Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av flytende mesenterisk lymfe hos mus for å kvantifisere in vivo kinetikk av lipidabsorpsjon i kosten og kylomikronsekresjon

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64338
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, School of Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Denne protokollen beskriver en detaljert kirurgisk protokoll for isolering av flytende tarmlymfe som respons på intraduodenale næringsinfusjoner hos mus. Dette muliggjør fysiologisk bestemmelse av total intestinal lipidabsorpsjon og kylomikronsyntese og sekresjon som respons på ulike eksperimentelle næringsstoffer.

Abstract

Intestinale lipoproteiner, spesielt triglyseridrike kylomikroner, er en viktig driver for metabolisme, betennelse og kardiovaskulære sykdommer. Imidlertid er isolering av intestinale lipoproteiner svært vanskelig in vivo fordi de først utskilles fra tynntarmen til mesenterisk lymfatikk. Lymfe som inneholder kylomikron tømmes deretter i den subklaviske venen fra thoraxkanalen for å levere komponenter av måltidet til hjertet, lungene og til slutt helkroppssirkulasjonen. Isolering av naive kylomikroner er umulig fra blod siden kylomikrontriglyserid gjennomgår hydrolyse umiddelbart etter interaksjon med lipoproteinlipase og andre lipoproteinreseptorer i sirkulasjon. Derfor har den opprinnelige 2-dagers lymfefistelprosedyren, beskrevet av Bollman et al. hos rotter, historisk blitt brukt til å isolere fersk mesenterisk lymfe før den kommer inn i thoraxvenen. Denne protokollen har blitt forbedret og profesjonalisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene, noe som gjør det mulig å analysere disse kritiske lipoproteinene og sekresjonene fra tarmen. Tso lymfefistelprosedyren er nå oppdatert og presenteres her visuelt for første gang. Denne reviderte prosedyren er en en-dagers kirurgisk teknikk for å installere et duodenalt fôringsrør, kanylere den mesenteriske lymfekanalen og samle lymfe etter et måltid i bevisste mus. De største fordelene med disse nye teknikkene inkluderer evnen til å reproduserbart samle lymfe fra mus (som utnytter kraften til genetiske musemodeller); redusert anestesitid for mus under implantasjonen av duodenalt infusjonsrør og lymfekanylen; evnen til kontinuerlig å prøve lymf gjennom fôring og postprandial periode; evnen til kvantitativt å måle hormoner og cytokiner før fortynning og enzymatisk hydrolyse i blod; og evnen til å samle store mengder lymfe for å isolere intestinale lipoproteiner. Denne teknikken er et kraftig verktøy for direkte og kvantitativt måling av næringsopptak i kosten, intestinal lipoproteinsyntese og kylomikronsekresjon.

Introduction

Den fysiologiske betydningen av det mesenteriske lymfesystemet
De mesenteriske lymfatene har blitt beskrevet i en eller annen form siden ~300 f.Kr. da Herophilos beskrev det hepatiske portalsystemet og alle de "absorberende venene i tarmene"1,2,3,4,5. I mer enn 1,700 år etter denne første beskrivelsen var et definerende kjennetegn ved tarmlymfe tilstedeværelsen av melkeaktig væske i mesenterisk lymfe kort tid etter et måltid3. Det er nå kjent at melkeaktig, kylomikronholdig lymfe ("chylous" lymfe) ikke drenerer inn i portvenen og leveren, men i stedet beveger seg gjennom cisterna chyli inn i thoraxkanalen og til slutt slutter seg til blodet i venstre subklaviske vene6. På grunn av dette anatomiske arrangementet reiser chylous lymfe først gjennom hjertet og lungene før de sirkulerer gjennom resten av kroppen. Dette betyr at hjertet og lungene får en "first-pass" ved sekretene i mesenterisk lymfe7.

En viktig rolle for mesenterisk lymfe er deres transport av diettlipider fra tynntarmen 8,9,10. Anatomisk, kylomikroner, intestinale immunceller 11,12,13,14, tarmhormoner 15,16,17,18, antigener 19,20,21, ikke-kylomikron lipofile forbindelser22,23 , og overflødig væske kommer inn i laktealene som ligger under enterocyttkjellermembranen og konsentreres deretter gjennom lymfatiske kapillærene til mesenteriske lymfeknuter. Det er sannsynligvis mange ukjente mesenteriske lymfatiske komponenter, inkludert metabolitter, antigener, miljøforurensninger, næringsstoffer og signalmolekyler.

Komponentene i mesenterisk lymf har ikke blitt systematisk identifisert, hovedsakelig på grunn av vanskeligheten med å isolere mesenterisk lymfe. Tilgang til mesenterisk lymfe har alltid vært en alvorlig utfordring fordi lymfekanaler er fargeløse, og bortsett fra etter et fettmåltid når de blir chylous og melkeaktig, inneholder mesenterisk lymfe fargeløs lymfatisk væske 6,8,9,10.

Nåværende og allmenne metoder for isolering av tarmlymfe
Mesenterisk lymfe kan ikke nås hos mennesker (bortsett fra sjeldne og ekstreme omstendigheter der alvorlige GI-traumer har oppstått)24. In vivo lymfekolleksjon er kirurgisk kompleks og krevende. Den opprinnelige 2 dagers lymfefistelprosedyren ble beskrevet av Bollman et al.25 og har blitt forbedret og profesjonalisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene 26,27. Lymfefistelprosedyren gjør det mulig for etterforskere å samle flytende lymfe fra bevisste dyr i løpet av en 6 timers duodenal lipidinfusjonsperiode.

Lymfefistelmodellen har hovedsakelig blitt brukt hos rotter for å måle lymfestrømningshastighet, utgangen av triglyserid og kolesterol (eller andre duodenalinfuserte forbindelser), kylomikronsammensetning og tarmhormonkonsentrasjoner. I mindre grad kan denne teknikken også brukes på mus, selv om kirurgisk overlevelse og lymfevolum lider. På grunn av vanskelighetene med å se mesenteriske lymfekanaler, har historiske metoder inkludert kanylering av mesenterisk lymfe hos større dyr som minigriser28, sauer29, griser30, hunder31 og rotter17. Å jobbe med disse større modellene er ressurskrevende og tillater ikke studier i knock-in eller knock-out modeller.

Alternative tilnærminger har også blitt brukt. Chylomikroner kan isoleres fra blod i postprandial tilstand (selv om disse vil bli delvis hydrolysert av plasma lipoprotein lipase)32,33,34,35. Thoraxkanalen kan også kanyleres, selv om lymfene samlet der inneholder en blanding av mesenterisk lymfe og ekstra-intestinal lymfedrenasje26,36. In vitro skiller Caco-2-celler ut en kylomikronlignende partikkel som respons på fettsyrebehandling, og disse cellene kan dyrkes sammen med relevante lymfatiske endotel- eller vaskulære celler37,38. Humane og musintestinale organoidkulturer har vist seg å behandle apikale lipider og utskille kylomikroner 39,40,41,42. Disse modellene er svært fordelaktige og muliggjør mekanistisk innsikt i tynntarmsfysiologi, men de kan ikke gjenskape kompleksiteten, fysio-kjemiske gradienter eller dynamisk lymfestrøm av in situ mesenteriske lymfatika.

