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Automatische Bildverarbeitung zur Bestimmung der Gemeinschaftsgrößenstruktur von Flussmakroinvertebraten

DOI:

10.3791/64320

⸱

January 13th, 2023

 ,  ,  , 
1Center for the Study of Mediterranean Rivers (CERM), Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, 2Laboratoire Evolution et Diversité Biologique (EDB), UMR5174, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, Centre national de la recherche scientifique (CNRS), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), 3Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 4Aquatic Ecology Group, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Artikel basiert auf der Erstellung eines angepassten Protokolls zum Scannen, Erkennen, Sortieren und Identifizieren digitalisierter Objekte, die benthischen Flussmakroinvertebraten entsprechen, unter Verwendung eines halbautomatischen Bildgebungsverfahrens. Dieses Verfahren ermöglicht die Erfassung der individuellen Größenverteilungen und Größenmetriken einer Makroinvertebratengemeinschaft in ca. 1 h.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Körpergröße ist ein wichtiges funktionelles Merkmal, das als Bioindikator verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Störungen in natürlichen Lebensgemeinschaften zu bewerten. Die Struktur der Gemeinschaftsgröße reagiert auf biotische und abiotische Gradienten, einschließlich anthropogener Störungen zwischen Taxa und Ökosystemen. Die manuelle Messung von kleinwüchsigen Organismen wie benthischen Makroinvertebraten (z.B. >500 μm bis wenige Zentimeter lang) ist jedoch zeitaufwendig. Um die Schätzung der Populationsgröße zu beschleunigen, haben wir hier ein Protokoll entwickelt, um die individuelle Körpergröße von konservierten Flussmakroinvertebraten halbautomatisch zu messen, die einer der am häufigsten verwendeten Bioindikatoren zur Beurteilung des ökologischen Zustands von Süßwasserökosystemen sind. Dieses Protokoll basiert auf einer bestehenden Methodik, die entwickelt wurde, um marines Mesozooplankton mit einem Scansystem für Wasserproben zu scannen. Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritten: (1) Scannen von Teilproben (feine und grobe Probengrößenfraktionen) von Flussmakroinvertebraten und Verarbeitung der digitalisierten Bilder, um jedes detektierte Objekt in jedem Bild zu individualisieren; (2) Erstellen, Auswerten und Validieren eines Lernsets durch künstliche Intelligenz, um die einzelnen Bilder von Makroinvertebraten halbautomatisch von Detritus und Artefakten in den gescannten Proben zu trennen; und (3) die Darstellung der Größenstruktur der Makroinvertebratengemeinschaften. Neben dem Protokoll enthält diese Arbeit die Kalibrierungsergebnisse und listet mehrere Herausforderungen und Empfehlungen auf, um das Verfahren an Makroinvertebratenproben anzupassen und für weitere Verbesserungen in Betracht zu ziehen. Insgesamt unterstützen die Ergebnisse den Einsatz des vorgestellten Scanning-Systems für die automatische Körpergrößenmessung von Flussmakroinvertebraten und legen nahe, dass die Darstellung ihres Größenspektrums ein wertvolles Werkzeug für die schnelle Biobewertung von Süßwasserökosystemen ist.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Benthische Makroinvertebraten werden häufig als Bioindikatoren verwendet, um den ökologischen Zustand von Gewässern zu bestimmen1. Die meisten Indizes zur Beschreibung von Makroinvertebratengemeinschaften konzentrieren sich auf taxonomische Metriken. Neue biologische Bewertungsinstrumente, die die Körpergröße integrieren, werden jedoch gefördert, um eine alternative oder ergänzende Perspektive zu taxonomischen Ansätzen zu bieten 2,3.

Die Körpergröße gilt als Metamerkmal, das mit anderen lebenswichtigen Merkmalen wie Stoffwechsel, Wachstum, Atmung und Bewegung zusammenhängt4. Darüber hinaus kann die Körpergröße die trophische Position und die Wechselwirkungen bestimmen5. Die Beziehung zwischen der individuellen Körpergröße und der normalisierten Biomasse (oder Häufigkeit) nach Größenklasse in einer Gemeinschaft ist definiert als das Größenspektrum6 und folgt dem allgemeinen Muster einer linearen Abnahme der normalisierten Biomasse mit zunehmender individueller Größe auf einer logarithmischen Skala7. Die Steigung dieser linearen Beziehung wurde ausführlich theoretisch untersucht, und empirische Studien über Ökosysteme hinweg haben sie als ökologischen Indikator für die Größe der Gemeinschaftverwendet 4. Ein weiterer synthetischer Indikator für die Struktur der Gemeinschaftsgröße, der erfolgreich in Studien zur Biodiversität und zum Funktionieren von Ökosystemen verwendet wurde, ist die Diversität der Gemeinschaftsgröße, die als Shannon-Index der Größenklassen des Größenspektrums oder seines Analogons dargestellt wird, der auf der Grundlage der individuellen Größenverteilungen berechnet wird8.

