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Methodenartikel

Kopfimplantate für die Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten

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DOI:

10.3791/64324

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7. September 2022

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein detailliertes neues Verfahren zur funktionellen Bildgebung von wachen, kopffixierten Ratten wird beschrieben.

Zusammenfassung

Anästhetika, die häufig in der präklinischen und grundlagenwissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden, haben einen depressiven Einfluss auf die metabolischen, neuronalen und vaskulären Funktionen des Gehirns und können neurophysiologische Ergebnisse negativ beeinflussen. Die Verwendung wacher Tiere für Forschungsstudien ist vorteilhaft, stellt aber die große Herausforderung dar, die Tiere ruhig und stationär zu halten, um Bewegungsartefakte während der gesamten Datenerfassung zu minimieren. Die Bildgebung im Wachzustand bei kleineren Nagetieren (z. B. Mäusen) ist sehr häufig, bleibt aber bei Ratten selten, da Ratten größer und stärker sind und eine größere Tendenz haben, sich Bewegungsbeschränkungen und Kopffixierungen über die langen Zeiträume zu widersetzen, die für die Bildgebung erforderlich sind. Ein neues Modell der Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten unter Verwendung von maßgeschneiderten handgenähten Schlingen, 3D-gedruckten Kopfimplantaten, Kopfkappen und einem Kopfgestell wird beschrieben. Die Ergebnisse, die nach einem einzigen Versuch mit der Stimulation eines einzelnen Schnurrhaars erzielt wurden, deuten auf eine Zunahme der Intensität der evozierten funktionellen Antwort hin. Die Erfassung der evozierten funktionellen Antwort von wachen, kopffixierten Ratten ist schneller als die von anästhesierten Ratten, zuverlässig, reproduzierbar und kann für wiederholte Längsschnittstudien verwendet werden.

Einleitung

Die meisten grundlegenden, präklinischen und translationalen wissenschaftlichen Neuroimaging-Untersuchungen werden von anästhesierten Tieren gewonnen 1,2. Anästhetika erleichtern das Experimentieren, beeinflussen aber kontinuierlich den Stoffwechsel des Gehirns und des Körpers, den Blutdruck und die Herzfrequenz3. Die Art des Anästhetikums sowie die Dauer und der Verabreichungsweg fügen der Dateninterpretation Störvariablen hinzu, die zur Reproduzierbarkeit und zu Translationsfehlern beitragen können4. Ein großer Engpass bei wachen, kopffixierten Neuroimaging-Studien an Ratten ist die Anforderung, die Ratte während des gesamten Vorbereitungs- und Datenerfassungsprozesses stationär und ruhig zu halten. Kleine Bewegungen erzeugen ungerechtfertigte Bewegungsartefakte, die sich negativ auf die Datenanalyse und -interpretation auswirken können.

Es wurde ein neues Modell der Neurobildgebung von wachen, kopffixierten Ratten mit maßgeschneiderten Schlingen, dreidimensionalen (3D) gedruckten Kopfimplantaten, Kopfkappen und einem Kopfgestell entwickelt, das mehrere Vorteile für einfache Experimente bietet. Das 3D-Kopfimplantat ist leicht und bedeckt einen kleinen Teil des Schädels, der für die Transfixierung benötigt wird. Die 3D-gedruckten Kopfimplantate und -kappen werden mit Hilfe von CAD-Software (Computer-Aided Design) entworfen. Die Protokolle der Schnurrhaarstimulation, der Datenerfassung, der Datenanalyse und der Ergebnisse von anästhesierten Ratten wurden in früheren Arbeiten ausführlich beschrieben 5,6,7.

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Protokoll

Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien des National Institute of Health und wurden von der University of California, Irvine Animal Care and Use Committee, genehmigt. Sieben Männchen und eine weibliche Ratte (Sprague-Dawley, Gewicht: 185-350 g) wurden in dieser Studie verwendet. Nach Abschluss der Studie wurden die Ratten mit einer Überdosis Kohlendioxid getötet.

