Method Article

Spermienentnahme und computergestützte Spermienanalyse im Teleostmodell Japanisches Medaka (Oryzias latipes)

DOI:

10.3791/64326

⸱

October 6th, 2022

 ,  , 
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und effiziente Methoden zur Entnahme von Spermien aus dem kleinen Modellfisch Medaka (Oryzias latipes) sowie ein Protokoll zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Japanische Medaka (Oryzias latipes) ist ein Teleostfisch und ein aufstrebendes Wirbeltiermodell für Ökotoxikologie, Entwicklungs-, Genetik- und Physiologieforschung. Medaka wird auch ausgiebig verwendet, um die Fortpflanzung von Wirbeltieren zu untersuchen, was eine wesentliche biologische Funktion ist, da sie es einer Art ermöglicht, sich zu verewigen. Die Spermienqualität ist ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit und damit für den Fortpflanzungserfolg. Techniken zur Extraktion von Spermien und Spermienanalysen sind für viele Arten, einschließlich Teleostfische, gut dokumentiert. Das Sammeln von Spermien ist bei größeren Fischen relativ einfach, kann aber bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermienentnahme beim kleinen Modellfisch, der japanischen Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage. Diese Arbeit zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich die Fische schnell von dem Eingriff erholen. Dieser Artikel beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität objektiv zu bewerten (Motilität, Progressivität, Dauer der Motilität, relative Konzentration). Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Japanischer Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasser-Teleostfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Medaka hat sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodellsystem für Ökotoxikologie, Entwicklungsgenetik, Genomik und evolutionäre Biologie und Physiologie entwickelt 1,2. Ähnlich wie der beliebte Zebrafisch sind sie relativ einfach zu züchten und sehr resistent gegen viele häufige Fischkrankheiten 1,2. Die Verwendung von Medaka als Modell bietet mehrere Vorteile, darunter eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen 1,2 und ein sequenziertes Genom3. Im Gegensatz zu Zebrafischen hat Medaka ein geschlechtsbestimmendes Gen 4 sowie eine hohe Temperatur- (von4-40 °C) und Salzgehaltstoleranz (Euryhaline-Arten)5. Auch viele genetische und anatomische Werkzeuge sowie die Protokolle 6,7,8,9,10,11,12 wurden in Medaka entwickelt, um das Studium seiner Biologie zu erleichtern.

Fortpflanzung ist eine wesentliche physiologische Funktion, da sie es einer Spezies ermöglicht, sich zu verewigen. Die Fortpflanzung von Wirbeltieren erfordert eine Vielzahl von genau orchestrierten Ereignissen, einschließlich der Produktion von Eizellen bei Frauen und der Produktion von Spermien bei Männern. Spermien sind einzigartige Zellen, die durch den komplexen Prozess der Spermatogenese hergestellt werden, in denen es eine Reihe von Kontrollpunkten gibt, um die Lieferung eines hochwertigen Produkts zu gewährleisten13. Die Gametenqualität ist aufgrund ihrer Auswirkungen auf den Befruchtungserfolg und das Überleben der Larven zu einem Schwerpunkt in Aquakultur- und Fischpopulationsstudien geworden. Die Spermienqualität ist daher ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit bei Wirbeltieren.

Drei nützliche Faktoren zur Beurteilung der Qualität von Fischspermien sind Motilität, Progressivität und Langlebigkeit. Prozentuale Motilität und progressive Motilität sind häufige Indikatoren für die Spermienqualität, da progressive Bewegung notwendig ist und stark mit dem Befruchtungserfolg korreliert14,15. Die Dauer der Bewegung ist auch ein wichtiger Indikator bei Fischen, da die Spermien bei den meisten Teleostarten weniger als 2 Minuten lang voll beweglich bleiben und die Flugbahn der Spermien im Allgemeinen weniger linear ist als bei Säugetieren15. Viele Studien, die die Spermienmotilität in der Vergangenheit bewerteten, stützten sich jedoch auf subjektive oder semiquantitative Methoden zur Analyse von Spermien15,16. Zum Beispiel wurde die Spermienmotilität in Medaka in der Vergangenheit visuell unter einem Mikroskop geschätzt17. Es wurde auch geschätzt, indem die Bewegung der Spermien aufgezeichnet und Bildgebungssoftware verwendet wurde, um Rahmen zusammenzuführen und den Schwimmweg und die Geschwindigkeit zu messen18,19,20. Solchen Ansätzen mangelt es oft an Robustheit und liefert je nach Person, die die Analyse durchführt, unterschiedliche Ergebnisse15,21.