In Süßwasserökosystemen wird die Größenstruktur verschiedener Faunengruppen als ataktischer Indikator verwendet, um die Reaktion biotischer Lebensgemeinschaften auf Umweltgradienten 9,10,11 und auf anthropogene Störungen 12,13,14,15,16 zu bewerten. Makroinvertebraten sind keine Ausnahme, und ihre Größenstruktur reagiert auch auf Umweltveränderungen17,18 und anthropogene Störungen wie Bergbau 19, Landnutzung 20 oder Stickstoff (N) und Phosphor (P) Anreicherung20,21,22. Die Messung von Hunderten von Individuen zur Beschreibung der Gemeindegrößenstruktur ist jedoch eine mühsame und zeitraubende Aufgabe, die als Routinemessung in Laboratorien aus Zeitmangel oft vermieden wird. So wurden mehrere halbautomatische oder automatische Bildgebungsverfahren zur Klassifizierung und Vermessung von Proben entwickelt23,24,25,26. Die meisten dieser Methoden konzentrieren sich jedoch mehr auf die taxonomische Klassifizierung als auf die individuelle Größe der Organismen und sind nicht für alle Arten von Makroinvertebraten einsatzbereit. In der marinen Planktonökologie wurde ein Scanning-Bildanalysesystem ausgiebig eingesetzt, um die Größe und taxonomische Zusammensetzung von Zooplanktongemeinschaften zu bestimmen 27,28,29,30,31. Dieses Instrument ist in mehreren Meeresinstituten weltweit zu finden und wird verwendet, um konservierte Zooplanktonproben zu scannen, um hochauflösende digitale Bilder der gesamten Probe zu erhalten. Das vorliegende Protokoll passt die Verwendung dieses Instruments an, um das Größenspektrum der Makroinvertebratengemeinschaften in Flüssen schnell und automatisch abzuschätzen, ohne in die Entwicklung eines neuen Geräts zu investieren.

Das Protokoll besteht darin, eine Probe zu scannen und das gesamte Bild zu verarbeiten, um automatisch einzelne Bilder (d.h. Vignetten) der Objekte in der Probe zu erhalten. Mehrere Messungen von Form, Größe und Graustufenmerkmalen charakterisieren jedes Objekt und ermöglichen die automatische Klassifizierung der Objekte in Kategorien, die dann von einem Experten validiert werden. Die individuelle Größe jedes Organismus wird anhand des ellipsoiden Biovolumens (mm3) berechnet, das sich aus der in Pixeln gemessenen Fläche des Organismus ableitet. Dies ermöglicht es, das Größenspektrum der Probe schnell zu erhalten. Nach unserem besten Wissen wurde dieses Scanning-Imaging-System nur zur Verarbeitung von Mesozooplanktonproben verwendet, aber das Gerät könnte möglicherweise die Arbeit mit benthischen Süßwasser-Makroinvertebraten ermöglichen.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es daher, eine Methode einzuführen, mit der die individuelle Größe von konservierten Flussmakroinvertebraten schnell ermittelt werden kann, indem ein bestehendes Protokoll angepasst wird, das zuvor mit marinem Mesozooplankton 27,32,33 verwendet wurde. Das Verfahren besteht aus einem halbautomatischen Ansatz, der mit einem Scangerät zum Scannen von Wasserproben und drei offenen Programmen zur Verarbeitung der gescannten Bilder arbeitet. Ein angepasstes Protokoll zum Scannen, Erkennen und Identifizieren digitalisierter Flussmakroinvertebraten zur automatischen Erfassung der Gemeinschaftsgrößenstruktur und der damit verbundenen Größenmetriken wird hierin vorgestellt. Die Bewertung des Verfahrens und die Leitlinien zur Steigerung der Effizienz werden auch auf der Grundlage von 42 gescannten Bildern von Proben von Makroinvertebraten aus Flüssen vorgestellt, die aus drei Becken auf der nordöstlichen (nordöstlichen) Iberischen Halbinsel (Ter, Segre-Ebre und Besòs) entnommen wurden.

Die Proben wurden in 100 m langen Flussabschnitten nach dem Protokoll der spanischen Regierung für Feldproben und Laboranalysen von benthischen Flussmakroinvertebraten in durchfahrbaren Flüssen gesammelt34. Die Proben wurden mit einem Surber-Probenehmer (Rahmen: 0,3 m x 0,3 m, Maschenweite: 250 μm) nach einer Multi-Habitat-Befragung gesammelt. Im Labor wurden die Proben gereinigt und durch ein 5 mm und ein 500 μm Maschen gesiebt, um zwei Teilproben zu erhalten: eine grobe Teilprobe (5 mm Maschen) und eine feine Teilprobe (500 μm Maschen), die in separaten Fläschchen gelagert und in 70% Ethanol konserviert wurden. Die Aufteilung der Probe in zwei Größenfraktionen ermöglicht eine bessere Schätzung der Struktur der Gemeinschaftsgröße, da große Organismen seltener und seltener sind als die kleinen Organismen. Andernfalls weist die gescannte Probe eine verzerrte Darstellung der großen Größenfraktion auf.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANMERKUNG: Das hier beschriebene Protokoll basiert auf dem von Gorsky et al.27 entwickelten System für marines Mesozooplankton. Eine genaue Beschreibung der Schritte Scanner (ZooSCAN), Scan-Software (VueScan 9x64 [9.5.09]), Bildverarbeitungssoftware (Zooprocess, ImageJ) und automatische Identifikationssoftware (Plankton Identifier) finden Sie in den vorherigen Referenzen32,33. Um die Größe der benthischen Makroinvertebraten in Bezug auf das Mesozooplankton bestmöglich anzupassen, ändern Sie den Parameter der minimalen Größe (minsizeesd_mm) auf 0,3 mm und den Parameter der maximalen Größe (maxsizeesd_mm) auf 100 mm in der Konfigurationsdatei, sobald das Projekt nach dem ursprünglichen Protokoll32,33 erstellt wurde. Um das Protokoll besser befolgen zu können, ist dies in einem Arbeitsdiagramm zusammengefasst (Abbildung 1). Das erstellte Projekt wird im Ordner C des Computers gespeichert und ist in den folgenden Ordnern organisiert: PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results und Zooscan_scan. Jeder Ordner besteht aus mehreren Unterordnern, die von den verschiedenen Softwareanwendungen in den folgenden Schritten des Protokolls verwendet werden.