1. Design verschiedener Komponenten

  1. Aufbau des Kopfimplantats:
    1. Stellen Sie das Kopfimplantat mit einer CAD-Software her (Abbildung 1C) und entwerfen Sie es so, dass es den Bereich hinter dem Bregma abbildet, der an die Mittellinie angrenzt, die auf dem somatosensorischen Kortex zentriert ist. Stellen Sie sicher, dass das Kopfimplantat einen Bereich von 0,9 mm bis 1,9 mm auf dem Schädel abdeckt, der vom Bildgebungsbereich entfernt ist.
    2. Verwenden Sie nur drei Schrauben, um das Kopfimplantat am Schädel der Ratte zu verankern. Entwerfen Sie alle Schraubenlöcher so, dass sie auf der gegenüberliegenden Seite der Mittellinie in der kontralateralen Hemisphäre der abgebildeten Hemisphäre verbleiben.
    3. Platzieren Sie einen von innen ausgehöhlten Steg im oberen Teil des Kopfimplantats, damit die Kopfkappe mit Drähten am Kopfimplantat befestigt werden kann, wie in Abbildung 1D gezeigt.
  2. Aufbau der Kopfkappe:
    1. Stellen Sie sicher, dass die Kopfkappe den Bildgebungsbereich vollständig abdeckt und ihn vor jeder Art von Trauma schützt, wie in Abbildung 1A, B gezeigt. Fügen Sie der Kopfkappe eine Krümmung hinzu, damit sie sich an die Form des Kopfes anpasst, ohne die täglichen Aktivitäten des Tieres in den standardmäßig ausgestalteten Käfigen zu erschweren.
    2. Schneiden Sie die Innenseite der Kopfkappe in eine breitere rechteckige Form, so dass der obere Teil des Kopfimplantats hineinpasst, wie in Abbildung 1E gezeigt. Schneiden Sie senkrecht zu diesem Rechteck zwei weitere rechteckige Bereiche ab, um die Kopfkappe am Kopfimplantat zu verankern.
    3. Führen Sie einen Draht durch den oberen ausgehöhlten Stab des Kopfimplantats, um die Kopfkappe auf dem Rattenkopf zu fixieren, wie in Abbildung 1E-G gezeigt. Führen Sie den zweiten Draht auf die gleiche Weise durch.
      Anmerkungen: Diese Drähte können leicht mit einer Zange oder Pinzette entfernt werden. Die 3D-Druckdateien werden (Dateiformat: STL) als Supplemental File 1 und Supplemental File 2 bereitgestellt.
  3. Aufbau des Förderrahmens:
    1. Gestalten Sie das Kopfgestell so, dass sich ein geschnittenes Teil durch den oberen Steg des Kopfimplantats bewegen kann und mit einer Klemme fixiert wird.
    2. Winkeln Sie den anderen geschnittenen Teil an, um zusätzliche Festigkeit zu erhalten, um den Rattenkopf fixiert zu halten, damit die kontralaterale Seite für die Bildgebung vollständig zugänglich ist. Schneiden Sie für diese Studie die Stahlplatte mit einer Zinnschere zu, um das Kopfgestell herzustellen (Abbildung 1H, I).
      HINWEIS: Dieses Teil kann auch 3D-gedruckt werden.

2. Anfängliches Rattentraining

  1. Lassen Sie die Ratten 2-3 Tage lang in ihren Käfigen an die Vivariumsumgebung gewöhnen.
  2. Beginne mit dem Umgang mit der Ratte in einem ruhigen Raum. Öffnen Sie den Käfig und lassen Sie den Experimentator seine Hand für 15-20 Minuten in den Käfig in der Nähe der Ratte stecken, damit sich die Ratte daran gewöhnen kann.
  3. Sobald die Ratte Ruhe zeigt, indem sie sich nicht erschrecken lässt oder vor den Händen des Experimentators wegläuft, heben Sie die Ratte vorsichtig hoch, um sie zu handhaben. Fassen Sie die Ratte jeden Tag 30-45 Minuten lang an, bevor Sie mit dem Schlingentraining trainieren.

