Mutationen mit Tyr als Positivkontrolle werden 10 μL der verschachtelten PCR-Produkte aus Schritt 6.2.7 durch Inkubation bei 37 °C für 4 h mit 10 U HinfI in einer 20 μL-Reaktion verdaut (siehe Zusatztabelle 9). Führen Sie auf einem 2% Agarose-Gel das verdaute Produkt aus, um die Bearbeitung zu bewerten, und verwenden Sie ein nicht verdautes PCR-Produkt als Belastungskontrolle. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 135 V laufen.
      HINWEIS: Die Verwendung von HinfI als geeignetes Restriktionsenzym wurde aufgrund einer günstig gelegenen HinfI-Stelle innerhalb der sgRNA-Zielregion ausgewählt, von der erwartet wird, dass sie nach einer erfolgreichen NHEJ-Editierung abgetragen wird. Ein detailliertes Verfahren und die Ergebnisse wurden bereits 9,16 beschrieben.
    9. (Optionale Steuerung) Bei HDR-vermittelten Mutationen mit Tyr als Positivkontrolle werden 10 μL der verschachtelten PCR-Produkte aus Schritt 6.2.7 durch Inkubation bei 37 °C für 4 h mit 10 E EcoRI in einer 20 μL-Reaktion verdaut (siehe Zusatztabelle 10). Führen Sie auf einem 2% Agarose-Gel das verdaute Produkt aus, um die Bearbeitung zu bewerten, und verwenden Sie ein nicht verdautes PCR-Produkt als Belastungskontrolle. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 135 V laufen.
      HINWEIS: Die Wahl von EcoRI als diagnostisches Restriktionsenzym nutzt die ursprüngliche Sequenz in der sgRNA-Zielregion, wo nach erfolgreichem HDR die natürlich vorkommende HinfI-Stelle durch eine EcoRI-Stelle ersetzt wird und eine Frameshift-Mutation erzwungen wird, die das Tyr-Gen stört. Führen Sie für die HDR-Analyse sowohl NHEJ- (Schritt 6.2.8) als auch HDR-Analysen (Schritt 6.2.9) für jede Probe durch, da beide Ergebnisse auftreten können und bei der Bestimmung des Mosaiks helfen können. Ein detailliertes Verfahren und die Ergebnisse wurden bereits 9,16 beschrieben.

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Ergebnisse

Diese Methode erzeugt mehr als 100 μg sgRNA (20 μL bei >6.000 ng/L Konzentration) für eine effiziente Cas9/sgRNA-RNP-Assemblierung. Die hier beschriebene routinemäßige Superovulationsmethode produziert typischerweise 10-20 lebensfähige Embryonen pro verstopftem Weibchen. Aufgrund von Handhabungsfehlern und typischen Verlusten, die mit der Manipulation von Embryonen verbunden sind, sind voraussichtlich 80% der Embryonen befruchtet, lebensfähig und in ausgezeichnetem Zustand nach der Elektroporation. Um den Forschern be...

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Diskussion

Hier wird eine einfache und hocheffiziente Maus-Genom-Editing-Technologie vorgestellt. Die Elektroporation kann verwendet werden, um modifizierte Embryonen in 1-2 Wochen zu erzeugen (Abbildung 1) und kann innerhalb von 6 Wochen editierte Mäuse produzieren9. Im Vergleich zu zeitgleich entwickelten elektroporationsbasierten Protokollen, die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 liefern, ist die hier beschriebene Methode konzeptionell ähnlich und bietet Wirkungsgrad...

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Offenlegungen

Es gibt keine relevanten Finanzerklärungen der Autoren.