Fordeler med 1 dag mus lymfe fistel modell presentert her
Med hensyn til disse andre metodene for å isolere intestinale lipoproteiner, har Tso Lab lymfefistelteknikk tradisjonelt blitt ansett som gullstandardteknikken for å måle absorpsjonen av næringsstoffer i mesenterisk lymfe. Denne in vivo-teknikken har fordelen av å fange viktige fysiologiske aspekter ved lipidabsorpsjon i kosten - det dynamiske utseendet av forbindelser over absorpsjonsperioden, noe som krever gjentatt prøvetaking av flytende mesenterisk lymf hos levende dyr med duodenale næringsstoffer. Denne kirurgiske teknikken måler også tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rom i stedet for i blod, hvor de fortynnes og enzymatisk nedbrytes17,43.

Hvis det eksperimentelle spørsmålet krever forståelse av lipidsekresjonsdynamikk eller dynamisk absorpsjon og metabolisme av en hvilken som helst hydrofob GI-forbindelse eller medikament, er denne teknikken ikke bare hensiktsmessig, men er også den eneste tilnærmingen som interpolerer bevegelsen av luminalinnhold fra den proksimale til distale tarmen (mage til tykktarm) og fra den apikale til den basolaterale overflaten (luminalinnhold gjennom enterocytt til laktealer og portalsirkulasjon). Siden denne teknikken benytter luminal levering av næringsstoffer gjennom det intraduodenale kateteret, og fordi den flytende mesenteriske lymfen blir avledet og samlet, er hele absorpsjonsapparatet under eksperimentell kontroll og kan brukes til å kvalitativt vurdere små intestinale absorpsjonsprofiler.

Presentert visuelt her for første gang er en stor oppdatering av Tso Lab lymfefistelmodellen, som (1) reduserer eksperimentell tid til en 1 dags kirurgisk implantasjon og eksperimentell innsamlingsperiode; (2) forbedrer museoverlevelse og dyrevelferdshensyn; og (3) øker reproduserbarheten av tilnærmingen hos mus for å utnytte kraften til musegenetiske modeller. Denne teknikken må betraktes som en gullstandard for alle eksperimentelle spørsmål om tarmsekresjoner, lipoproteiner eller diettlipidabsorpsjon og er den beste teknikken for høy-fidelitetsbestemmelse av lipidabsorpsjonskinetikk og kylomikroner.

Protocol

Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av University of Pittsburgh Internal Animal Care and Use Committee [protokoll # 20047008] og overholder NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. C57BL6/J hannmus, 8-14 ukers alder, ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Alle musene ble plassert på en 12 timers lys / mørk syklus med ad libitum tilgang til standard chow og vann.

1. Dyr forberedelse

  1. Avhengig av eksperimentell design, mate musene eller la dem faste.
    MERK: En nattfaste er unødvendig med mindre det er bekymringer om forskjeller i graden av magetømming.
  2. Indusere anestesi med 5% isofluran gass og sørg for riktig bedøvelse ved hale og tå klemme. Når de er bedøvet, hold musene på et riktig bedøvelsesplan med 2% -3% isofluran gass og plasser dem med tape på kirurgisk plattform.
  3. Hold musene varme på en oppvarmet kirurgisk plattform som bruker sirkulerende varmt vann (se materialfortegnelse).