3. Schlingentraining

  1. Trainieren Sie die Ratten mindestens 2-3 Tage in den Schlingen vor der chirurgischen Implantation des Kopfimplantats und der Kopfkappe.
  2. Ordnen Sie die Gurtaufstellung wie in Abbildung 2A gezeigt an. Reinigen Sie das Tragegurt-Setup mit Ethanol-Tüchern.
    HINWEIS: Alle Schlingen sind handgenäht und bestehen entweder auf der Unterseite oder auf beiden Seiten aus einem Netzmaterial, wie in Abbildung 2A, B gezeigt.
  3. Für das Schlingentraining betäuben Sie die Ratten mit 4 % Isofluran zur Induktion und 1 % zur Erhaltung, bis kein Quetschreflex der Hinterpfote mehr auftritt.
  4. Legen Sie die Ratten unter Isofluran-Narkose auf eine flexible Plastikfolie mit den Maßen 20 cm x 8 cm (Länge x Breite), wobei 10 cm x 8 cm der Plastikfolie vollständig mit dem weicheren Teil der Velcro bedeckt sind.
    HINWEIS: Die Betäubung der Ratten für das Schlingentraining ist ein optionaler Schritt, der in erster Linie dazu dient, Stress und Angst abzubauen.
  5. Stecken Sie die Ratte in den ersten 2 Tagen des Trainings kuschelig in eine Babysocke (Größe 0-3 Monate) mit dem Kopf durch ein kleines Loch, das am Ende der Socke eingeschnitten ist.
  6. Wickeln Sie ein kleines Stück saugfähiges Pad um den unteren Körperteil, um die Ratte trocken zu halten und Exkremente zu sammeln.
  7. Wickeln Sie die Ratte in ein atmungsaktives Baumwolltuch (Größe: 25 cm x 25 cm). Lege die Ratte auf eine Plastikfolie, auf die Velcro Streifen geklebt sind.
  8. Befestigen Sie die Ratte weiter mit 0,5 cm breiten Velcro Streifen in einem Abstand von 3-6 mm zueinander an der Plastikfolie.
  9. Befestigen Sie die Ratte in der Schlinge. Entfernen Sie die Gasnarkose. Lassen Sie die Ratte sich von der Gasnarkose in der Schlinge erholen.
  10. Wenn die Ratte anfängt zu schlagen, bieten Sie alle 10-15 Minuten ein paar Tropfen 10%ige Saccharoselösung als Belohnung an.
  11. Präsentieren Sie der Ratte nach dem Zufallsprinzip die sensorischen Reize, die während der Bildgebung verwendet werden (hier Schnurrhaarstimulation, alle 15-25 Minuten), um sie an sensorische Reize zu gewöhnen. Stimulieren Sie die Schnurrhaare in zufälligen Abständen manuell.
  12. Trainieren Sie die Ratte an Tag 1 1 Stunde, an Tag 2 2 Stunden und an Tag 3 3 Stunden in der Schlinge, wie in Abbildung 2C gezeigt.