1. Erfassung von digitalen Bildern für Makroinvertebratenproben

  1. Scannen und Bearbeiten des Rohlings
    HINWEIS: Erstellen Sie vor dem Scannen täglich zwei leere Bilder, um die Hintergrundscans zu extrahieren, während die gescannten Bilder am selben Tag verarbeitet werden.
    1. Schalten Sie den Scanner ein und schalten Sie das Licht in der Doppelposition ein, um weißes Licht von oben und von unten zu projizieren.
      HINWEIS: Beim Scannen von Mesozooplanktonproben wird die aufwärts gerichtete Lichtrichtung verwendet, aber da Makroinvertebraten undurchsichtiger sind, wird empfohlen, das Licht in eine duale Position zu schalten.
    2. Reinigen und spülen Sie die Scanschale mit Leitungswasser ab.
    3. Gießen Sie 110 ml Leitungswasser, das bei Raumtemperatur (RT) gelagert wurde, in die Scanschale, bis das Glas abgedeckt ist. Legen Sie den großen Rahmen (24,5 cm x 15,8 cm) in der richtigen Position auf das Scanfach (mit der Ecke oben links im Scanfach) und füllen Sie ihn mit Leitungswasser, bis die Stufe des Rahmens abgedeckt ist, um einen Meniskuseffekt zu vermeiden, der das gescannte Bild verändern würde. Schließen Sie den Deckel des Scanners.
      HINWEIS: Verwenden Sie Wasser bei RT, um Kondensation und Blasenbildung zu vermeiden. Reinigen Sie den Rahmen ohne Flecken oder Tröpfchen, um Lichtreflexionen zu vermeiden.
    4. Gehen Sie zur Bildbearbeitungssoftware, wählen Sie das Arbeitsprojekt aus und klicken Sie auf Hintergrundbild scannen (konvertieren).
    5. Gehen Sie zur Scan-Software und klicken Sie auf Vorschau. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Vorschau des gescannten Bildes anzeigen, überprüfen Sie, ob keine Linien oder Flecken vorhanden sind, und warten Sie mindestens 30 Sekunden, bevor Sie einen weiteren Scan starten. Klicken Sie vor dem zweiten Scan auf Scannen und drücken Sie OK im Anweisungsfenster, um die Daten von der Scansoftware an die Bildverarbeitungssoftware zu senden.
      HINWEIS: Scannen Sie zweimal, um die beiden Hintergrundscans zu erhalten, aus denen der Rohling besteht. Dieser Schritt wird einmal täglich vor Beginn der Probenverarbeitung durchgeführt, und die Bilder werden im Ordner Zooscan_back gespeichert.
    6. Schließen Sie die Scan-Software, nachdem Sie den Scan abgeschlossen haben.
  2. Probenvorbereitung und Scannen
    VORSICHT: Ethanol ist eine brennbare Flüssigkeit und kann schwere Augenschäden/-reizungen verursachen.
    1. Geben Sie die Beispielmetadaten ein. Rufen Sie die Bildverarbeitungssoftware auf und wählen Sie Beispielmetadaten ausfüllen aus. Geben Sie die Beispielidentität ein, klicken Sie auf OK und geben Sie die Metadaten ein.
      HINWEIS: Die Metadatei wurde speziell für Mesozooplanktonproben erstellt, daher passt sie nicht zur benthischen Makroinvertebraten-Probenahmemethode, aber alle Felder der Datei müssen vor dem Scan ausgefüllt werden, sonst wird ein Fehlerflag angezeigt.
    2. Gießen Sie 110 ml 70%iges Ethanol in das Scanfach, bis das Glas bedeckt ist, und platzieren Sie den großen Rahmen (24,5 cm x 15,8 cm) mit der Ecke oben links im oberen Teil des Scanfachs.
      HINWEIS: Arbeiten Sie mit Ethanol anstelle von Wasser, da die Makroinvertebraten in Ethanol konserviert werden. Im Wasser schwimmen und treiben sie in der Scanschale und verhindern so ein scharfes Bild und damit zuverlässige Größenmessungen. Ethanol sollte bei RT konserviert werden, um Kondensation und Blasenbildung zu vermeiden.
    3. Gießen Sie die Makroinvertebratenprobe in die Scanschale, die vom Rahmen umrandet wird, und bedecken Sie die Rahmenstufe bei Bedarf mit mehr Ethanol.
      HINWEIS: Verzichten Sie auf die Zugabe von zu viel Ethanol, um zu verhindern, dass die Organismen schwimmen und treiben.
    4. Homogenisieren Sie die Probe im gesamten Rahmenbereich, platzieren Sie die größten Individuen in der Mitte des Tabletts für eine ordnungsgemäße Bildverarbeitung, und versenken Sie die schwimmenden Organismen mit einer Holznadel.
      HINWEIS: Wenn eine Teilprobe numerisch mehr als 1.000 Individuen enthält, teilen Sie die Teilprobe in zwei oder mehr Fraktionen, um das Berühren von Organismen im gescannten Bild zu minimieren, und scannen Sie die Fraktionen separat.
    5. Trennen Sie die sich berührenden Organismen und die Organismen, die die Rahmenkanten berühren, mit der Holznadel.