2. Kirurgi og eksperimentell design

  1. Start operasjonen ved å påføre veterinærsalve på øynene, barbere magen og påføre antiseptisk kirurgisk skrubb (se materialfortegnelse) på operasjonsstedet. Dette steriliserer snittet og reduserer genereringen av luftbåren pels under midtlinjesnittet.
  2. Opprettholde et sterilt arbeidsområde ved å benytte sterile instrumenter, gardiner og annet utstyr og forsyninger som trengs.
  3. Injiser den første dosen med karprofen (se materialfortegnelse) for smertelindring (i.p.) i en dose på 5 mg/kg.
  4. Ta tak i huden med pinsett og lag et midtlinjesnitt med en liten saks. Skjær mot brystbenet (aldri over) og skjær ned til lyskefettet. Skjær deretter gjennom muskellaget separat ved hjelp av saksen.
    MERK: Steriliser alt utstyr før bruk.
  5. Bruk retractoren, flytt peritoneal viscera ut av veien til lymfekanalen er synlig.
  6. Bruk en saltvannsdynket Q-tip (se materialfortegnelse), flytt leveren mot øverste høyre side av kroppen og tarmene og magen til venstre for dyret.
  7. Strekk duodenum mot venstre på tvers for å eksponere arteria mesenterica superior og tarmlymfekanalen.
  8. Forbered en 30-40 cm lengde kanyleslange ved å stikke en butt nål i kanyleslangen (se materialfortegnelse) og skyll en liten mengde heparin (1000 U / L) gjennom røret ved hjelp av en 1 ml sprøyte.
    MERK: Lymfestrømmen assisteres av tyngdekraften til å strømme ned og inn i mikrosentrifugeoppsamlingsrørene på is. Avhengig av hvor oppsamlingsisbøtta er plassert ved siden av det kirurgiske oppsettet, kan lengden på kanyleslangen måtte justeres.
  9. Bruk saks til å klippe en skråkant på tuppen av kanyleslangen.
  10. Lag et grunt snitt med irissaks (se materialfortegnelse) i lymfekanalen ca. 5 mm fra utseendet i tynntarmen.
  11. Hold kanyleslangen med et par fine tang og sett forsiktig spissen skrått opp i kanalen.
    MERK: Det er viktig å ikke presse kanylen for langt inn i kanalen fordi dette kan forhindre lymfestrøm når de tilbaketrukne organene returneres til sin opprinnelige posisjon.
  12. Lymfekanalen er altfor skjøre for manipulasjonene forbundet med å binde kateteret inn med en sutur. Bruk i stedet en dråpe cyanoakrylat lim (se materialfortegnelse) for å lime lymfekanylen inn i den mesenteriske lymfekanalen.
  13. Sjekk for melkeaktig, hvit lymfe (hvis pre-kirurgi olivenolje gavage ble brukt) eller klar lymfe (hvis mus har fastet før operasjonen) som begynner å strømme umiddelbart gjennom lymfefistelkanylen.
    MERK: Kontroller at lymfekanylen er vellykket plassert og lymfe flyter; Fortsett med intraduodenal kanyleplassering.
  14. Bruk en 18 G nål, punkter et hull gjennom pylorusområdet i magen bakre til pylorisk sphincter.
  15. Sett inn duodenal infusjonsslange (se materialfortegnelse) gjennom hullet i magen til ca. 1-2 mm utover pyloruslukkemuskelen i tolvfingertarmen.
  16. Fest med en veskestrengligatur ved hjelp av silke 5-0 sutur (se materialfortegnelse) med en nål mot magen og forsegle med en dråpe cyanoakrylat lim for å forhindre lekkasje.
  17. Start den intraduodenale infusjonen av 5 % glukose-0,9 % saltvann ved 0,3 ml/time.
    MERK: Ved bruk av mus med små variasjoner i kroppsvekt som er omtrent 25 g (~8 uker gamle), er infusjon av glukose/saltvann på 0,3 ml/t passende. Hvis musene er dramatisk større, må infusjonshastigheten justeres oppover for å ta hensyn til endringen i kroppsvekt og blodvolum.
  18. Bytt organene i kroppshulen og sutur (5-0) muskel og hudvev separat.
    MERK: Lymfekanylen og det intraduodenale ernæringsrøret er begge eksteriorisert gjennom samme snitt. Det er ingen forrang for å separere rørene med en sutur og ingen preferanse for vinkelen på utvendigheten av rørene.
  19. Etter operasjonen, men før uttak av bedøvelse, plasser musene forsiktig i Snuggle begrensninger (se Materialtabell) for å begrense motilitet.
    MERK: Kosestøttene hindrer musene i å gripe eller rotere hodet for å tygge på maskene og slangene.
  20. Plasser deretter musene i en klar pleksiglassboks på en rotator med forsiktig gynging, og varm ved hjelp av en temperaturkontrollert kommersielt tilgjengelig amfibie / reptil varmepute festet til siden av inneslutningsboksen. Sørg også for fukting i form av sterile avioniserte vannbeholdere i hjørnene av inneslutningsboksen (se materialfortegnelse).
  21. 30 minutter før isofluran seponeres, gi musene sin andre smertelindrende dose (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).
  22. Avhengig av forsøket, gi musene en kontinuerlig intraduodenal infusjon av 5% glukose-0,9% saltvann med en hastighet på 0,3 ml / t i 1 time.
    MERK: 5% glukose-0,9% saltoppløsning fremstilles ved hjelp av en steril saltvannspose (til menneskelig bruk, pH 7,4) fra apoteket og en steril flaske til menneskelig bruk av 50% dekstrose, i henhold til strenge retningslinjer for sterilitet. Oppløsningen må gjøres fersk og kastes hvis utløpsdatoen er angitt på saltvannsposen eller druesukkerflasken.
  23. Administrer musene med et av lipidene listet opp i tabell 1 som et eksperimentelt lipid via en intraduodenal kanyle (se materialtabellen).
    MERK: For alle data vist i figur 1, SMOFlipid (20% lipid injiserbar emulsjon, USP, se tabell over materialer) ble intraduodenalt infundert. Denne infusjonen, både før og etter intraduodenal lipidbolus, erstatter tapt væske som dreneres gjennom lymfekanalen og er et absolutt krav. Musene er nå klare til å bli infundert med en eksperimentell lipiddose.
  24. Utfør den klassiske lipidinfusjonen av en 0,3 ml lipidemulsjonsbolus (SMOFlipid 20% lipidinjiserbar emulsjon, USP) via det intraduodenale infusjonsrøret (se materialtabellen).
  25. Etter bolusinfusjon av intraduodenale lipider, skift infusjonen tilbake til 5 % glukose-0,9 % saltvann ved 0,3 ml/time kontinuerlig til slutten av forsøket.
  26. Samle lymfeprøvene i forhåndsveide mikrosentrifugerør i 60 minutter og hold lymfene på is. Vei rørene en gang til for å fastslå vekten av lymfe som skilles ut hver 60 min periode.
    MERK: Forvent å samle omtrent 50-300 μL lymfe per time, per mus i ~ 6 timer etter en 0,3 ml lipidbolus.
  27. Lymfe kan strømme i opptil 6 timer etter lipidinfusjonen. Ved 6 timers tid, avlive musene via isofluran og cervikal dislokasjon.
    MERK: En kirurg og / eller laboratorietekniker bør være til stede for å overvåke dyrene gjennom hele forsøket. Under observasjonen, se opp for blodpropper i lymfedrenasjen og endringer i dyreadferd som indikerer smerte / nød. Hvis lymfekanalen er tilstoppet på noe tidspunkt under forsøket, avsluttes forsøket, og dyret avlives. Dyret kan teknisk sett holdes i live i opptil 24 timer etter operasjonen (i henhold til IACUC overlevelseskirurgiske regler). Imidlertid reduseres overlevelsesraten over tid, og 6 timer er en reproduserbar overlevelsesperiode hvor lipidabsorpsjon fortsatt etterligner in vivo-fysiologien , og dyret ikke sliter med overlevelse.
  28. Utfør terminal vevsinnsamling etter eutanasi (trinn 3.1).
    MERK: Forskjellen i diettlipidabsorpsjonsprofiler hos mus holdt i 6-t eller 24-timers etter operasjonen ble nylig testet44. Vi fant at 24-timers prosedyren reduserer dyreoverlevelsesraten og utflukten av diettlipider i lymfen. Av disse grunnene anbefaler vi sterkt 6-h-tilnærmingen. Denne oppdaterte kirurgiske designen reduserer unødvendig dyredød og potensialet for dyrestress i den postkirurgiske perioden. Dette støtter et hovedmål for American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, som er dyr "Replacement, Reduction, Refinement" [ref PMID: 21595115].

3. Innsamling av luminalinnhold og slimhinnevev

  1. På slutten av den 6-timers lipidinfusjonsperioden ofres musene via isofluran og cervikal dislokasjon. Bind begge ender av mage, tynntarm og cecum med 5-0 suturer for å unngå lekkasje av luminalinnholdet.
  2. Samle magen, cecum og kolon, og legg hver inn i et 15 ml glassrør. Del tynntarmen i tre eller fire segmenter, og samle luminalinnholdet ved å skylle vevet i 2-3 ml kald PBS etter å ha kuttet åpent i lengderetningen.
  3. Fjern tarmslimhinnen som består av epitelceller og tilhørende lamina propria fra muskellaget ved å skrape hver seksjon i 2-3 ml kald PBS med en buet pinsett.
  4. Plasser alt vev, luminal- og slimhinneisolatene og muskellaget i glassrør og tilsett 8 ml 2: 1 vol / vol CHCl3: MeOH til hvert rør.
  5. Bestem radioaktiviteten og/eller lipidkonsentrasjonene ved hjelp av flytende scintillasjonstelling og/eller et triglyseridanalysesett (se materialtabell) etter Folch-ekstraksjon45.