Danksagungen

A.J.M. entwickelte das ursprüngliche Konzept, das zur Entwicklung von CRISPR-EZ führte, und produzierte die Zahlen. C.K.D. hat die internen und veröffentlichten Protokolle für dieses aktuelle Manuskript zusammengestellt und angepasst. A.J.M. wird von NIH (R00HD096108) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Elektroporationsküvette mit 0,1 cm SpaltBio-RadKat.-Nr. 1652089Elektroporation
26-G, 1/2-Zoll-NadelBDKat.-Nr. 305111Superovulation
3– 8 Monate alte männliche Mäuse und 3 bis 5 Wochen alte weibliche MäuseJAXKat.-Nr. 000664Superovulation
35 mm GewebekulturschaleGreiner Bio-One,Kat.-Nr. 627-160Embryokultur
60 mm GewebekulturschaleGreiner Bio-One,Kat.-Nr. 628-160Embryoaufbereitung
6x LadefarbstoffThermo Fisher ScientificKat.-Nr. R0611sgRNA-Synthese und Genotypisierung
Saure Tyrode (AT)-Lösung, EmbryokulturqualitätSigma-Aldrich,Kat.-Nr. T1788Embryo Processing
BSA, EmbryokulturqualitätSigma-AldrichKat.-Nr. A3311Embryo Processing and Culture
Cas9 ProteinAlt-R S.p. Cas9 Nuklease 3NLSKat.-Nr. 1074181Elektroporation
DNase I, RNase-freiNew England BioLabs,Kat.-Nr. M0303sgRNA-Synthese
DPBS (calcium- und magnesiumfrei)GibcoKat.-Nr. 14190-144Embryo Processing
EcoRINEBKat.-Nr. R3101SGenotypisierung
EDTA, wasserfreiSigma-AldrichKat.-Nr. EDS-100GRNP Puffer
EthanolKoptecKat.-Nr. V1016sgRNA-Synthese
Gelatine (Pulver) Typ B, LaborqualitätFisher,Kat.-Nr. G7-500Lysepuffer
Glycerin,  molekularbiologischer GradFisherKat.-Nr. BP229RNP Buffer
Taq PolymerasePromegaKat.-Nr. M712Genotypisierung
HEPES, ZellkulturqualitätSigma-AldrichKat.-Nr. H4034RNP Buffer
HinfI (10.000 U/ml)NEBKat.-Nr. R0155SGenotypisierung
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BioLabs,Kat.-Nr. E2040sgRNA-Synthese
Humanes Choriongonadotropin, lyophilisiert (hCG)MilliporeKat.-Nr. 230734Superovulation
Hyaluronidase/M2MilliporeKat.-Nr. MR-051-FEmbryo Processing
KSOMaa Evolve medium (kaliumergänztes simplex-optimiertes Medium plus Aminosäuren)Zenith BiotechKat.-Nr. ZEKS-050Embryokultur
LE Agarose, analytische QualitätBioExpressKat.-Nr. E-3120-500sgRNA-Synthese und Genotypisierung
M2 MediumZenith BiotechKat.-Nr. ZFM2-050Embryonenaufbereitung
Magnesiumchlorid, wasserfrei (MgCl2)Sigma-AldrichKat.-Nr. M8266RNP und Lysis Buffer
MineralölMilliporeKat.-Nr. ES-005CEmbryokultur
Nonidet P-40, Ersatz (NP-40)Sigma-AldrichKat.-Nr. 74385Lysepuffer
Nukleasefreies Wasser, molekularbiologische QualitätAmbionKat.-Nr. AM9937sgRNA-Synthese und Genotypisierung
Oligos für die sgRNA-Synthese, Spender-Oligos und PCR-Primer für die GenotypisierungIntegrierte DNA-TechnologienSonderanfertigungensgRNA Design
Reduziertes SerummediumThermo Fisher ScientificKat.-Nr. 31985062Embryokultur
High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England BioLabs,Kat.-Nr. M0530sgRNA-Synthese
Kaliumchloridemolekulär-biologisch (KCl)Sigma-AldrichKat.-Nr. P9333RNP und Lysis Buffer
Trächtige Stute Serum Gonadotropin lyophilisiert ((PMSG)ProspecBioKat.-Nr. HOR-272Superovulationsproteinase
K, molekularbiologische QualitätFisherKat.-Nr. BP1700-100Lysepuffer
RNasefreies 1,5-mL-MikrozentrifugenröhrchenVWRKat.-Nr. 20170-333sgRNA-Synthese und Genotypisierung
RNase-freie Acht-Well-PCR-StreifenröhrchenVWRKat.-Nr. 82006-606sgRNA-Synthese und Genotypisierung
Magnetische ReinigungskügelchenGE HealthcareKat.-Nr. 65152105050250sgRNA-Synthese
Tris (2-carboxyethyl) phosphin Hydrochlorid (TCEP)Sigma-AldrichKat.-Nr. C4706RNP Puffer
Tris-HCl-Lösung, pH 8,5 molekularbiologischTeknovaKat.-Nr. T1085Lysepuffer
Tween 20 molekularbiologischSigma-AldrichKat.-Nr. P7949-500Lysepuffer

Referenzen

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