4. Präoperative Vorbereitung

  1. Drucken Sie das Kopfimplantat und die Kopfkappe mit dem 3D-Drucker aus (Abbildung 1).
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Kopfbedeckungen (Implantate und Kappen), indem Sie das Gerät 10 Stunden lang in das keimtötende Mittel Metricide28 tauchen. Spülen Sie die Werkzeuge kurz vor der Operation gründlich mit sterilem Wasser ab.
  3. Setzen Sie die Ratte 4 % Isofluran aus und halten Sie sie dann bei 1 % bis 2 % Isofluran, bis kein Quetschreflex der Hinterpfote mehr auftritt. Diese Operation kann unter vielen Arten von Anästhesie durchgeführt werden, wie z. B. Isofluran, Natrium-Pentobarbital und Ketamin-Xylazin.
  4. Injizieren Sie Atropin (0,05 mg/kg) intramuskulär, um die Schleimsekretion zu reduzieren und die Atmung zu unterstützen.
  5. Rasieren Sie den Kopf der Ratte 5 mm mittig um die Mittellinie herum mit einem Haarschneider, beginnend zwischen den Augen bis zur Rückseite der Ohren.
  6. Überwachen Sie die partielle Sauerstoffsättigung und die Herzfrequenz durch ein Pulsoximeter und eine Herzfrequenzmessersonde, die am Hinterbein der Ratte befestigt sind.
  7. Wischen Sie den Kopf der Ratte und die Umgebung dreimal mit abwechselnden Runden Betadin- und 70%iger Alkoholtücher ab.
  8. Fixiere die Ratte in einem stereotaktischen System.
  9. Führen Sie eine mit Vaseline geschmierte rektale Sonde ein, um die Körpertemperatur der Ratte zu messen, und halten Sie sie durch das Rückkopplungssystem der Heizdecke aufrecht, um eine Unterkühlung nach der Verabreichung des Anästhetikums zu vermeiden.
  10. Lokalanästhetikum Lidocainhydrochlorid in einer Konzentration von 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 Körpergewicht subkutan an der Operationsstelle verabreichen.
  11. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  12. Verabreichen Sie 2 % Lokalanästhetikum subkutan über die Operationsstelle.
  13. Injizieren Sie 3 ml laktatierte Ringerlösung bei Raumtemperatur subkutan, um eine Austrocknung zu verhindern und die Operation mit Nährstoffen zu versorgen.

5. Chirurgie

  1. Entfernen Sie den Teil der Haut über der Operationsstelle (4 mm Durchmesser, zentriert um die Mittellinie und die Mitte des Kopfes) mit einer scharfen chirurgischen Schere. Präparieren und entfernen Sie einen Teil der Haut (~2 mm Durchmesser, über dem linken somatosensorischen Kortex) zwischen Ohr und Auge im temporalen Teil des Kopfes.
  2. Entfernen Sie mit einem Skalpell das darunter liegende Hautgewebe (Perikranium), um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie den Schädel mit sterilisierter Baumwollgaze.
  3. Zurückziehen/Resektieren des Schläfenmuskels, um die gewünschte Größe für den Bildgebungsbereich freizulegen [7,5 mm x 7,5 mm für diese Studie].
  4. Legen Sie den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre für das Kopfimplantat frei. Platzieren Sie das Kopfimplantat auf dem Schädel, um die Position der Verankerungsschrauben für das Implantat zu bestimmen, wie in Abbildung 2D-F gezeigt.
  5. Markieren Sie den Schädel zum Bohren der Schrauben mit Tusche mit Bohrer 1. Bohren Sie die Gratlöcher für die Schrauben mit dem Dentalbohrer 3. Schrauben Sie das Kopfimplantat fest.
  6. Trocknen Sie den Schädel mit steriler Gaze. Tragen Sie eine dünne Schicht Gewebekleber um und unter dem Kopfimplantat auf, um es auf den Schädel zu kleben. Tragen Sie eine Schicht Zahnzement auf, um das Kopfimplantat weiter zu stützen, und lassen Sie den Zement 2-3 Minuten trocknen.
    HINWEIS: Die Verwendung von Gewebekleber zusätzlich zu Zahnzement sorgt für einen starken Halt8.
  7. Dünnen Sie mit dem Dentalbohrer 3 einen 7,5 mm x 7,5 mm großen Bereich auf der linken Seite des Schädels aus, direkt hinter dem Bregma und seitlich der Mittellinie. Verdünnen Sie den Schädel auf ~50 μm, wie in Abbildung 3A gezeigt.
  8. Tragen Sie eine topische antibiotische Salbe auf die Operationsstelle auf und bedecken Sie sie dann mit einer dünnen Schicht Silikonkautschuk, um den ausgedünnten Schädel zu schützen, wie in Abbildung 3B gezeigt. Decken Sie die Operationsstelle mit der Kopfkappe ab, wie in Abbildung 3C gezeigt. Befestigen Sie es mit den beiden kleinen Drähten, die sowohl durch das Kopfimplantat als auch durch die Kopfkappe verlaufen, wie in Abbildung 3D, E gezeigt. Tragen Sie Silikonkautschuk auf, um die Kopfkappe und den Schädel zu bedecken, um die Kopfkappe weiter auf dem Kopf der Ratte zu stabilisieren, wie in Abbildung 3F gezeigt.
    HINWEIS: Silikonkautschuk bietet zusätzlichen Schutz für dünneren Schädel.
  9. Injizieren Sie der Ratte subkutan Flunixin-Meglumin (2,5 mg/kg) zur Schmerz- und Entzündungsbehandlung. Um eine Infektion zu verhindern, injizieren Sie das Enrosit-Antibiotikum Enrofloxacin (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-.01) intraperitoneal.
  10. Bringen Sie die Ratte mit einer wärmenden Decke und einer Wärmelampe in die Aufwachkammer, um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Beobachten Sie die Ratte kontinuierlich, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt und das Brustbein aufrechterhält.
  11. Bringen Sie die Ratte in ihren separaten Käfig zurück, sobald sie sich vollständig erholt hat.
  12. Verabreichen Sie in den nächsten 3 Tagen zweimal täglich Flunixin und Buprenorphin, um Entzündungen und Schmerzen zu lindern, und Enrosit, um Infektionen vorzubeugen.