Die computergestützte Spermienanalyse (CASA) wurde ursprünglich für Säugetiere entwickelt. CASA ist eine schnelle quantitative Methode zur Beurteilung der Spermienqualität durch automatisierte Aufzeichnung und Messung von Geschwindigkeit und Flugbahn15. Bei Fischen wurde es bei verschiedenen Arten eingesetzt, um die Auswirkungen mehrerer Wasserschadstoffe auf die Spermienqualität zu überwachen, interessante Vorläufer zur Verbesserung des Brutbestands zu identifizieren, die Effizienz der Kryokonservierung und -lagerung zu verbessern und die Bedingungen für die Befruchtung zu optimieren15. Daher ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität bei verschiedenen Wirbeltierarten. Aufgrund der großen Vielfalt der Fortpflanzungsstrategien zwischen den Fischen unterscheidet sich das Sperma von Teleostfischen jedoch von dem von Säugetieren und von einer Fischart zur anderen. Teleostfische, die Eier hauptsächlich äußerlich befruchten, indem sie Gameten ins Wasser abgeben, haben hochkonzentrierte Spermien, die relativ einfach in der Struktur ohne Akrosom sind, im Gegensatz zu Säugetieren, die intern düngen und daher die Verdünnung in Wasser nicht kompensieren müssen, sondern viskoseren Flüssigkeiten standhaltenmüssen 14. Darüber hinaus bewegen sich die Spermien der meisten Fische schnell, sind aber für weniger als 2 Minuten nach der Aktivierung vollständig beweglich, obwohl es mehrere Ausnahmengibt 15,22. Da die Motilität bei den meisten Fischen schnell abnehmen kann, sollte bei der Festlegung eines Spermienanalyseprotokolls für Fische äußerste Vorsicht beim Zeitpunkt der Analyse nach der Aktivierung geboten sein.

Die Fortpflanzung ist eines der Gebiete in der Biologie, in denen Teleosts und Medaka ausgiebig als Modellorganismen eingesetzt wurden. In der Tat zeigen Medaka-Männchen interessante reproduktive und soziale Verhaltensweisen, wie z.B. Mate Guarding23,24. Darüber hinaus existieren mehrere transgene Linien, um die neuroendokrine Kontrolle der Fortpflanzung bei dieser Spezieszu untersuchen 25,26,27. Die Spermienprobenahme, ein Verfahren, das bei größeren Fischen relativ einfach ist, kann bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Aus diesem Grund extrahieren die meisten Studien mit Spermienentnahme in Medaka Milz (Fischsamen) durch Zerkleinern von sezierten Hoden 17,28,29,30. Einige Studien verwenden auch eine modifizierte Bauchmassage, um die Milz direkt in das aktivierende Medium18,19,20 auszudrücken; Mit dieser Methode ist es jedoch schwierig, die Menge und Farbe der extrahierten Milz zu visualisieren. Bei Zebrafischen wird die Bauchmassage häufig verwendet, um Milz auszudrücken, die sofort in einem Kapillarrohr31,32,33 gesammelt wird. Diese Methode ermöglicht die Abschätzung des Milzvolumens sowie die Beobachtung der Ejakulatfarbe, die ein schneller und einfacher Indikator für die Spermienqualitätist 32,33. Daher fehlt für Medaka ein klares und gut beschriebenes Protokoll für die Spermienentnahme und -analyse.

Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermiengewinnung im kleinen Modellfisch Japanese Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage mit Kapillarschläuchen. Es zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich der Fisch schnell von dem Eingriff erholt. Es beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität (Motilität, Progressivität, Langlebigkeit und relative Spermienkonzentration) zuverlässig zu messen. Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) durchgeführt. Die Experimente wurden mit erwachsenen (6-9 Monate alten) männlichen japanischen Medaka (Hd-rR-Stamm) durchgeführt, die am NMBU (Ås, Norwegen) aufgezogen wurden. Die Methoden wurden auch kurz an 9 Monate alten männlichen japanischen Medaka (CAB-Stamm) getestet, die am Nationalen Forschungsinstitut für Landwirtschaft, Ernährung und Umwelt (INRAE, Rennes, Frankreich) aufgezogen wurden.