      HINWEIS: Dieser Schritt dauert 5-20 min. Sich berührende Organismen werden von der Software als ein einzelnes Objekt betrachtet. In diesen Fällen entsprechen die berechneten Einzelgrößen nicht den tatsächlichen Einzelorganismen und können die Schätzung der Größenstruktur der Gemeinschaft verzerren. Es besteht die Möglichkeit, das Bild mit der Bildbearbeitungssoftware zu bearbeiten, um sie zu trennen, aber dieser zusätzliche Schritt beinhaltet mindestens 1,5 Stunden Nachbearbeitung; Daher ist eine manuelle Trennung sehr zu empfehlen.
    6. Um die Probe zu scannen, schließen Sie den Scannerdeckel, gehen Sie zur Bildverarbeitungssoftware, wählen Sie das Arbeitsprojekt aus und klicken Sie auf Probe mit Zooscan scannen (Für Archiv, kein Prozess).
    7. Wählen Sie das Beispiel aus und folgen Sie den Anweisungen.
    8. Gehen Sie zur Scan-Software und klicken Sie auf Vorschau. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Vorschau des gescannten Bildes anzeigen, überprüfen Sie, ob keine Linien oder Flecken vorhanden sind, und warten Sie mindestens 30 Sekunden, bevor Sie einen weiteren Scan starten.
    9. Klicken Sie nach mindestens 30 Sekunden in der Scan-Software auf die Schaltfläche Scannen .
      HINWEIS: Klicken Sie in der Bildverarbeitungssoftware auf OK , nachdem Sie in der Scansoftware auf Scannen geklickt haben. Drücken Sie keine Taste auf der Computertastatur und vermeiden Sie Vibrationen des Scans während des Scanvorgangs. Im Ordner "Zooscan_scan > _raw " werden drei Dateien generiert: (i) ein getaggtes Bilddateiformat (.tif) (16 Bit); ii) ein Standardtextdokument mit der Bezeichnung LOG (.txt), in dem Informationen zu den Scanparametern aufgezeichnet werden; iii) ein Standardtextdokument mit der Bezeichnung META (.txt) mit Informationen über die Probenahmeverfahren.
    10. Überprüfen Sie, ob der Rohscan korrekt ist.
      HINWEIS: Wenn der Scan helle Streifen oder andere sichtbare Probleme aufweist, sollten Sie den Scan wiederholen, um Probleme in den folgenden Schritten zu vermeiden.
  3. Probenrückgewinnung
    1. Entfernen Sie den Rahmen und spülen Sie ihn über dem Scanfach mit einer Quetschflasche ab, die mit 70% Ethanol gefüllt ist, um alle anhaftenden Makroinvertebraten zu gewinnen.
    2. Heben Sie den oberen Teil des Scanners an, um alle Organismen und das Ethanol aus dem Fach durch den Scan-Entnahmetrichter in ein Becherglas zu entnehmen. Spülen Sie das Fach mit der Quetschflasche ab, während der obere Teil des Scanners noch angehoben ist, um alle verbleibenden Organismen zu entfernen.
    3. Führen Sie die Proben und das Ethanol aus dem Becherglas durch ein 500-μm-Netz, um die wirbellosen Tiere im Netz zu halten, und lagern Sie sie wieder in einer Durchstechflasche mit 70% Ethanol.
    4. Sobald alle Proben in der Durchstechflasche entnommen sind, reinigen Sie die Schale mit Leitungswasser.
      HINWEIS: Waschen Sie das Tablett zwischen den Proben mit Leitungswasser, um den Ethanolausfluss zu minimieren, der die Bildverarbeitung verändert. Spülen Sie den Rahmen mit Leitungswasser ab, um mögliche Schäden durch die Verwendung von Ethanol zu vermeiden. Reinigen Sie das Tablett am Ende des Tages mit Leitungswasser und trocknen Sie es vorsichtig mit Papier, um Kratzer zu vermeiden.
  4. Bildverarbeitung
    1. Gehen Sie zur Bildverarbeitungssoftware und wählen Sie KONVERTIEREN und VERARBEITEN von Bildern und Organismen im Stapelmodus und dann Konvertieren UND verarbeiten Sie Bild UND Partikel (Bild im RAW-Ordner). Behalten Sie die Standardeinstellungen bei und klicken Sie auf OK. NORMAL END wird am Ende des Prozesses angezeigt.
      HINWEIS: Im Ordner "Zooscan_scan > _work" werden eine PID-Datei und die Vignetten für alle erkannten Objekte im gescannten Bild (in einer gemeinsamen Fotogruppendatei [.jpg]) erstellt. Eine PID-Datei ist eine einzelne Datei, in der alle Metadaten (Metafile), die mit der Protokolldatei verknüpften technischen Daten und eine Tabelle mit 36 Messvariablen aller im Bild erkannten Objekte gespeichert sind. Die gemessenen Variablen entsprechen unterschiedlichen Schätzungen von Graustufe, fraktaler Dimension, Form und Größe. Die Variablen, die für die Größenschätzung verwendet werden können, sind die Fläche und die Haupt- und Nebenachse einer Ellipse mit gleicher Fläche zum Objekt (siehe Abschnitt 3 des Protokolls). Die Verarbeitungszeit hängt von der Bilddichte und den Computereigenschaften ab und kann zwischen den Proben gestartet werden, während die nächste Probe gewonnen und vorbereitet wird. Andernfalls empfiehlt es sich, die Verarbeitung der täglich gescannten Proben im Batch-Modus während der Nacht zu starten und am nächsten Morgen die ordnungsgemäße Bildverarbeitung zu überprüfen.