6. Wache Bildgebung

  1. Betäuben Sie die Ratte mit 4 % Isofluran zur Induktion und 1 % zur Erhaltung, wenn es keinen Quetschreflex für die Hinterpfote gibt. Acepromazin (0,3-0,5 mg/kg) subkutan injizieren.
    HINWEIS: Diese Konzentration von Acepromazin liegt unter dem Niveau einer leichten Sedierung und trägt nur dazu bei, die Ratten während des gesamten Bildgebungsprozesses zu beruhigen.
  2. Befestigen Sie die Ratte mit speziellen Velcro-Streifen auf der Plastikfolie, die während des Trainings verwendet wird. Wickeln Sie den unteren Körperteil mit einem Absorptionskissen ein und legen Sie die Ratte fest in die Schlinge.
  3. Entferne den Silikongummi. Entfernen Sie die Kopfkappe, indem Sie die Befestigungsdrähte entfernen. Befestigen Sie das Kopfgerüst im Kopfimplantat, wie in Abbildung 2G gezeigt.
  4. Verriegeln Sie das Fördergerüst in Klemmen, wie in Abbildung 2H, I gezeigt.
  5. Entfernen Sie die Gasnarkose. Spülen Sie den Bildbereich 3x mit Kochsalzlösung und reinigen Sie ihn mit feuchter Gaze. Trocknen Sie den Abbildungsbereich und machen Sie mit Vaseline eine Vertiefung um den Bildbereich. Füllen Sie die Vertiefung mit sterilisierter Kochsalzlösung und decken Sie sie mit einem Glasobjektträger ab (Abbildung 2E).
  6. Beziehen Sie sich auf die Erfassungsverfahren für die optische Bildgebung mit intrinsischen Signalen, das Whisker-Stimulationsprotokoll sowie die Datenanalyse und -präsentation, die zuvor ausführlich besprochen wurden 6,7.
  7. Überwachen Sie die Ratten während des gesamten Experiments auf Anzeichen von Unruhe und Unruhe, die weiter reduziert werden können, indem die Augen der Ratten mit einem weichen Tuch oder einer Gaze (optional) bedeckt werden.