1. Geräte- und Lösungsvorbereitung

  1. Anästhesie-Stammlösung (0,6% Tricain) vorbereiten.
    1. Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).
    2. Aliquot 2 mL der Anästhesie-Stammlösung in 50 2 mL Kunststoffröhrchen und bei -20 °C bis zur Verwendung zur Anästhesie oder Euthanasie lagern.
  2. Bereiten Sie Rückgewinnungswasser (0,9% Natriumchlorid [NaCl] -Lösung) vor.
    1. 27 g NaCl in 3 L Aquarienwasser geben.
    2. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT).
  3. Stellen Sie ggf. das Aktivierungsmedium ein (Hanks ausgewogene Salzlösung [HBSS]).
    HINWEIS: HBSS kann kommerziell erworben oder im Labor hergestellt werden (Materialtabelle).
    1. Messen Sie den pH-Wert des HBSS mit einem pH-Meter. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Salzsäure oder Natriumhydroxid ein, so dass der endgültige pH-Wert 7,1-7,3 beträgt.
    2. Messen Sie die Osmolalität des HBSS mit einem Osmometer für zukünftige Berichte.
      HINWEIS: Der Bereich des kommerziellen Produkts beträgt 266-294 mOsmol / kg; in der aktuellen Studie betrug die Osmolalität 287 mOsmol/kg. Es kann mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die Osmolalität zu reduzieren, falls gewünscht, aber dies ist nicht notwendig, da es keinen großen Unterschied in der Aktivierung von Medaka-Spermien in 150-300 mOsmol / kg HBSS gibt.
    3. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei RT.
  4. Bereiten Sie den Halteschwamm vor.
    1. Schneiden Sie einen weichen Schwamm so ab, dass er eng in eine Petrischale passt.
    2. Schneiden Sie eine gerade Linie in die Mitte des Schwamms, die lang genug ist, um den Fisch aufzunehmen (3-4 cm) und etwa 1 cm tief ist (Abbildung 1A). Dieser Schlitz im Schwamm hält die Fischseite ventral nach oben, um die Kloake freizulegen.

2. Samenentnahme

HINWEIS: Die Spermienentnahme kann durch zwei verschiedene Methoden erreicht werden: Bauchmassage oder Hodendissektion.