    2. Überprüfen Sie, ob der Hintergrund im verarbeiteten Bild mit der Bildverarbeitungssoftware oder durch Überprüfen der Maskenbilder (terminiert in msk1.gif) in Zooscan_scan > _work ordnungsgemäß vom Beispielbild subtrahiert wird. Wenn der Hintergrund gesättigte Bereiche oder viele Punkte enthält, sollten Sie den Scan wiederholen, um qualitativ hochwertige Bilder zu gewährleisten.
      HINWEIS: Um gesättigte Bereiche im Hintergrund zu vermeiden, sollte das Scanfach nach jedem Scan mit Ethanol mit Leitungswasser gespült werden. Es ist auch wichtig, (1) die Anzahl der gescannten Personen zu reduzieren (durch Fraktionierung der Probe und Scannen in verschiedenen Falten); (2) Stellen Sie sicher, dass große Organismen in der Mitte des Scanfachs platziert werden. (3) sauberes, gefiltertes Ethanol verwenden; (4) Verringerung der Verschmutzung der Proben; (5) sicherstellen, dass das Ethanolvolumen für das Scannen ausreichend ist; und (6) sicherstellen, dass die Verzögerung zwischen der Vorschau der Probe und dem Scan mindestens 30 s beträgt.
  5. Trennung von sich berührenden Organismen
    ANMERKUNG: Wenn es mehrere Vignetten mit sich berührenden Organismen gibt, ist es notwendig, die Bilder der sich berührenden Organismen von anderen Organismen und/oder von Fasern/Trümmern zu trennen, um eine korrekte Schätzung der Struktur der Gemeinschaftsgröße zu gewährleisten.
    1. Gehen Sie zur Bildverarbeitungssoftware, um die Vignetten mit mehreren Objekten zu erkennen. Wählen Sie SEPARATION Using Vignettes und drücken Sie auf OK. Behalten Sie im Konfigurationsauswahlfenster die Standardeinstellungen bei und klicken Sie auf OK.
    2. Behalten Sie im Fenster TRENNUNG VON VIGNETTEN die Standardeinstellungen bei, wählen Sie zusätzlich die Option KONTUREN zu Vignetten hinzufügen aus, und wählen Sie dann das zu bearbeitende Beispiel aus.
    3. Trennen Sie die sich berührenden Organismen in jeder Vignette, die auftaucht, indem Sie mit der Maus eine Linie ziehen (drücken Sie die Roll-Taste, um zu zeichnen). Sobald die Trennung in einer Vignette abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche X in der oberen rechten Ecke des Fensters und drücken Sie JA , um die nächste zu bearbeiten. Drücken Sie NEIN , um die Änderungen zu beenden und zu speichern. Am Ende des Vorgangs erscheint NORMAL END , wenn alles korrekt ist.
    4. Verarbeiten Sie das Bild nach der Trennung erneut, um die aktualisierten Objektdaten zu erhalten. Gehen Sie zur Bildverarbeitungssoftware, klicken Sie auf VERARBEITEN (konvertiertes) Bild (Prozess Eins) und wählen Sie Partikel aus verarbeiteten Bildern in WORK-Unterordnern erneut verarbeiten. Wählen Sie das Beispiel aus, behalten Sie im Fenster " Einzelbildprozess" die Standardeinstellungen bei, aktivieren Sie " Mit Trennmaske arbeiten (CREATE-MODIFY-INCLUDE)" und klicken Sie dann auf "OK". Am Ende des Vorgangs erscheint NORMAL END , wenn alles korrekt ist.
    5. Klicken Sie im Fenster " Separation Control" auf OK , um das Bild mit den Konturen vor der Verarbeitung zu speichern. Wenn ein vorheriges Bild vorhanden ist, wird es ersetzt.
    6. Wählen Sie bei Bedarf im Fenster " Trennkontrollmaske " die Option BEARBEITEN , um der Maske Trennlinien hinzuzufügen, indem Sie mit der Maus berührende Organismen trennen, die zuvor nicht im Schritt "Trennung mit Vignetten" aufgetreten sind. Wenn Sie fertig sind, beenden Sie den Vorgang, und wählen Sie im Fenster " Steuerung der Trennmaske " die Option "JA ", um die Maske zu akzeptieren. Am Ende des Vorgangs erscheint NORMAL END , wenn alles korrekt ist.
      HINWEIS: Die Wiederaufbereitung einer Probe mit einer Trennmaske ist zeitaufwändig (dies kann mehr als 1,5 Stunden pro Probe dauern). Es ist vorzuziehen, in Schritt 1.2.5 die erforderliche Zeit einzuplanen, um diesen zusätzlichen Schritt zu vermeiden.