4. Tynnsjiktskromatografi (TLC)

  1. Trekk ut de totale lipidene i luminal- og slimhinneisolatene via en modifisert Folch-ekstraksjon45.
  2. Tørk de ekstraherte lipidene i løsningsmidlet under en nitrogenfordamper og resuspender dem deretter i 2: 1 vol / vol CHCl3: MeOH før du legger dem på en TLC silikagelplate (se materialfortegnelse).
  3. Separer lipidene ved hjelp av et løsningsmiddelsystem av petroleter, etyleter og iseddik (25: 5: 1 vol / vol / vol). Bruk joddamp til visualisering av forskjellige lipider, inkludert standarder.
  4. Skrap flekkene på TLC-platen som tilsvarer monoglyserid/fosfolipid, diglyserider, fettsyrer, triglyserid og kolesterolester i individuelle scintillasjonshetteglass før tilsetning av 4 ml scintillasjonsvæske (se materialfortegnelse) for scintillasjonstelling.
  5. Uttrykk dataene som enten en prosent av den totale boluslipiddosen eller som en brøkdel av det totale lipidet som oppdages for hver prøve.

5. Isolering og karakterisering av kylomikron

  1. Overfør de kombinerte lymfeprøvene fra 6 timer post-lipid bolus (trinn 2,29) til ultrasentrifugerør, blandet med 0,9% NaCl (300-500 μL), og legg deretter forsiktig med et passende volum på 0,87% NaCl (300-500 μL).
    1. Ultrasentrifuge (se materialfortegnelse) prøvene ved 110 000 x g ved 4 °C i 16 timer. Samle toppfraksjonen som inneholder isolerte kylomikroner og overfør dem til et nytt mikrosentrifugerør.
  2. Bestem chylomicron triglyserid-, kolesterol- og apoB-konsentrasjoner ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Bestem triglyserid- og kolesterolkonsentrasjoner ved hjelp av et triglyserid- og kolesterolanalysesett (se materialtabell).
    2. Inkuber kort 2 μL av prøvene med 200 μL enzymreagens ved 37 °C i 5 minutter i en 96-brønnsplate. Les platen ved hjelp av en plateleser ved 500 nm for triglyserid og 600 nm for kolesterol.
      MERK: Standarder og emner ble brukt til beregning av konsentrasjoner. ApoB-konsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Mouse ApoB ELISA Kit (se materialfortegnelse).
  3. Bestem kylomikronpartikkelstørrelsen.
    1. Bruk ferske kylomikronprøver ved triglyseridkonsentrasjoner på rundt 40 mg / dL for TEM-avbildning. Plasser kort 5-10 μL av hver prøve på et TEM-rutenett og tørk.
    2. Undersøk rutenettet med et transmisjonselektronmikroskop og ta bilder. Mål lipoproteinpartikkelstørrelsene og analyser dem ved hjelp av ImageJ-programvare (se Materialfortegnelse).

Representative Results

Figur 2 viser triglyseridsekresjonen ved mesenterisk lymfe og gjennomsnittlig lymfestrømshastighet hos de siste n = 17 villtypemus (WT) som gjennomgikk endagsprosedyren med lymfefistel, beskrevet her. Som vist i figur 2A øker triglyseridkonsentrasjonen i lymfe som respons på en intraduodenal bolus på 300 μL SMOFLipid. Maksimal triglyseridkonsentrasjon nås ved ~2-3 timer etter bolus og avtar jevnt gjennom 6-timerstiden (umiddelbart før eutanasi). Parallelt med triglyseridsekresjonen øker lymfestrømningshastigheten fra tid 0 bolusinfusjon til forsøkets slutt (figur 2B).

Disse resultatene viser at kirurgisk implantasjon av både mesenterisk lymfekanal og intraduodenal kanyle har forekommet og er representativ for en positiv kontroll som annet lymfatisk innhold (hormoner, peptider, næringsstoffer) kan benchmarked til. Hvis det ikke er noen endring i triglyseridkonsentrasjonen i lymfe som respons på bolus intraduodenale lipider, signaliserer dette at operasjonen har forårsaket betydelig skade på tynntarmen slik at lipidabsorpsjonskapasiteten er fraværende, eller i tidligere ufenotypede genetiske modeller vil dette tyde på at musen har en defekt i lipidabsorpsjon som er fysiologisk meningsfylt.

Figure 1
Figur 1 Forslag til tidslinje for lymfefistelmusmodellen. T-4, T-3, T-2: Dobbel kanylering tar omtrent 2-4 timer, etterfulgt av plassering av musene i gjenopprettingskamre. T-1: Når musene er i gjenopprettingsperioden, mottar de en kontinuerlig duodenal infusjon av 5% glukose-0,9% saltvann. T0: Den kontinuerlige intraduodenale infusjonen byttes fra 5% glukose-0,9% saltvann til en infusjon av eksperimentelle næringsstoffer. T0-T6: Mus får kontinuerlig intraduodenal 5% glukose i saltvann eller alternativt kontinuerlige næringsstoffer. Lymfe samles hver time i denne perioden. Endepunkt: Mus avlives, og vev kan samles inn. Figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Mesenterisk lymfe triglyseridkonsentrasjon og strømningshastighet. Villtypemus ble utstyrt med en intraduodenal ernæringssonde og en mesenterisk lymfekanyle. Mus fikk en bolusinfusjon på 300 μL lipid. Lymfe ble samlet i 6 timer i timebaserte alikoter og holdt på is. (A) Lymfetriglyseridinnholdet ble bestemt ved en kjemisk analyse i hver timealikot av lymfe. (B) I løpet av de 6 timene etter bolusinfusjon plottes lymfestrømmen som gram lymfe som skilles ut per time. Poeng er midler ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lipid leveringsmetoder Anbefalinger/instruksjoner
Blandet lipidemulsjonsbolus En 0,3 ml dose av enten ( A ) Liposyn III 20% lipid injiserbar eller (B) SMOFlipid 20% lipid injiserbar emulsjon, USP, via intraduodenal infusjonsslange kan brukes. Disse emulgerte lipidene er nyttige fordi de ikke trenger å tilberedes på forhånd, er flytende ved romtemperatur, er sterile og fordi de inneholder en "lett fordøyelig" blanding av frie fettsyrer, triglyserider, fosfolipider og natriumtaurokolat. Dette er en god startinfusjon for mus som kan ha bukspyttkjertel- eller galdeinsuffisiens.
Triglyseridbolus 0,3 ml forsiktig oppvarmet olivenolje (eller renset triolein) som et nøytralt lipid som reflekterer en diett rik på umettet fett, lard (reflekterer en diett med høyt mettet fettinnhold) eller kokosnøttolje (reflekterer en diett med høyt triglyseridinnhold med middels kjede) kan alle gis ved intraduodenalt infusjonsrør eller oral gavage. Hvis det eksperimentelle triglyseridet er mettet, må det varmes opp for å være flytende ved romtemperatur.
Blandet måltid bolus 0,3 ml Sørg for at formuleringen inneholder 0,075 g fett (21,6 %), 0,5 g karbohydrat (64,0 %) og 0,1125 g protein (14,4 %) og reflekterer et fettfattig blandet måltid, kan administreres via intraduodenal infusjon.
Radiomerket lipidbolus 5,0 μCi 3 H-merket glyseroltrioleat og/eller 1,0 μCi 14C-kolesterol i 0,3ml olivenolje kan gis via intraduodenal infusjon. 14 C-kolesterol: Kolesterol-[4-14C] med spesifikk aktivitet på 55Ci / mmol og en konsentrasjon på 0,1 mCi / ml. 3 H-TG triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) med spesifikk aktivitet på 60Ci/mmol og konsentrasjon på 1mCi / ml
Kontinuerlig dose Infusjon av noen av de ovennevnte eksperimentelle næringsstoffformuleringene med en hastighet på 0,3 ml / t (i stedet for 0,3 ml total bolus), vil resultere i en jevn produksjon av triglyserid i lymfen. Dette skiller seg fra en bolusinfusjon, hvor triglyseridkonsentrasjonen i lymfe topper seg ved ~2–3 timer, og deretter går tilbake til baselinekonsentrasjoner ved ~6–8 timer.