  1. Samenentnahme durch Bauchmassage
    1. Bereiten Sie eine 0,03% ige Anästhesielösung vor, indem Sie ein Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 38 ml Aquarienwasser in einem 100-ml-Glasbehälter verdünnen.
    2. Bereiten Sie die Instrumente vor, einschließlich einer glatten stumpfen Pinzette und einer kalibrierten 10-μL-Einweg-Glasmikropipette und einer Ansaugröhre (Abbildung 1A). Befeuchten Sie den in Schritt 1.4 vorbereiteten Halteschwamm mit der Narkoselösung.
    3. Röhrchen mit 36 μL der aktivierenden Lösung für die sofortige Analyse vorbereiten. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
      HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Wenn Sie Proben von mehreren Fischen poolen, verwenden Sie 36 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren.
    4. Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in eine Betäubungslösung geben.
      HINWEIS: Die Anästhesiedauer muss angepasst werden, da sie je nach Größe des Fisches variiert. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kneifen Sie den Schwanzstiel vorsichtig mit einer Pinzette. Wenn der Fisch nicht reagiert, kann die Massage gestartet werden.
    5. Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung und verwenden Sie ein Papiertuch oder wischen Sie vorsichtig ab, um den Bauch des Fisches zu trocknen. Legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in den Trog des feuchten Schwamms, so dass seine Kiemen der Anästhesielösung im Schwamm ausgesetzt sind (Abbildung 1B).
    6. Wenn der Bereich um die Kloake nass ist, trocknen Sie die Unterseite des Fisches vorsichtig mit einem Einwegtuchtuch.
    7. Legen Sie den Fisch in den Halteschwamm unter ein Seziermikroskop und legen Sie die Mikropipette mit einem Ansaugrohr gegen die Kloake des Fisches (Abbildung 1C).
    8. Massieren Sie den Bauch des Fisches, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen glatten Pinzette in einer rostralen bis kaudalen Bewegung zusammendrücken und gleichzeitig saugen, um die ausgestoßene Milz in die Pipette zu sammeln (Abbildung 1D).
    9. Lassen Sie die Fische vom Schwamm in das Erholungswasser fallen. Lassen Sie sie mindestens 15 Minuten in der Lösung erholen, bevor Sie sie in das Aquariensystem zurückbringen.
    10. Die Milz in ein vorbereitetes Röhrchen mit vorgewärmter Aktivierungslösung geben und mehrmals durch Saugen und Blasen am Absaugrohr auf und ab pipettieren.
    11. Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
      HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.
  2. Spermienentnahme durch Hodendissektion
    1. Bereiten Sie 0,08% ige Euthanasielösung vor, indem Sie zwei Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 26 ml Aquarienwasser in einem 100 ml Glasbehälter verdünnen.
    2. Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich stumpfer und feiner Pinzetten und kleiner Sezierscheren (Abbildung 1E).
    3. Bereiten Sie für jede Probe ein Röhrchen mit 120 μL Aktivierungslösung für die sofortige Analyse vor. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
      HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Verwenden Sie für die Pooling-Proben von mehreren Fischen 120 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren.
    4. Euthanasieren Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in die 0,08% ige Anästhesielösung geben.
      HINWEIS: Die Dauer hängt von der Größe des Fisches ab. Um sicherzustellen, dass der Fisch eingeschläfert wird, warten Sie, bis die Bewegungen des Operculums aufhören. Der Fisch sollte nicht auf die Berührung einer Pinzette reagieren.
    5. Entfernen Sie den Fisch aus der Euthanasielösung und trocknen Sie den Fisch vorsichtig mit einem Papiertuch oder wischen Sie ihn vorsichtig ab.
      HINWEIS: In diesem Schritt können die Fische gewogen werden, um später den gonadosomatischen Index (GSI, Gonadengewicht / Körpergewicht) zu berechnen.
    6. Legen Sie den Fisch mit der linken seitlichen Seite nach oben unter ein Seziermikroskop (Abbildung 1F).
    7. Schneiden Sie mit einer kleinen Sezierschere einen Lappen dorsal von der Kloake ab und dann über die Rippen zu den Kiemen, um die inneren Organe freizulegen (Abbildung 1G).
    8. Suchen Sie die Hoden, schneiden Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette ab, und entfernen Sie die Hoden (Abbildung 1H).
      HINWEIS: Zur Berechnung des GSI können die Hoden in diesem Schritt gewogen werden. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
    9. Die Hoden mit der vorgewärmten Aktivierungslösung in ein vorbereitetes Röhrchen geben.
    10. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hoden mehrmals gegen die Seite der Röhre zu drücken, um das Sperma freizusetzen. Die Spermienfreisetzung kann normalerweise visualisiert werden und macht die Lösung leicht trüb.
    11. Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
      HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Milzentnahme durch Bauchmassage (A-D) und Hodendissektion (E-H). (A) Instrumente für die Bauchmassage: Halteschwamm, stumpfe glatte Pinzette und 10 μL Einweg-kalibrierte Glasmikropipette mit Absaugrohranordnung; (B) Position der Fische im Haltungsschwamm, wobei die Betäubungskiemen im Schwamm und in der Kloake nach oben zeigen; (C) Position der stumpfen glatten Pinzette auf dem Bauch und Mikropipette gegen Kloake; (D) Milzen in Mikropipette nach sanfter Massage und Saugen. (E) Instrumente zur Hodendissektion: stumpfe Pinzetten, feine Pinzetten und kleine Sezierscheren; (F) Position der Fische für die Hodendissektion; (G) Seitenansicht der inneren Organe; (H) Entfernen Sie die Hoden, indem Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette schneiden. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Spermienanalyse mit CASA-System

  1. Das CASA-System (SCA Evolution) sollte gemäß Handbuch mit einem Mikroskop mit grünem Filter und 10x-Objektiv mit Phasenkontrast eingerichtet werden.
  2. Bereiten Sie Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger durch Vorwärmen auf einer Wärmeplatte oder in einem auf 27 °C eingestellten Inkubator für mindestens 5 min vor.
  3. Öffnen Sie die Spermienanalyse-Software und wählen Sie das Motilitätsmodul.
  4. Legen Sie die Konfiguration für die Medaka fest, wie in Abbildung 2B dargestellt.
  5. Legen Sie einen vorgewärmten Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger unter das Mikroskop auf einen auf 27 °C eingestellten Heiztisch.
  6. Pipettieren Sie die Probe in die Kammer auf dem Objektträger, bis sie die Kammer ohne Überfüllung füllt. Wischen Sie überschüssige Proben vorsichtig mit einer Baumwollspitze vom Eingang der Kammer ab oder wischen Sie vorsichtig ab, um schwimmende Zellen zu vermeiden.
  7. Wählen Sie Analysieren , um die Probe unter dem Mikroskop zu betrachten.
    HINWEIS: Wenn das Mikroskopsymbol rot ist, muss die Mikroskopbeleuchtung angepasst werden, damit das Programm Spermien genau verfolgt. Stellen Sie die Helligkeit des Mikroskops so ein, dass die Schwanzbewegung der Spermien deutlich zu sehen ist. Das Symbol sollte blau sein.
  8. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop fokussiert ist, und wählen Sie erneut Analysieren , um die Spermien im Feld aufzuzeichnen. Verschieben Sie die Folie so, dass sich ein neuer Bereich der Probe im Rahmen befindet, und wiederholen Sie den Vorgang für 3-5 verschiedene Sichtfelder. Vermeiden Sie Felder mit Luftblasen, Zellmassen oder Artefakten.
  9. Wählen Sie Ergebnisse aus, um die Ergebnisse anzuzeigen.
    HINWEIS: Wenn die Felder auf der Ergebnisseite rot umrandet sind, folgen Sie den Anweisungen des Systems, um die Felder zu löschen, die sich zu sehr in Konzentration oder Motilität unterscheiden.
  10. Doppelklicken Sie auf ein Feld, um die Ergebnisse für das einzelne Feld anzuzeigen oder manuell nach falsch beschrifteten oder nicht verfolgten Spermatozoen zu suchen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einzelne Spermatozoen, um die Motilität bei Bedarf neu zu kennzeichnen (Abbildung 2A).