2. Automatische Erkennung der Objekte

HINWEIS: Erstellen Sie einen Lernsatz, um die Identität der erkannten Objekte automatisch vorherzusagen und so die Organismen von den Trümmern in der Probe zu trennen.

  1. Erstellung von Lernsets
    1. Kopieren Sie die Bilder und die PID-Dateien, die mit den Bildern verknüpft sind, die verwendet werden, um die Kategorien des Lernsets von Zooscan_scan > _work nach PID_process > Unsorted_vignettes_pid zu erstellen.
      ANMERKUNG: Wählen Sie eine Teilmenge von Proben mit hoher Taxa-Diversität und unterschiedlichen Probenahmestellen und/oder Probenahmezeiten, um eine maximale Repräsentativität der Organismen in den Proben zu gewährleisten.
    2. Erstellen Sie im Ordner " PID_process > Lernsatz" einen Unterordner mit dem Namen des neuen Lernsatzes (d. h. yyyymmdd_raw_LS) und erstellen Sie darin die Unterordner, die jeder Kategorie des Lernsatzes entsprechen (z. B. Makroinvertebraten, Trümmer, andere wirbellose Tiere).
      HINWEIS: Um die Struktur der Gemeinschaftsgröße von Proben von Makroinvertebraten effizient zu erhalten, wird empfohlen, ein Lernset zu verwenden, das auf nur drei Kategorien basiert: Makroinvertebraten, andere wirbellose Tiere und Trümmer. Dieser Lernsatz trennt im Wesentlichen die Vignetten von Objekten, die Organismen entsprechen, von denen, die Trümmern entsprechen (z. B. Fasern, Partikel oder Fadenalgen).
    3. Gehen Sie in die Bildverarbeitungssoftware (nur im erweiterten Modus) und wählen Sie EXTRAKT Vignetten für PLANKTON IDENTIFIER (unsortierte Vignetten für das Training). Behalten Sie die Standardoptionen bei, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Konturen hinzufügen .
    4. Gehen Sie zur automatischen Identifikationssoftware, klicken Sie auf Lernen, wählen Sie aus PID_process > Learning_set erstellten Unterordner für das neue Lernset aus (Schritt 2.1.2) und drücken Sie OK.
    5. Wählen Sie im linken Bereich (Unsortierte Thumbs) des geöffneten Fensters den Ordner Unsortierte vignettes_pid. Wählen Sie die Vignetten aus und ziehen Sie sie mit der Maus von den unsortierten Thumbs in den Ordner der entsprechenden Kategorie im rechten Bereich Sortierte Thumbs, um jedes Objekt in die definierten Kategorien einzuordnen. Die verschobenen Vignetten werden mit einem roten X gekennzeichnet.
      HINWEIS: Definieren Sie die Kategorien manuell, indem Sie Unterordner im sortierten Thumbs-Ordner erstellen, oder erstellen Sie sie, indem Sie auf das Ordnersymbol in der Software klicken. Verschieben Sie nicht mehr als 50 Vignetten gleichzeitig.
    6. Wenn alle Kategorien mit den ausgewählten Objekten (ca. 300 Objekte pro Kategorie) abgeschlossen sind, klicken Sie auf Lerndatei erstellen und speichern Sie diese mit dem gewünschten Namen.
      HINWEIS: Das Lernset wird als PID-Datei im Ordner PID_process > Lernset des Projekts gespeichert. Es wird empfohlen, mehrere Lernsets mit unterschiedlichen Kategorienstufen (von groben bis feinen Formen) und mit einem unterschiedlichen Gleichgewicht der Anzahl der Objekte innerhalb jeder Kategorie zu erstellen und zu testen. Beginnen Sie mit einem groben Lernset mit einer geringen Anzahl von Kategorien und mindestens 50 Objekten pro Kategorie und erhöhen Sie dann die Anzahl der Objekte in jeder Kategorie und/oder erstellen Sie feinere Lernsätze. Eine Kategorie sollte repräsentativ für ihre Variabilität im Stichprobensatz sein.
  2. Evaluation des Lernsets
    HINWEIS: Führen Sie eine Kreuzvalidierung mit zwei Falten und fünf Versuchen durch, indem Sie die Random-Forest-Methode mit der automatischen Identifikationssoftware verwenden, um eine Verwirrungsmatrix der resultierenden Klassifizierung der Objekte zu erhalten.
    1. Gehen Sie zur automatischen Klassifizierungssoftware und klicken Sie auf Datenanalyse.
    2. Wählen Sie unter Lerndatei auswählen die erstellte Lernsatzdatei aus PID_process > Lernset aus.
    3. Wählen Sie unter Methode auswählen die Methode Cross-Validation Random Forest aus. Deaktivieren Sie unter "Ursprüngliche Variablen" die Positionsvariablen (X, Y, XM, YM, BX, BY und Height). Aktivieren Sie unter Benutzerdefinierte Variablen nur ESD.
      HINWEIS: Bei dieser Methode wird ein zufälliger Teil des Lernsatzes verwendet, um den anderen Teil zu erkennen (zwei Faltungen), und dies wird fünfmal wiederholt, um sicherzustellen, dass es statistisch robust ist.
    4. Klicken Sie auf Analyse starten und speichern Sie die Ergebnisse als Analysis_name.txt im Ordner PID_process >Vorhersage. Wenn die Analyse erfolgreich abgeschlossen wurde, beenden Sie die Datenanalyse.
    5. Wechseln Sie zum Ordner "PID_process > Prediction" und klicken Sie auf die Kreuzvalidierungsdatei. Es öffnet sich ein Fenster mit der Verwirrungsmatrix der wahren Klassifikation (Zeilen) im Vergleich zur automatischen Klassifikation (Spalten).
      HINWEIS: Der Rückruf ist der Prozentsatz der Organismen, die zu einer Gruppe gehören, die automatisch gut erkannt wurde, während 1-Genauigkeit der Prozentsatz der Organismen ist, die vom Algorithmus als eine Gruppe klassifiziert werden, die nicht erkannt wird (Kontamination in einer Gruppe). Der Rückruf sollte über 70% liegen und die Kontamination (1-Genauigkeit) sollte unter 20% liegen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5, wenn mehrere Lernsätze erstellt wurden und der Abruf und die 1-Genauigkeit jedes einzelnen Satzes ermittelt werden müssen.