Tabell 1: Tabell over lipidinfusjoner.

Discussion

Den opprinnelige 2-dagers lymfefistelprosedyren ble beskrevet av Bollman et al.25 og praktisert av laboratoriet til Patrick Tso de siste 45 årene 26,27. Protokollen som presenteres her er et kraftig tillegg til denne klassiske, gullstandardmetoden for å identifisere, kvantifisere og forstå tynntarmens unike chylous sekresjoner, samt in vivo-dynamikken i næringsopptak og metabolisme i kosten, tarmhormoner og tarmimmunitet.

Fordelene med denne modellen inkluderer (1) evnen til kontinuerlig å prøve mesenterisk lymfe gjennom fôrings- og postprandial perioden i stedet for statisk prøvetaking på et tidspunkt under enten absorpsjon, fordøyelse eller sekresjon; (2) måling av tarmhormoner og cytokiner direkte i deres fysiologiske rom i stedet for i blod, hvor de fortynnes og enzymatisk nedbrytes17,44; (3) evnen til å isolere, kvantifisere og karakterisere lipoproteinene som utskilles av tynntarmen etter inntak av et lipidmåltid og fraværet av endoteliale lipaser i mesenterisk lymfe, som bevarer chylomikrontriglyseridkonsentrasjoner og naturlig kylomikronstruktur46,47; (4) evnen til direkte å måle lymfestrømningshastighet, utgangen av triglyserid og kolesterol (eller andre duodenalinfiserte forbindelser), kylomikronsammensetning og tarmhormonkonsentrasjoner. Endelig tillater denne protokollen å samle relativt store mengder >50 μL lymfe hver time over en 6 timers periode. Etter hvert som væsken etterfylles med intraduodenal saltvann og glukoseinfusjon, er lymfefistelmodellen betydelig forbedret i forhold til andre lymfeprøvetakingsteknikker og resulterer i flytende i stedet for statiske bassenger av mesenterisk lymfe. Siden volum er en stor hindring for lipidomiske, proteomiske og metabolomiske tilnærminger, er dette en stor styrke.

1-dags muselymfefistelprotokollen beskrevet her har flere fordeler i forhold til den opprinnelige lymfefistelprotokollen, inkludert en reduksjon i totalt eksperimentelt dyretall fra tidligere beskrevne 2-dagers lymfefistelprotokoller26,27 på grunn av en høyere overlevelsesrate etter kirurgi; en reduksjon i den totale eksperimentelle tiden fra 2 dager til en enkelt dag; og til slutt en reduksjon i gjenopprettingsperioden for mus fra over natten (>18 timer), hvor gjennombruddssmerter eller dårlige postkirurgiske utfall kan oppstå, til en mer håndterbar ~ 6 timer etter operasjonsperioden.

Et trekk ved denne 1-dagersprotokollen er fokuset på humane hensyn og endepunkter. Disse må ha høyeste prioritet: (1) dyr må motta intraduodenale eller IV erstatningsvæsker; (2) de må holdes varme og så smertefrie som mulig (med postoperativ Buprenex og/eller karprofen, avhengig av eksperimentell design og behovet for å unngå antiinflammatoriske effekter); (3) blødning, risting, diaré eller tegn på nød er alle overbevisende grunner til et humant endepunkt. I henhold til strenge IACUC-retningslinjer er isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon et godt endepunkt. Kirurgisk overlevelse er ~ 70% for en enkelt dag (sammenlignet med ~ 40% for den opprinnelige 2-dagers operasjonen), men etterforskere bør ikke nøle med å avslutte eksperimentet ved et tegn på nød. Dette bør tas i betraktning ved planlegging av dyrenummer.

Når det gjelder feilsøking av denne teknikken, er vellykket plassering av lymfekanylen den største flaskehalsen i denne kirurgiske prosedyren. Mens du praktiserer operasjonen, hjelper det å gavage musen med 0,3 ml olivenolje ca 2 timer før operasjonen. Dette vil føre til sekresjon av kylomikroner i den mesenteriske lymfekanalen, slik at den virker "melkeaktig" og mer synlig. Methylenblå kan også brukes, men er ofte mindre åpenbar enn melkeaktig lymfekanal. Hvis den mesenteriske lymfen etter plassering av lymfekanylen og dens plassering med lim strømmer vellykket gjennom kanylen inn i et oppsamlingsbeholder, kan man fortsette med plassering av et duodenalt infusjonsrør. Av og til kan lymfene ikke strømme kontinuerlig, men kan begynne å strømme igjen når dyret er plassert på det roterende bordet. Kritisk, se opp for blodpropper i lymfeslangen. Disse bør masseres ut av rørene for å forhindre tilbakestrømningstrykk på lymfekanalen.