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Ergebnisse

Die repräsentativen optischen Bildgebungssignale eines einzelnen Versuchs mit einer anästhesierten Ratte und das summierte Ansprechen (von 40 gesammelten Studien) einer wachen Ratte sind dargestellt (Abbildung 4). Die Signalintensität für die Stimulation mit einem Schnurrbart kann bei einer wachen Ratte an einem höheren Schwellenwert als bei der anästhesierten Ratte visualisiert werden, was ein stärkeres Signal des wachen Tieres zeigt. Die C2-Schnurrhaare der Ratten werden 1 s lang mit 5 Hz ...

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Diskussion

Die Verwendung der wachen, kopffixierten Rattenbildgebung bietet viele Vorteile in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit und Individualisierung. Die speziell angefertigten Schlingen ermöglichen es, die Ratten durch atmungsaktives Netzmaterial zu wickeln, so dass die Tiere nicht über längere Zeiträume in geschlossene Rückhaltekammern aus Kunststoff eingeschlossen werdenmüssen 10,11. Ratten werden während der langen Dauer aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen mit ei...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha und Amirsoheil Zareh für ihre Hilfe beim Training der Ratten und bei der Vorbereitung der Schlingen. Die Finanzierung erfolgte durch die National Institutes of Health (NIH, Fördernummer: NS119852) und die Leducq Foundation (Fördernummer: 15CVD02).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RattenCharles RiverSprague Dawley
IsofluranPivetal21295098Vollnarkose
Lidocain HCl 2% InjektionPhoenixL-2000-04Lokalanästhetikum
Atropinsulfat InjektionVedco5098907512Hilfe bei der Atmung
Laktated Ringer's InjektionslösungVedco
Flunixin-InjektionVedco6064408670Schmerztherapie
Enrosit-Injektion (Enrofloxacin 2,27%)VetOne501084Vermeidung von Infektionen
PromAce-Injektion (Acepromazinmaleat)Beohringer Ingelheim136059
Animax-SalbeDechra Veterinärprodukte122-75Wirkstoffe von Nystatin 1000 Einheiten pro Gramm, Neomycinsulfat 2,5 mg pro Gramm, Thiostrepton 2500 Einheiten pro Gramm und Triamcinolonacetonid 1 mg pro Gramm
Puralube AugensalbeDechra Veterinary Products211-38
Povidon-Jod PVP-VorbereitungspadsMedlineMDS093917Betadine
generische IsopropylalkoholtupferBD326895
Vetbond-Gewebe selbstklebend3M1469SB
Bohrer (Bohrer), Standard OperationshartmetallSS Weiße Bohrer14829#3
Bohrer Schrauben, 00-90 x 1/8 Flachkopf EdelstahlJ.I. MorrisF0090CE125Ankerschrauben
Stereotaktisches SystemKopf Instruments1430
Homöotherme HeizdeckeHarvard Apparatus50-7220-F
Pulsoximeter & PulsmesserKent ScientificMouseStat Jr.
PetrolatumFisher ScientificP66-1LBVaseline generischer
Draht, blankes KupferFisher Scientific15-545-2C20 Gauge
Teets Cold Cure PulverPearson DentalC73-0054 Wirkstoff: Methylmethacrylat
Zitzen Cold Cure FlüssigkeitPearson DentalC73-0078 Wirkstoff: Methylmethacrylat
SilikonformgummiSmooth-OnBody Double FastSilicon Polymer
Metricide 28 (Keimtöten)MetrexOct-05
Tusche, schwarzPelikan301051
DentalbohrerNSK DentalUltimate XL-F
3D-DruckerPrusa Researchi3 MK3S+
Befestigungselemente aufnähenVelcro90030
Haustier-SiebgewebeJoann10173334Netzmaterial
Bohrer (Bohrer), Standard OperationshartmetallSS Weiße Bohrer14829#1 Bohrer
50989088317

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Wach-BildgebungNeuroimaging bei Rattenfunktionelle AntwortThin-Skull-Imaging3D-gedruckte Implantatestereotaktisches SystemCalcium-Imagingfunktioneller Ultraschall
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