      HINWEIS: Wenn mehrere Lernsets erstellt wurden, wählen Sie diejenige mit dem größten Erinnerungsvermögen (gute Erkennung) und Präzision (geringe Kontamination) der interessierenden Gruppe (d. h. Makroinvertebraten) aus, um die automatische Vorhersage eines Probensatzes im nächsten Schritt zu testen.
  3. Vorhersage der Identifizierung von Makroinvertebraten
    HINWEIS: Verwenden Sie den ausgewählten Lernsatz, um die Identität aller Objekte in einer Teilmenge von Stichproben mithilfe der automatischen Identifizierungssoftware mit einem Random-Forest-Algorithmus vorherzusagen.
    1. Gehen Sie zur automatischen Identifikationssoftware und klicken Sie auf Datenanalyse.
    2. Wählen Sie unter Lerndatei auswählen die Lernsatzdatei aus PID_process > Lernset aus, die für die Vorhersage verwendet werden muss.
    3. Wählen Sie unter Beispieldatei(en) auswählen aus dem Ordner PID_results die Stichproben (PID-Dateien) aus, die vorhergesagt werden sollen.
      Hinweis: Verarbeiten Sie maximal 20 PID-Dateien gleichzeitig, um Fehler im Zusammenhang mit Speicherproblemen zu vermeiden. Wenn zu viele .pid-Dateien gleichzeitig verarbeitet werden, zeigt der Prozess ein korrektes Ende, wird aber möglicherweise nicht gut verarbeitet, und in den nächsten Schritten kann ein Fehler auftreten, wenn er mit der Bildverarbeitungssoftware verarbeitet wird.
    4. Wählen Sie unter Methode auswählen die Random-Forest-Methode aus. Markieren Sie Detaillierte Ergebnisse für jede Probe speichern. Deaktivieren Sie unter " Ursprüngliche Variablen" die Positionsvariablen (X, Y, XM, YM, BX, BY und Height). Aktivieren Sie unter Benutzerdefinierte Variablen nur ESD.
    5. Klicken Sie auf Analyse starten und speichern Sie die Ergebnisse als Analysis_name.txt im Ordner PID_process > Vorhersage.
  4. Manuelle Validierung
    HINWEIS: Ein Experte validiert manuell die Vorhersage aus dem vorherigen Schritt, um falsch klassifizierte Objekte in die richtige Kategorie umzuklassifizieren.
    1. Kopieren Sie die Analysis_sample_dat1.txt zu überprüfenden Dateien aus dem Ordner " PID_process > Prediction " in den Ordner "PID_process > Pid_results".
    2. Gehen Sie in die Bildverarbeitungssoftware und wählen Sie EXTRAHIEREN Vignetten in Ordnern nach PREDICTION oder VALIDATION. Wählen Sie dann VORHERGESAGTE Dateien aus dem Ordner "pid_results" verwenden. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei und drücken Sie OK.
    3. Die Software erstellt einen Ordner namens sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate mit den vorhergesagten Objekten im Ordner PID_process > sortierte Vignetten.
    4. Wechseln Sie zum Ordner PID_process > sortierte Vignetten, und kopieren Sie den Ordner sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate. Ersetzen Sie den Ordnernamen _to validieren Sie durch _validated.
    5. Um die automatische Klassifizierung manuell zu überprüfen, öffnen Sie den Ordner sample_yyyymmdd_ hhmm_validated und überprüfen Sie alle Vignetten aus jedem Unterordner (Kategorie), um festzustellen, ob falsch klassifizierte Objekte vorhanden sind. Wenn ein Objekt falsch klassifiziert ist, ziehen Sie die Vignette mit der Maus in den richtigen Ordner (Kategorie).
    6. Gehen Sie in die Bildverarbeitungssoftware und wählen Sie LOAD Identifications aus Sortierte Vignetten. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei und wählen Sie yyyymmdd_hhmm_name_validated aus, die verarbeitet werden sollen.
    7. Wechseln Sie zu PID_process > Pid_results > Dat1_validated, wo eine Datei mit dem Namen Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt und eine .txt Datei für jedes der validierten Beispiele (sample_tot_1_dat1.txt) erstellt wurden.
      HINWEIS: Diese .txt-Dateien enthalten eine neue Spalte mit dem Namen pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm, die die Expertenklassifizierung jedes Objekts (d. h. die validierte Klassifizierung) angibt. Neue Kategorien (z. B. feinere taxonomische Kategorien) könnten an dieser Stelle während der Validierung erstellt werden. Behalten Sie jedoch den Namen der ursprünglichen Kategorie im neuen Namen bei (z. B. macroinvertebrate_chironomidae). Dies ermöglicht es, die ursprüngliche Kategorie bei der Berechnung des Rückrufs und der Genauigkeit zurückzuverfolgen und alle Makroinvertebraten einfach zu gruppieren, um die Parameter der Gemeinschaftsgrößenstruktur (d.h. das Größenspektrum und die Größenvielfalt) zu berechnen. Die Textdatei enthält die Daten, die jedem Objekt zugeordnet sind, einschließlich der Neben- und Hauptachsen, die verwendet werden, um das ellipsoide Volumen jedes Organismus als Maß für die individuelle Körpergröße zu erhalten. Darüber hinaus enthalten die letzten beiden Spalten der Tabelle die vorhergesagten und validierten Kategorien jedes Objekts (Zeile), die es ermöglichen, den Abruf und die Genauigkeit des Lernsatzes für die Teilmenge der Stichproben nach Kategorien zu berechnen.figure-protocol-1