figure-protocol-2
Abbildung 2: Screenshot der SCA Evolution-Software . (A) Ergebnisse der Spermienverfolgung für ein Feld. Zeigen Sie Felddaten auf der rechten Seite an und doppelklicken Sie auf Spermatozoen, um einzelne Daten anzuzeigen. (B) Ergebnisübersicht für alle Felder mit geöffnetem Konfigurationsmenü. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Art der erhaltenen Daten
Die Spermienmotilitätsanalyse der SCA Evolution-Software liefert Daten zur Motilität (Prozentsatz der beweglichen und unbeweglichen Spermien) sowie zur Progressivität (Prozentsatz der progressiven und nicht progressiven Spermien) und zur Geschwindigkeit (Prozentsatz der schnellen, mittleren und langsam beweglichen Spermien). Es kombiniert auch Progressivität und Geschwindigkeit (schnell progressiv, mittel progressiv, nicht progressiv). Diese Bezeichnungen basieren auf Messunge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osmolalität ist ein wichtiger Faktor bei der Aktivierung von Fischspermien36,37. Im Allgemeinen sind Spermien in den Hoden unbeweglich und werden beweglich in Medien, die im Verhältnis zur Samenflüssigkeit für Meeresfische hyperosmotisch und bei Süßwasserfischen hypoosmotisch relativ zur Samenflüssigkeit sind37. Ähnlich wie Blut ist das Samenplasma bei Süßwasserfischen typischerweise niedriger als bei Meeresfischen (etwa 300 mOsmol/kg im V...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Norwegian University of Life Sciences und dem US-amerikanischen Fulbright-Programm finanziert. Die Autoren danken Anthony Peltier und Lourdes Carreon G Tan von NMBU für die Wartung von Fischanlagen und Guillaume Gourmelin vom ISC LPGP am INRAE (Frankreich) für die Bereitstellung von Fisch- und Laborräumen, um diese Methoden weiter zu testen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL RöhrchenAxygenMCT-150-CJede Standardmarke kann verwendet werden
10 & Mikro; L kalibrierte Einwegglas-Mikropipette und Aspirator-RöhrchenbaugruppeDrummond2-000-010
10x Objektiv mit PhasenkontrastNikonMRP90100
2 mL RöhrchenAxygenMCT-200-c-sStandardmarke kann verwendet werden
Blunt PinzetteFine Science Tools11000-12
Blunt glatte PinzetteMilliporeXX6200006P
Einweg-Objektträger mit 20 Mikron ZählkammerMicroptic20.2.25 Leja 2-Kammer-Rutschen
PräpariermikroskopOlympusSZX7Jede Standardmarke kann verwendet werden
Feine PinzetteFine Science Tools11253-20
HBSSSigmaaldrichH8264-1L
Halteschwammselbst gebaut
Inverses MikroskopNikonEclipse Ts2R
SCA EvolutionMicroptic
Kleine PräparierschereFine Science Tools14090-09
Natriumchlorid (NaCl)SigmaaldrichS9888
Tisch-VortexLabnetC1301B
TricainSigmaaldrichA5040
Jede

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843(2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790(2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768(2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937(2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006(2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491(2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757(2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7(2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174(2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sperm CollectionComputer Assisted Sperm AnalysisJapanese MedakaTeleost FishAbdominal MassageTestes DissectionSperm MotilitySperm QualityFertility AssessmentEcotoxicology Model

Related Articles