I tillegg til triglyseridsekresjon og lymfestrømningshastighet, kan denne teknikken brukes til å bestemme følgende lipidabsorpsjonskinetikk og kylomikronegenskaper:

Chylomikron sekresjon45,48,49
Umiddelbart etter et fettholdig måltid er det en forbigående økning i sirkulerende plasmatriglyserider. Siden triglyserider er iboende hydrofobe, må de først emulgeres for å være løselige i blod50. Små intestinale enterocytter utfører denne rollen og pakker dietttriglyserid i kylomikron-emulsjonspartikler51. Chylomier inneholder kolesterol og dietttriglyserid i kjernen, omgitt av fosfolipider og apolipoproteiner, inkludert apoB-48, apoA-I, apoA-IV og apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 er det essensielle strukturelle proteinet, og de andre apolipoproteinene har forskjellige funksjoner som kreves for kylomikronmetabolisme og clearance fra blodet. For å bestemme nøkkelegenskapene til kylomikroner, inkludert triglyserid- og apolipoproteininnhold, bør 1-dags lymfefistelteknikken vist her brukes. Kylomikronsekresjonshastigheten er prosentandelen av infundert 3H-triglyserid som skilles ut i lymfene og måles ved scintillasjon ved å telle lymfeprøver hver time. Dette kan kombineres med detaljert kylomikronkarakterisering 48,49,56,57,58. Lymfeprøver hver time kan kombineres eller oppbevares separat. Lymfe overføres til ultrasentrifugerør, blandet med 0,9% NaCl, og deretter forsiktig overlagt med 300-500 μL på 0,87% NaCl. Prøvene ultrasentrifugeres deretter ved 110 000 x g ved 4 °C i 16 timer. De øverste fraksjonene som inneholder isolerte kylomikroner samles og testes for triglyseridkonsentrasjoner ved bruk av triglyseridanalysesettet. Kort fortalt inkuberes 2 μL av kylomikron (1:10 fortynning) med 200 μL enzymreagens ved romtemperatur i 10 minutter i en 96-brønnsplate. Platen leses av en plateleser ved 500 nm, og standardene og emnene brukes til beregning av triglyseridkonsentrasjoner. Chylomikronstørrelsen kan da bestemmes ved negativ farging og transmisjonselektronmikroskopi (TEM)14,29. Triglyserid og kolesterol kan kvantifiseres ved kjemisk analyse og apolipoproteininnhold (apoB-48, A-I, C-II, C-III) av ELISA-sett eller Western blot.

Bestemmelse av det primære stedet for lipidabsorpsjon 48,59
Ved å isolere luminal- og epitelcellerommene i tolvfingertarmen, jejunum og ileum ved 6 timer etter infusjon av 3 H-triglyserid eller et radiomerket blandet måltid, ekstraheres innholdet for å bestemme hvor mye av de 3H-triglyseridene som absorberes over epitelcellemembranen (normalt) eller beholdes i lumen (unormalt) langs tynntarmens lengde48 . Disse studiene er spesielt virkningsfulle hvis det er potensielle forskjeller i GI-motilitet 60,61,62, hvis det er en hypotese angående gallesyrer (svært aktive gjennom lipidabsorpsjon og selv reabsorbert i ileum)63,64,65,66, eller hvis det er bekymring for at næringsstoffer blir absorbert på feil anatomisk sted (ileum eller til og med kolon)67 ,68,69,70.

Identifisere mekanismer for 3H-triglyserider som trafikkerer til absorberende epitelceller48
Dette utføres ved å beregne prosentandelen av 3 H-triglyserid hydrolysert til 3 H-fri fettsyre i tarmlumen, absorbert i slimhinnen og re-esterifisert til intracellulært 3H-triglyserid før sekresjon som kylomikroner. Dette er en kraftig markør for absorpsjons- / sekresjonsdefekter, siden den kan spores for å vise bevegelsen av dietttriglyserid i nedbrytningsproduktene og påfølgende emballasje i kylomikroner. mRNA-ekspresjon av fettsyreabsorpsjonsmaskineriet (CD36, FABP, ACSL), re-esterifiseringsvei (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) og apolipoproteiner (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kan kvantifiseres videre ved RT-PCR.