Abbildung 1: Arbeitsdiagramm mit Abschnitt 1 und Abschnitt 2 des Protokolls. Die Zeiten sind illustrativ und können sich je nach Computer, der Fülle der zu verarbeitenden Vignetten und der Anzahl der Kategorien des Lernsets ändern. Dieser Fall entspricht der Validierung eines Lernsatzes von drei Kategorien an einem Satz von 42 Teilstichproben (insgesamt 47.473 Vignetten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Berechnung der individuellen Größenverteilung, Größenspektren und Größenmetriken

HINWEIS: Die in diesem Abschnitt erwähnten Berechnungen wurden mit Matlab durchgeführt (siehe Skript als Zusatzdatei 1).

  1. Individuelle Größenverteilung
    1. Die letzte Spalte der Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt-Datei enthält die validierte Klassifizierung der Objekte. Wählen Sie nur die Objekte aus, die als Makroinvertebraten klassifiziert sind, um ihre individuelle Größenverteilung in der Stichprobe darzustellen.
      ANMERKUNG: Die individuelle Körpergröße entspricht dem ellipsoiden Volumen der Makroinvertebraten. Das System liefert Messungen in Pixeln.
    2. Verketten Sie die Vektoren mit den Größenmaßen beider Scans, da jeder Bruch einen anderen Subsampling-Exponenten hat. Korrigieren Sie vor der Verkettung die Fraktionierung, indem Sie die Größenvektoren so oft replizieren, wie die entsprechende Teilprobe fraktioniert wurde.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, wenn ein Scan einem Bruchteil einer Probe entspricht (d. h. grob oder fein).
    3. Berechnen Sie das ellipsoidale Volumen aus der Haupt- (M) und der Nebenachse (m) von prolatierten Ellipsoiden mit den gleichen Pixelflächen wie die Organismen. Konvertieren Sie vor der Berechnung des ellipsoiden Volumens die Hauptachse (M) und die Nebenachse (m) von Pixeln in Millimeter (mm) mit dem folgenden Umrechnungsfaktor (cf):
      1 Pixel = 2.400 dpi
      1 Zoll = 25,4 mm
      cf = 25,4/2400
      Das ellipsoide Volumen (ellipVol mit Einheiten in mm3) entspricht:
      figure-protocol-2
    4. Stellen Sie die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der individuellen Größenverteilung auf derlog-2-Skala dar.
  2. Größenvielfalt
    1. Berechnen Sie die Größendiversität (Sd) nach Quintana et al. (2008)8, wie in García-Comas et al. (2016)35:
      figure-protocol-3
      wobei p x(x) die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der Größe x und x log2 (ellipVol) darstellt. Bei diesem Maß handelt es sich also um den Shannon-Diversitätsindex, der an ein kontinuierliches Maß angepasst ist, wie z.B. die individuelle Größenverteilung in einer Gemeinschaft.
  3. Normalisiertes Biovolumengrößenspektrum (NBSS)
    1. Definieren Sie die Größenklassen des NBSS, legen Sie die untere Grenze des Spektrums als 0,01-Quantil der Größenverteilung der Makroinvertebraten in den Proben fest und erstellen Sie Größenklassen durch eine geometrische Skala der Basis 2, bis der größte Organismus in den Proben eingeschlossen ist.
      HINWEIS: Die Breite der Größenklasse nimmt mit der Größe zu, um der größeren Variabilität Rechnung zu tragen, die mit größeren Größen verbunden ist. Die NBSS der hier analysierten Makroinvertebratengemeinschaften hatte 14 Größenklassen (Tabelle 1).
    2. Man erhält das normalisierte Biovolumen, indem man das gesamte Biovolumen in jeder Größenklasse durch die Breite der Größenklasse dividiert.
  4. Größenspektrum Steigung
    1. Berechnen Sie die lineare Steigung des NBSS.
      ANMERKUNG: Die Steigung (μ) wird auf der Grundlage des Verhältnisses zwischen log 2 (Größenklassenmittelpunkt) und log2 (normalisierte Biomasse) in den Größenklassen größer als der Modus berechnet, wobei leere Klassen (in dieser Studie die Größenklassen von 3 bis 14) ignoriert werden.
Größenklassenbeschränkungen (mm3)Größenklasse Mittelpunkt (mm3)
0,12360,1855
0,24730,3709
0,49460,7418
0,98911,4837
1,97831,4837
3,95605,9348
7,913111,8696
15,826123,7392
31,652247,4783
63,304494,9567
126,6089189,9133
253,2178379,8267
506,43007597,7000
1012,900015193,0000
2025,7000

Tabelle 1: Größenklassen des normierten Biomassegrößenspektrums (NBSS). Die Tabelle zeigt auch die 15 Größenklassengrenzen und die Größenklassenmittelpunkte der Organismen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erfassung digitaler Bilder von Makroinvertebratenproben
Scan-Nuancen: Ethanol-Ablagerung im Scan-Fach
Beim Testen des Systems auf Makroinvertebraten waren mehrere Scans von schlechter Qualität. Ein dunkler, gesättigter Bereich im Hintergrund verhinderte eine normale Bildbearbeitung und die Messung der einzelnen Größen der Makroinvertebraten (Abbildung 2). Es wurden mehrere Gründe für das Auftreten von gesättigten Bereichen im Hintergrund oder stark ver...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Anpassung der von Gorsky et al. 2010 beschriebenen Methodik für Flussmakroinvertebraten ermöglicht eine hohe Klassifikationsgenauigkeit bei der Schätzung der Gemeinschaftsgrößenstruktur bei Süßwasser-Makroinvertebraten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Protokoll die Zeit für die Schätzung der individuellen Größenstruktur in einer Probe auf etwa 1 Stunde reduzieren kann. Daher soll das vorgeschlagene Protokoll die routinemäßige Verwendung von Größenspektren von Makroinvertebraten als schnellen und integrativ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten unterstützt (Förderkennzeichen RTI2018-095363-B-I00). Wir danken den CERM-UVic-UCC-Mitgliedern Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach und Núria Sellarès für ihre Arbeit bei der Probenahme und Laborsortierung von Makroinvertebraten und David Albesa für die Mitarbeit bei der Probensuche. Abschließend danken wir Josep Maria Gili und dem Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) für die Nutzung der Laboreinrichtungen und des Scanners.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BecherLabboxAndere Behälter könnten verwendet werden
Dionisiertes WasserIcopresa  8420239600123Zur Verdünnung des
EthanoltrichtersVitlab41094
Glasfläschchen 8 mlLabboxSVSN-C10-1951 Fläschchen/Teilprobe
ImageJ Software Kostenloser ZugangVersion 4.41o/ Bildbearbeitungssoftware
Large frameHydroptic  Zur Verfügung gestellt von ZooScan24,5 cm x 15,8 cm
Monalcol 96 (Ethanol 96)Montplet1050JE001
Plankton Identifier SoftwareFreier ZugangVersion 1.2.6/ Automatische Identifikationssoftware
SiebCisa26852.2Nennöffnung 500&Mikro und Nennöffnung 0,5 cm
PinzetteBondlineB5SARostfrei, antimagnetisch, Anti-Säure
VueScan 9 x 64 (9.5.09) SoftwareHydropticVersion 9.0.51/ Sacn Software
HolznadelJede Kunststoff- oder Holznadel kann verwendet werden
Zooprocess Software Kostenloser ZugangVersion 7.14/Bildbearbeitungssoftware
ZooScan Hydroptic54Version III/ Scanner

References

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