Fremtidige anvendelser av denne teknikken er bare begrenset av interesse for tarmorgankrysstale, metabolisme, immunitet, næringsopptak, miljøforurensninger eller annen sykdom med en rolle i GI-systemet. Det er sannsynlig at mange overbevisende eksperimenter og hypoteser har blitt stoppet på grunn av vanskeligheten med å få tilgang til det kritiske mesenteriske lymfesystemet, og målet med denne visualiserte protokollen er å gjøre denne teknikken lettere tilgjengelig. Isolering av kylomikroner og mesenterisk lymfe der de i utgangspunktet bor, er en kritisk del av å forstå helkroppens metabolisme; 1-dags muselymfefistelmodellen er en kraftig fysiologisk modell for å studere disse hendelsene.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlige til Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, til ABK), Rainin Foundation (Synergy Award, til PI GJ Randolph og Co-I ABK), og National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 til ABK) for deres støtte til disse studiene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC 0409-4888-06
1.7 mL Eppendorf tubes Fisher Scientific, Waltham, MA, US 7200184
14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ARC 0857
18 G needle Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 305199
2 Dumont micro-dissecting forceps Fine Science Tools, Foster City, CA, US 11251-35
2 Forceps ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5130
3H-TAG:  Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL) American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, US ART0199
3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
50% Dextrode Injection, USP 25grams/50 mL  sterile Hospira, Lake Forest, IL, US NDC-0409-6648-16
Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK Fisher Scientific, Waltham, MA, US 11-101-0007
BD CareFusion ChloraPrep Swabstick Fisher Scientific, Waltham, MA, US 14-910-501
Betadine surgical scrub Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US 1201
Bevel-cut cannula Braintree Scientific.,  Braintree , MA, US MRE025
Buprenorphine HCl Injection Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex) HenrySchein, Warrendale, PA, US 1278184
C57BL6/J male mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine
ChloraPrep Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, US 260100
Cholesterol Assay Kit FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, US 99902601
Cholesterol-[4-14C] American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis MO 63146
Clear plexiglass box L43cm X W26 X H 21 with temperature-controlled heating pad and humidification our own design and modifications
commercially available  amphibian/reptile heating pad ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China XHC-F035D
Cotton tip applicators Fisher Scientific, Waltham, MA, US 22363156
Duodenal infusion tube - canuala Braintree Scientific, Braintree , MA, US MRE037
Ensure Abbott Nutrition, Columbus, OH
Heating pad surgical platform with circulating warm water pump combination Patterson Scientific, Waukesha, WI, US Gaymar T/Pump Classic
Hetarin Sodium Injection, USP 1,000 units/mL sterile Mylan, Morgantown, WV, US NDC-67457-384-31
Image J Software National Institute of Health, Bethesda, Maryland,
Iris scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Isoflurane Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US NDC 66794-017-25
Isoflurane induction apparatus and Anesthesia Apparatus Patterson Scientific, Waukesha, WI, US mouse induction chamber
Krazy glue Elmer's products Inc., Columbus, OH, US KG484
Liposyn III 20% lipid injectable Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA
LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter Beckman Coulter, Brea, CA
Micro-dissecting Spring Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5602
Mouse apoB ELISA Kit ABCAM Inc., Waltham, MA, US ab230932-1
Needle Holder Fine Science Tools, Foster City, CA, US 12002-12
Retractors Kent Scientific Co., Torrington, CT, US SURGI-5001
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc., Kalamazoo MI, US 4019449
Rotating table Barnstead Thermolyne Labquake, Zürich, Switzerland Barnstead Thermolyne
SMOFlipid 20% lipid injectable emulsion, USP Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US NDC-63323-820-01
Snuggle Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'Île-Perrot, QC J7V 7M4, Canada MS 02.5PM
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US RS-5912SC
Suture (5-0 silk with needle) DemeTECH, Miami Lakes, FL, US DT-719
Transmission Electron Microscope (JEOL 1400-FLASH 120KV ) JEOL, Peabody, MA
Triglyceride Assay Kit Randox Laboratories, Crumlin, United Kingdom TR210
ULTIMA GOLD XR Scintillation Fluid Perkin Elmer, Hebron, KY, US 6013119
Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497 SORVALL RC M120 GX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Natale, G., Bocci, G., Ribatti, D. Scholars and Scientists in the History of the Lymphatic System. Journal of Anatomy. 231 (3), 417-429 (2017).
  2. Loukas, M., et al. The lymphatic system: A historical perspective. Clinical Anatomy. 24 (7), 807-816 (2011).
  3. Suy, R., Thomis, S., Fourneau, I. The discovery of the lymphatic system in the seventeenth century. Part II: The discovery of Chyle vessels. Acta Chirurgica Belgica. 116 (5), 325-331 (2016).
  4. Azzali, G. Historical notes on the lymphatic vascular system. Acta Bio-medica de L'Ateneo Parmense. 61 (3-4), 113-125 (1990).
  5. Irschick, R., Siemon, C., Brenner, E. The history of anatomical research of lymphatics - From the ancient times to the end of the European Renaissance. Annals of Anatomy. 223, 49-69 (2019).
  6. Swartz, M. A. The physiology of the lymphatic system. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 3-20 (2001).
  7. Deitch, E. A. Gut lymph and lymphatics: A source of factors leading to organ injury and dysfunction. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 103-111 (2010).
  8. Tso, P., Gollamudi, S. R. Pluronic L-81: A potent inhibitor of the transport of intestinal chylomicrons. American Journal of Physiology. 247, 32-36 (1984).
  9. Tso, P., Karlstad, M. D., Bistrian, B. R., DeMichele, S. J. Intestinal digestion, absorption, and transport of structured triglycerides and cholesterol in rats. American Journal of Physiology. 268, 568-577 (1995).
  10. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. American Journal of Physiology. 261, 530-538 (1991).
  11. Bogunovic, M., et al. Origin of the lamina propria dendritic cell network. Immunity. 31 (3), 513-525 (2009).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Science Translational Medicine. 6 (237), (2014).
  13. Ji, Y., Sakata, Y., Tso, P. Nutrient-induced inflammation in the intestine. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (4), 315-321 (2011).
  14. Ji, Y., Sakata, Y., Yang, Q., Tso, P. Intestinal mucosal mast cells is activated by fat absorption. Gastroenterology. 140 (5), (2011).
  15. Wang, F., et al. Chronic high-fat feeding increases mixed meal-induced incretin secretion in Sprague-Dawley rats. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (10), 807-815 (2015).
  16. Kindel, T. L., Yoder, S. M., D'Alessio, D. A., Tso, P. The effect of duodenal-jejunal bypass on glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in Wistar rats. Obesity Surgery. 20 (6), 768-775 (2010).
  17. Kohan, A. B., Yoder, S. M., Tso, P. Using the lymphatics to study nutrient absorption and the secretion of gastrointestinal hormones. Physiology & Behavior. 105 (1), 82-88 (2011).
  18. Yoder, S. M., Yang, Q., Kindel, T. L., Tso, P. Stimulation of incretin secretion by dietary lipid: Is it dose dependent. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (2), 299-305 (2009).
  19. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PLoS One. 4 (12), 8442 (2009).
  20. Vors, C., et al. Postprandial endotoxemia linked with chylomicrons and lipopolysaccharides handling in obese versus lean men: A lipid dose-effect trial. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (9), 3427-3435 (2015).
  21. Ghoshal, S., Witta, J., Zhong, J., de Villiers, W., Eckhardt, E. Chylomicrons promote intestinal absorption of lipopolysaccharides. Journal of Lipid Research. 50 (1), 90-97 (2009).
  22. Jandacek, R. J., Rider, T., Keller, E. R., Tso, P. The effect of olestra on the absorption, excretion and storage of 2,2',5,5' tetrachlorobiphenyl; 3,3',4,4' tetrachlorobiphenyl; and perfluorooctanoic acid. Environment International. 36 (8), 880-883 (2010).
  23. Jandacek, R. J., Tso, P. Organochlorine compounds are absorbed via lymph and portal circulation. The FASEB Journal. 22, (2008).
  24. Utermann, G., Beisiegel, U. Apolipoprotein A-IV: A protein occurring in human mesenteric lymph chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantification. European Journal of Biochemistry. 99 (2), 333-344 (1979).
  25. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  26. Tso, P., Balint, J. A., Rodgers, J. B. Effect of hydrophobic surfactant (pluronic L-81) on lymphatic lipid transport in the rat. American Journal of Physiology. 239 (5), 348-353 (1980).
  27. Liu, M., et al. Sexual dimorphism in intestinal absorption and lymphatic transport of dietary lipids. Journal of Physiology. 599 (22), 5015-5030 (2021).
  28. Manolas, K. J., et al. Lymph, pancreatic and gastrointestinal hormones in response to feeding in the conscious pig. European Surgical Research. 17 (5), 324-332 (1985).
  29. Lascelles, A. K., Morris, B. Surgical techniques for the collection of lymph from unanaesthetized sheep. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 46, 199-205 (1961).
  30. Jensen, L. T., Olesen, H. P., Risteli, J., Lorenzen, I. External thoracic duct-venous shunt in conscious pigs for long term studies of connective tissue metabolites in lymph. Laboratory Animal Science. 40 (6), 620-624 (1990).
  31. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  32. Yasunaga, K., Saito, S., Zhang, Y. -L., Hernandez-Ono, A., Ginsberg, H. N. Effects of triacylglycerol and diacylglycerol oils on blood clearance, tissue uptake, and hepatic apolipoprotein B secretion in mice. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1108-1121 (2007).
  33. Curtin, A., et al. Elevated triglyceride-rich lipoproteins in diabetes. A study of apolipoprotein B-48. Acta Diabetologica. 33 (3), 205-210 (1996).
  34. Gordts, P. L. S. M., et al. ApoC-III inhibits clearance of triglyceride-rich lipoproteins through LDL family receptors. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2855-2866 (2016).
  35. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78 (5), 1287-1295 (1986).
  36. Ormai, S., Palkovits, M. Size distribution of lymphocytes in the thoracic duct lymph in rat after lymphocyte mobilization induced by polymethacrylic acid. Blut Zeitschrift für die Gesamte Blutforschung. 24 (3), 161-165 (1972).
  37. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19565-19572 (1999).
  38. Nollevaux, G., et al. Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology. 7 (1), 20 (2006).
  39. Li, D., Dong, H., Kohan, A. B. The Isolation, Culture, and Propagation of Murine Intestinal Enteroids for the Study of Dietary Lipid Metabolism. Organoids. Methods in Molecular Biology. 1576, Humana. New York, NY. 195-204 (2019).
  40. Jattan, J. J., et al. Using murine-derived primary intestinal enteroids for studies of dietary triglyceride absorption and lipoprotein synthesis, and to determine the role of intestine-specific ApoC-III in the intestine. Journal of Lipid Research. 58 (5), 853-865 (2017).
  41. Haring, E., et al. Bile acids regulate intestinal antigen presentation and reduce graft-versus-host disease without impairing the graft-versus-leukemia effect. Haematologica. 106 (8), 2131-2146 (2021).
  42. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: Reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 269-289 (2015).
  43. Deacon, C. F. Circulation and degradation of GIP and GLP-1. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 761-765 (2004).
  44. Dedousis, N., Teng, L., Kanshana, J. S., Kohan, A. B. A single-day mouse mesenteric lymph surgery in mice: an updated approach to study dietary lipid absorption, chylomicron secretion, and lymphocyte dynamics. J Lipid Res. 63 (11), 100284 (2022).
  45. Li, D., et al. Intestinal basolateral lipid substrate transport is linked to chylomicron secretion and is regulated by ApoC-III. Journal of Lipid Research. 60 (9), 1503-1515 (2019).
  46. Glatzle, J., et al. Chylomicron components mediate intestinal lipid-induced inhibition of gastric motor function. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 282 (1), 86-91 (2002).
  47. Huang, J., Sloop, C. H., Roheim, P. S., Wong, L. Lipoprotein lipase and hepatic triacylglycerol lipase activities in peripheral and skeletal muscle lymph. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 10 (5), 720-726 (1990).
  48. Wang, F., et al. Overexpression of apolipoprotein C-III decreases secretion of dietary triglyceride into lymph. Physiological Reports. 2 (3), 00247 (2014).
  49. Kohan, A. B., et al. Apolipoprotein A-IV regulates chylomicron metabolism-Mechanism and function. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (6), 628-636 (2012).
  50. Hayashi, H., et al. Fat feeding increases size, but not number, of chylomicrons produced by small intestine. American Journal of Physiology. 259 (5), 709-719 (1990).
  51. Tso, P., Balint, J. A. Formation and transport of chylomicrons by enterocytes to the lymphatics. American Journal of Physiology. 250 (6), 715-726 (1986).
  52. Bhattacharya, S., Redgrave, T. G. The content of apolipoprotein B in chylomicron particles. Journal of Lipid Research. 22 (5), 820-828 (1981).
  53. Björkegren, J., Karpe, F., Milne, R. W., Hamsten, A. Differences in apolipoprotein and lipid composition between human chylomicron remnants and very low density lipoproteins isolated from fasting and postprandial plasma. Journal of Lipid Research. 39 (7), 1412-1420 (1998).
  54. Martins, I. J., Sainsbury, A. J., Mamo, J. C., Redgrave, T. G. Lipid and apolipoprotein B48 transport in mesenteric lymph and the effect of hyperphagia on the clearance of chylomicron-like emulsions in insulin-deficient rats. Diabetologia. 37 (3), 238-246 (1994).
  55. Mar, R., et al. Association of the APOLIPOPROTEIN A1/C3/A4/A5 gene cluster with triglyceride levels and LDL particle size in familial combined hyperlipidemia. Circulation Research. 94 (7), 993-999 (2004).
  56. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 086005 (2012).
  57. Nauli, A. M., et al. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiological Reports. 2 (6), 192-196 (2014).
  58. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  59. Kohan, A. B., et al. Is apolipoprotein A-IV rate limiting in the intestinal transport and absorption of triglyceride. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (12), 1128-1135 (2013).
  60. De Lisle, R. C. Altered transit and bacterial overgrowth in the cystic fibrosis mouse small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (1), 104-111 (2007).
  61. Debas, H. T., Farooq, O., Grossman, M. I. Inhibition of gastric emptying is a physiological action of cholecystokinin. Gastroenterology. 68 (5), 1211-1217 (1975).
  62. Spiller, R. C., et al. Further characterisation of the 'ileal brake' reflex in man--Effect of ileal infusion of partial digests of fat, protein, and starch on jejunal motility and release of neurotensin, enteroglucagon, and peptide YY. Gut. 29 (8), 1042-1051 (1988).
  63. Battle, M. A., et al. GATA4 is essential for jejunal function in mice. Gastroenterology. 135 (5), 1676-1686 (2008).
  64. Morgan, R. G., Borgström, B. The mechanism of fat absorption in the bile fistula rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 228-243 (1969).
  65. Davidson, N. O., Kollmer, M. E., Glickman, R. M. Apolipoprotein B synthesis in rat small intestine: Regulation by dietary triglyceride and biliary lipid. Journal of Lipid Research. 27 (1), 30-39 (1986).
  66. Bouchi, R., et al. FOXO1 inhibition yields functional insulin-producing cells in human gut organoid cultures. Nature Communications. 5, 4242 (2014).
  67. Bijvelds, M. J. C., et al. Fat absorption in cystic fibrosis mice is impeded by defective lipolysis and post-lipolytic events. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 288 (4), 646-653 (2005).
  68. Struyvenberg, M. R., Martin, C. R., Freedman, S. D. Practical guide to exocrine pancreatic insufficiency - Breaking the myths. BMC Medicine. 15 (1), 29 (2017).
  69. Tickell, K. D., Atlas, H. E., Walson, J. L. Environmental enteric dysfunction: A review of potential mechanisms, consequences and management strategies. BMC Medicine. 17 (1), 181 (2019).
  70. Lo, C. M., et al. Cholecystokinin knockout mice are resistant to high-fat diet-induced obesity. Gastroenterology. 138 (5), 1997-2005 (2010).

Tags

Biologi utgave 189
Isolering av flytende mesenterisk lymfe hos mus for å kvantifisere <em>in vivo</em> kinetikk av lipidabsorpsjon i kosten og kylomikronsekresjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. … More

Dedousis, N. L., Teng, L., Kohan, A. B. The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion. J. Vis. Exp. (189), e64338, doi:10.3791/64338 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter